CC BY
53
Є
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Изучение противовирусной активности Ингавирина® в отношении возбудителя гриппа A (H3N2) in vitro
С. Я. ЛОГИНОВА1, С. В. БОРИСЕВИЧ1, И. В. СЕМЕНОВА1, В. А. МАКСИМОВ1, В. П. БОНДАРЕВ1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2
' Филиал федерального государственного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации» — «Вирусологический центр», Сергиев Посад;
2 Открытое акционерное общество «Валента Фармацевтика», Москва
Investigation of in vitro Activity of Ingavirin®
Against Influenza Virus A (H3N2)
S. YA. LOGINOVA, S. V. BORISEVICH, I. V. SEMENOVA, V. A. MAKSIMOV, V. P. BONDAREV, V. E. NEBOLSIN
Virological Centre of the Central Research Institute No. 48 of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad Valenta Pharmacevtica, Moscow
Проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина® и этиотропных химиопрепаратов (Арбидол® и Ремантадин®) в отношении вируса гриппа А (Н3Ш) в чувствительных постоянных культурах клеток свидетельствует о том, что исследуемый препарат в изученных концентрациях эффективно подавляет цитопатическую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению).
Ключевые слова: грипп А, Ингавирии®, противовирусная эффективность, культура клеток.
The comparative analysis of the efficacy of Ingavirin® and etiotropic chemotherapeutics, such as Arbidol® and Remantadin®, against the influenza virus A (H3N2) performed with the use of susceptible permanent cell cultures showed that in the used concentrations Ingavirin® was efficient in inhibition of the virus cytopathic activity , formation of the specific hemagglutinin and repro- ^
duction of the virus (by the accumulation). j
Key words: influenza virus A, Ingavirin®, antiviral efficacy, cell culture.
Одним из первых этапов доклинического исследования новых лекарственный противовирусныгх препаратов является оценка их активности в чувствительных культурах клеток в отношении вируса гриппа. В связи с тем, что различные типы и линии клеток обладают разной чувствительностью к воздействию противовирусных препаратов, оценку их эффективности нередко проводят с использованием нескольких типов и линий клеток [1]. Использование нескольких культур клеток позволяет более достоверно осуществлять оценку активности существующих и новык лекарственных соединений.
Целью наших исследований являлось изучение эффективности нового отечественного химиопрепарата Ингавирин® в отношении экспериментальной гриппозной инфекции in vitro.
Материал и методы
Вирус. В работе использовали адаптированный к лёгким белыгх мышей вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), по© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, ул. Нагатинская, д. 3а. ГНЦА
лученный из ГУ «НИИ вирусологии» им. Д. И. Ивановского РАМН. Штамм A/Aichi/2/68 вируса гриппа, подтип H3N2, является прототипным по отношению к основным подтипам, циркулирующим в настоящее время (H3N2 и H1N1). Он широко используется отечественными и зарубежными специалистами при оценке защитной эффективности лекарственный: средств (химиопрепаратов, интерферона и его индукторов) и медицинских иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов).
Штамм хранится в Специализированной коллекции Филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России — ВЦ».
Культуры клеток. Использованы постоянные культуры клеток почек зелёный; мартышек — GMK-AH-ЦД), почек свиньи — СПЭВ и почек собаки — MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 7,5 и 2% сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Исследуемые препараты. Ингавирин® — производства ОАО «Валента Фарм», Россия; Арбидол® — производства ЗАО «Мастерлек», Россия; Ремантадин® — производства ООО «РОЗФАРМ», Россия. В исследованиях использовались коммерческие препараты с гарантированным производителем сроком годности.
Противовирусную эффективность препаратов in vitro оценивали по следующим показателям:
— снижение уровня накопления вируса под воздействием препарата (A, lg);
e
Таблица 1. Сравнительная эффективность Ингавирина® по подавлению цитопатической активности вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (^N2), в постоянных культурах клеток
Препарат Концентрация препарата, мкг/мл Культура клеток Коэффициент подавления ЦПД, % (Хср.+0Хср.)
