CC BY
14
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Изучение продолжительного влияния синтетических углеродных нанотрубок на уровень цитохрома Р-450 и серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка в печени у мышей
С.Г.Абдуллаева, А.А.Мехтиев
Центр исследований и развития в области высоких технологий Министерства
транспорта, и высоких технологий Азербайджана; Институт физиологии им. А.И.Караева НАН Азербайджана, г. Баку
В последние годы отмечается очень быстрый рост нанотехнологий, что способствует широкому внедрению синтетических углеродных нанотрубок (УНТ) в различные отрасли медицины, промышленности и сельского хозяйства. УНТ находят применение в лечении злокачественных опухолей и в доставке лекарственных препаратов к тканям [1]. Результаты исследований ряда исследовательских групп из разных научных центров продемонстрировали возможность использования УНТ для регенерации и пластики костной ткани [2,3]. Указанные направления исследования, связанные с необходимостью
применения УНТ, поднимают вопрос об их токсичности в случае их имплантирования и нахождения в организме животных и человека в течение продолжительного времени. Некоторые авторы указывают на аллергические иммунные ответы мышей и крыс под влиянием однослойных и многослойных УНТ [4,5]. Некоторые исследователи анализировали влияние УНТ на рождаемость и наследственность у млекопитающих [4,6]. Вплоть до настоящего времени исследования токсичности УНТ, в основном, ограничивались изучением влияния их кратковременных (3-5 ч) экспозиций [7], которые не позволяют судить
о степени их токсичности на протяжении продолжительного периода времени.
В настоящее время существует целый ряд биомаркеров, дающих возможность оценить влияние неблагоприятных факторов на организм животных и человека. К таким биомаркерам относится, к примеру, цитохром Р-450, уровень которого в тканях подвержен заметным изменениям под влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды различной природы [8, 9]. В ранее проведенных нами исследованиях было показано, что серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок (СМАБ), находящийся в прямой зависимости от уровня серотонина [10], является биомаркером адаптации к различным факторам окружающей среды, в том числе к неблагоприятным: полиароматическим углеводородам (ПАУ), тяжёлым металлам, фенолу [8, 11]. Кроме того, его введение в организм животных снижало уровень мутаций, вызванных ПАУ и тяжёлыми металлами, на 50% относительно животных, содержавшихся в аналогичных неблагоприятных условиях загрязнения [12]. Приведенные факты указывают на то, что изменение уровня СМАБ не носит исключительно сопутствующий характер, но лежит в основе влияния неблагоприятных факторов на организм. Таким образом, принимая во внимание указанные данные, можно сделать заключение об адекватности использования измерения уровня СМАБ в тканях в качестве биомаркера для выявления эффектов неблагоприятных факторов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Синтез использованных в данном исследовании УНТ был осуществлён с помощью метода катализа на фиксированной основе СУВ в Институте исследований твёрдо-фазных состояний и материалов (Дрезден, Германия).
Твёрдофазный каталитический материал заполняют в кварцевую плоскую кювету и
помещают в зону высокой температуры в реакторную трубку CVD. Каталитический материал состоит из активного металла (наноча-стицы Fe и добавки Mo в качестве катализатора), помещённого на порошок окиси магния (MgO) [13,14], был приготовлен в реакции под давлением из нитрата Mg и Fe и молибдата аммония с лимонной кислотой в качестве пенообразующей и повышающей давление добавки на основе деионизованной воды [15, 16].
Эта суспензия была перенесена непосредственно в печь (560°С), в которой она самопроизвольно была подвергнута сгоранию до MgO и окисей Fe и Mo (продукт сгорания). Последующее восстановление данного продукта было осуществлено при температуре 600°С в течение 30 мин в атмосфере водорода.
Металлические частицы Fe и Mo были сформированы на базе пористого плохо восстанавливаемого порошка (так называемый продукт восстановления). В последующем, при подаче метана в этот реактор температуру подняли до 1000°С и поддерживали в течение 10 мин. Затем подача метана была приостановлена и реактор был охлаждён в атмосфере аргона. С целью удаления катализатора возникшие продукты реакции в смеси соляной кислоты с водой в соотношении 1:1 были подвергнуты ультразвуковому воздействию в течение 1 ч (50 мл/г продукт на выходе), профильтрованы через фильтр PTFE (размер пор 0.45 мкм), промыты дистиллированной водой и высушены при 110°С. После такой обработки ни ионы Mg, ни MgO не выявлялись.