Ингавирин® 200 GMK-AH-ЦД) 66,7+3,3
100 50,0+0,0
Арбидол® 25,0 33,3+3,3
Ремантадин® 50,0 80,0+5,7
Ингавирин® 200 MDCK 64,0+1,3
100 58,0+3,3
Арбидол® 25,0 40,0+3,1
Ремантадин® 50,0 86,0+2,4
Ингавирин® 200 СПЭВ 70,0+0,0
100 60,0+5,8
Арбидол® 25,0 36,7+3,3
Ремантадин® 50,0 83,3+3,3
Примечание. Здесь и в табл. 2: Количество опытов при изучении эффективности ингавирина и арбидола в культуре клеток MDCK составило 27, а в культурах клеток СПЭВ и GMK-AH-КД) — по 3 соответственно. На каждое разведение использовалось по 10 пробирок. Здесь и в табл. 2 и 3 препараты вносили через 2 часа после инфицирования. Здесь и в табл. 2 и 3 инфицирующая доза составляла 0,01 ЦПД/клетку.
— коэффициент ингибирования (Ки), %;
— подавление цитотоксической активности вируса, %. Уменьшение уровня накопления вируса под влиянием
препарата (А, ^) определяли по формуле:
А = Ак- Ао, (1);
где Ак — уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (^ ЦПД50/МЛ); Ад — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (^ ЦПД50/мл).
Коэффициент ингибирования (Ки, %) рассчитывали по формуле:
Ku (Ако]
- Аоп)/Аконтр X 100% (2);
1контр ' уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата, (ЦПД5о/мл); Адп — уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (ЦПД5о/мл).
Оценка противовирусной эффективности используемыгх лекарственный; препаратов осуществлена в соответствии с требованиями Фармакологического государственного комитета РФ [1]. Статистическую обработку экспериментальным данныгх проводили по Стьюденту [2]
Результаты и обсуждение
Исследования препаратов проводили по нескольким направлениям: изучение подавления цитотоксичности вируса, формирования специфичного гемагглютинина и репродукции вируса в монослое культуры клеток.
Результаты оценки токсичности Ингавирина® для постоянных культур клеток ОМК-ЛИ-1(Д), СПЭВ и МБСК свидетельствуют, что в концентрациях от 20 до 1000 мкг/мл препарат не вызывает визуально наблюдаемых изменений во всех использованных культурах клеток [3].
В работе использовали максимально эффективные дозы Ремантадина® и Арбидола® (1/2 от максимально переносимой концентрации),
составляющие 50 и 25 мкг/мл соответственно. Более высокие их концентрации токсичны для исследуемых культур клеток, а более низкие менее эффективно ингибируют репродукцию вируса гриппа [3]. В то же время Ингавирин® использовали в концентрации 200 мкг/мл, составляющей 1/5 от максимально переносимой концентрации.
При изучении влияния препаратов на цито-токсическую активность вируса в культурах клеток МБСК, ОМК-ЛИ-1(Д) и СПЭВ (табл. 1) было установлено, что Ингавирин® в концентрации 200 мкг/мл подавляет способность вируса гриппа, штамм Л/Л1еЫ/2/68 (Н3Ш), вызывать цитопатический эффект в монослое культур клеток (через 72 ч после инфицирования) на 64—70%. Изучение влияния Ингавирина® на динамику (через 12, 24, 48, 72 ч после инфицирования) репродукции вируса в культурах клеток свидетельствует о том, что в первые двое суток после инфицирования препарат полностью ингибирует цитопатическую активность возбудителя и формирование специфического гемагглютинина.
Наименее эффективно подавляет цитотокси-ческую активность вируса Арбидол®, коэффициент ингибирования — 33—40%.
Результаты исследования по выявлению специфического гемагглютинина в поддерживающей среде культур клеток ОМК-ЛН-1(Д), МБСК и СПЭВ (табл. 2) в присутствии лекарственных препаратов свидетельствуют о том, что Ингавирин® подавляет формирование гемагглютинина (через 72 ч после инфицирования) соответственно на 87,5, 85,0 и 87,5%; Ремантадин® — на 97,9, 96,9 и 96,7%; Арбидол® — на 33,3, 50,0 и 58,3% соответственно.
Исследования по изучению подавления репродукции вируса в культурах клеток МБСК и
О
е
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2. Сравнительная эффективность Ингавирина® по подавлению образования специфического гемагглютинина вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в постоянных культурах клеток
Пpeпapaт Kощeнтpaция п|)єп;і|);іт;і, мкг/мл ^AK^pa клеток Kоэффициeнт подавления TA, % (Xcp.+ffxcp.)