Визуальный контроль над качеством синтетических УНТ осуществляли с помощью сканирующего электронного микроскопа Sigma (Карл Цейс, Германия). При этом было подтверждено получение синтетических многослойных УНТ с типичной тубулярной структурой диаметром 10-60 нм (рис.1).
|&у\
Рис. 1. СЭМ микрофотографии синтезированных многослойных УНТ
Выделение СМАБ осуществляли из головного мозга быка. Основными этапами фракционирования были: 1) осаждение сульфатом аммония в интервале 0-40%-ного насыщения; 2) гель-хроматография на колонке (3 Х 60 см) сефадекса G-150. Процесс фракционирования и отбора иммунопозитивных фракций находился под контролем твёрдофазного непрямого иммуноферментного анализа (ТНИФА) с применением поликлональных иммуноглобулинов к СМАБ. Гомогенность выделенного белка оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (рН 8.3) [10].
Иммуноглобулины к СМАБ получали в результате 5-6-месячной иммунизации кроликов, вводя подкожно по 300 мкг очищенного белка всегда в смеси с равным объёмом полного адъюванта Фрейнда (Sigma, Германия). Схема иммунизации была следующей: первые три инъекции с интервалом в 14 дней, затем по одной инъекции в месяц. Кровь забирали из ушной вены кролика через 10 дней после 3-ей и последующих инъекций, выделяли сыворотку и осаждали иммуноглобулины равным объёмом 100%-ного сульфата аммония.
Исследования были выполнены на лабораторных мышах массой 18-25 г. Животные были поделены на 2 группы: 1) интактная (n=10) и 2) экспериментальная (n=12) группы. Ин-тактных мышей содержали в стандартных клетках в условиях вивария, тогда как экспериментальным животным внутрибрюшинно
вводили УНТ в забуференном физиологическом растворе (рН 7.2) в дозе 1 мг на 10 г массы тела с соблюдением условий стерильности. Спустя 20 сут после введения УНТ животных декапитировали и выделяли пробы печени. Уровень цитохрома Р-450 и СМАБ определяли в твёрдофазном непрямом иммунофер-ментном анализе (НИФА) на полистироловых планшетах со средним уровнем адсорбции (Sigma, Германия) с применением поли-клональных иммуноглобулинов к цитохрому Р-450 и СМАБ [8]. Водорастворимые белки печени экстрагировали в экстрагирующем буфере (рН 7,2), доводили до концентрации 20 мкг/мл с помощью 0,1 М буфера трис-HCl (pH 8.6) и использовали в качестве антигенов. Каждую пробу дублировали трижды и по завершении реакции вычисляли среднюю арифметическую из значений трёх проб. Концентрацию суммарных белков определяли по методу Бредфорд на длине волны 595 нм. В качестве первых антител использовали кроличьи иммуноглобулины к белку СМАБ, а в качестве вторых антител - противокроличьи козьи иммуноглобулины с конъюгированной пероксидазой хрена. Визуализацию реакции осуществляли с помощью субстрата перок-сидазы хрена - 0.05% -ного раствора ортофе-нилендиамина в 0.05 М цитрат-фосфатном буфере (pH 4.5). Реакцию останавливали через 30 мин после добавления субстрата с помощью 3 М раствора NaOH, а результаты реакции считывали в фотометре для иммуно-
ферментного анализа "Molecular Devices Spectra Max 250" (MTX Lab Systems, Inc., США). Результаты исследования усредняли по группам и сравнивали по t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. При наблюдении за животными после введения на-нотрубок было обнаружено, что у животных опытной группы наблюдалось некоторое повышение двигательной активности по сравнению с интактными животными.
Анализ уровня цитохрома Р-450 и СМАБ позволил выявить следующие закономерности. Результаты не выявили разницу в уровне цитохрома Р-450 в пробах печени между животными опытной и контрольной групп (Рис. 2). Вместе с тем, в пробах печени животных опытной группы отмечалось заметное снижение уровня СМАБ на 18% относительно его уровня в пробах интактной группы (р<0.001; Рис. 3).
Таким образом, несмотря на отсутствие изменения в уровне цитохрома Р-450 в печени животных опытной группы, снижение уровня СМАБ в печени подопытных животных под влиянием внутрибрюшинного введения синтетических УНТ указывает на наличие токсического влияния на клетки организма в случае нахождения их в организме в течение продолжительного времени.
В ранее проведенных нами исследованиях было продемонстрировано, что СМАБ участвует в адаптации тканей организма к различным факторам окружающей среды. При этом, повышение его уровня в тканях (печень, жабры, головной мозг) под влиянием повышенного уровня солёности водной среды у исконно пресноводных рыб свидетельствует об его участии в процессах адаптации в отношении к изменённым факторам окружающей среды [17]. Последующие исследования выявили, что СМАБ способствует адаптации животных также и к неблагоприятным условиям окружающей среды. В частности, при превышении уровня фенола в речной воде свыше предельно допустимых концентраций (ПДК) в 2 раза, уровень СМАБ в печени и жабрах рыб подвергался адаптивному повышению, однако при 4-кратном превышении ПДК уровня фенола в водной среде отмечалось снижение уровня СМАБ в исследованных тканях [8].