Ингавирин® 200,0 GMK-AH-ЦД) 87,5+0,0
100,0 75,0+0,0
ApG^n^® 25,0 33,3+16,7
Ремантадин® 50,0 97,9+2,1
Ингавирин® 200,0 MDCK 85,0+1,3
100,0 80,0+1,1
ApG^n^® 25,0 50,0+0,0
Ремантадин® 50,0 96,9+0,0
Ингавирин® 200,0 СТЭВ 87,5+0,0
100,0 75,0+0,0
ApG^n^® 25,0 58,3+8,3
Ремантадин® 50,0 96,7+0,0
Примечание. В реакции гемагглютинации использовали эритроциты морской свинки.
Таблица S. Сравнительная эффективность Ингавирина® в отношении вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), по подавлению репродукции вируса в постоянных культурах клеток (n=3)
Пpeпapaт ^н^трация п|)єп;і|);іт;і, мкг/мл клеток Уpовeнь подавления накопления виpуca, А, lg (Xcp.+ffxcp.) Kоэффициeнт имгиби|)ов;іііия, % (Xcp.+ffxcp.)
Ингавирин® 200 GMK-AH-ЦД) 2,3+0,1 99,1+0,1
100 1,4+0,2 92,2+0,2
ApG^n^® 25 1,5+0,1 92,5+0,2
Ремантадин® 50,0 4,8+0,1 99,99+0,1
Ингавирин® 200 MDCK 2,2+0,1 99,4+0,1
100 1,4+0,1 96,0+0,1
ApG^n^® 25 1,8+0,1 98,4+0,1
Ремантадин® 50,0 4,9+0,1 99,99+0,2
Примечание. Инфекционный титр вируса определяли титрованием на 9-суточных куриных эмбрионах (ЭИД50/мл).
GMK-AH-ЦД) исследуемыми препаратами выявили, что препарат Ингавирин® эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), в культурах клеток через 72 ч после инфицирования. Референс-препарат Ремантадин® также эффективно подавляет репродукцию вируса in vitro, в отличие от препарата Арбидол® (табл. 3). Учитывая результаты изучения цитотоксичности Ингавирина® и противовирусной эффективности можно сделать вывод о том, что величина ХТИ (химиотерапевтический индекс) для этого препарата более 10.
Исторически Ремантадин® является эталонным препаратом, эффективным в отношении вируса гриппа А, применяющийся для сравнительной оценки противовирусных средств in vitro и in vivo на модельных штаммах вируса гриппа, чувствительных к нему [4, 5]. Однако проблема быстрого появления резистентных штаммов к Ремантадину (в США в сезон 2005—2006 г. цир-
кулировало более 90% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (Н3Ш), а в Российской Федерации в сезон 2007—2008 г. — до 77% резистентных штаммов в популяции вируса гриппа А (Н3Ш)) на фоне проводимого лечения гриппозной инфекции определила запрет на применение препаратов адамантанового ряда в ряде стран мира на протяжении последних трёх эпидемических сезонов [6].
Таким образом, проведённый сравнительный анализ эффективности Ингавирина® в отношении вируса гриппа А (Н3М2) в чувствительных постоянных культурах клеток в сравнении с референс-препаратами (Ремантадин® и Арбидол®), свидетельствует о том, что Ингавирин® эффективно подавляет цитопати-ческую активность вируса, формирование специфического гемагглютинина и репродукцию вируса (по накоплению) и может быть рекомендован в качестве средства выбора противовирусной терапии при гриппе.
е
ЛИТЕРАТУРА
1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2005.
2. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: 1990.
3. Логинова С. Я., Борисевич С. В., Максимов В. А., Бондарев В. П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 3—4: 11—14.
4. Saelens X., Vanlandschoot P., Martinet W. et al. Protection of mice against a lethal influenza virus challenge after immunization with yeast-
derived secreted influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem 1999; 260: 1: 166—175.
Yingsakmongkon S., Miyamoto D., Sriwilaijaroen N. et al. In vitro inhibition of human influenza A virus infection by fruit-juice concentrate of Japanese plum (Prunus mume SIEB. et ZUCC). Biol Pharm Bull 2008; 31: 3: 511—515.
Бурцева E. И., Шевченко E. С., Белякова H. В. и др. Мониторинг чувствительности выделенных в России эпидемических штаммов вирусов гриппа к этиотропным химиопрепаратам. Вопр. вирусол 2009; 5: 25—28.
-Q-