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об участии серотонинергической системы организма и, в частности СМАБ как части этой системы, в адаптации организма к неблагоприятным условиям среды. Вместе с тем, истощение ресурсов серотонинерги-ческой системы под влиянием неблагоприятных факторов приводит к снижению уровня СМАБ в тканях и, как следствие, к снижению адаптационных возможностей и формированию мутагенных изменений в соматических клетках организма [11]. Исходя из рассмотренного участия СМАБ в обеспечении процессов адаптации, его снижение в печени мышей, получивших инъекцию УНТ, указывает на неспособность организма животных адаптироваться к их довольно большому количеству в течение продолжительного периода времени.
Согласно исследованиям Kayat с соавт. [18], при вдыхании с воздухом УНТ оседают в первую очередь в дыхательных путях. Затем они мигрируют в лимфу и кровь (тромбоциты и моноциты) и в структуры центральной и периферической нервной системы. Четвёртой по очерёдности областью скопления УНТ после их ингаляционного поступления в организм являются сердце, печень, почки, костный мозг и селезёнка. Хотя нами было исследовано влияние внутрибрюшинного введения УНТ на
указанные выше биомаркеры только в одном локусе их конечного скопления, тем не менее, следует указать, что, в силу своего участия в детоксикации практически всего спектра поступающих в организм вредных соединений, печень является очень информативным органом с точки зрения выявления реакции тканей организма на воздействие конкретного токсина
Выявленный уровень токсичности УНТ может быть также связан с загрязнением конечного продукта реакции соединениями железа и молибдена. Вместе с тем, в 1997 г. Департамент Здоровья США провёл специальное исследование, которое не выявило влияния триоксида молибдена (MoO3) на абсолютную или относительную массу органов, количество сперматозоидов и их подвижность у крыс и мышей [19]. В другом исследовании токсичности наночастиц в системе in vitro MoO3 не оказывал заметного влияния на клетки печени крыс BRL 3A в низких дозах (10-50 мкг/мл), тогда как при высоких дозах (100-250 мкг/мл) наблюдался значительный эффект [20]. Не было также обнаружено влияния перорально-го введения мышам суспензии наночастиц железа в дозах 50, 100 и 500 мг/кг [21].
Исходя из важной роли, которую отводят синтетическим УНТ в ближайшем будущем практически во всех сферах деятельности человека, в том числе при разработке новых подходов в лечении широкого перечня заболеваний человека, нужно проводить тщательные исследования токсичности УНТ в случае их нахождения в организме на протяжении длительного времени с привлечением различных методических подходов. Основываясь на полученных результатах определения уровня токсичности УНТ и учитывая их широкое применение в скором будущем, следует осуществлять более тщательную очистку УНТ от сопутствующих реакционных примесей, а также целенаправленно проводить отбор УНТ, лишённых токсичности. ЛИТЕРАТУРА
1. Elhissi M.A.A., Ahmed W., Hassan I.U. et al. Carbon nanotubes in cancer therapy and drug delivery // Journal of Drug Delivery. 2012, v. 2012, p.10
2. Hons P.N., Minett A., Ellis-Behnke R., Zreiqat H. Carbon nanotubes: Their potential and pitfalls for bone tissue regeneration and engineering // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2013, v.9, p.1139-1158.
3. Zhao B., Hu H., Mandal S. K., Haddon R.C. A Bone Mimic Based on the Self-Assembly of Hydroxyapatite on Chemically Functionalized Single-Walled Carbon Nanotubes // Chem. Mater., 2005, v.17(12), p.3235-3241.
4. Ma-Hock L., Treumann S., Strauss V. et al. Inhalation toxicity of multi-wall carbon nanotubes in rats exposted for 3 months // Toxicol. Sci., 2009, v.112(2), p.468-481.
5. Nygaard U.C., Hansen J.S., Samuelsen M. et al. Single-Walled and Multi-Walled Carbon Nanotubes Promote Allergic Immune Responses in Mice // Toxicol. Sci., 2009, v.109(1), p.113-123.
6. Hougaard K.S., Jackson P., Kyjovska Z.O. et al. Effects of lung exposure to carbon nanotubes on female fertility and pregnancy. A study in mice // Reproductive Toxicology, 2013, v.41, p.86-97.
7. Haniu H., Saito N., Matsuda Y., Tsukahara T. et al. Basic potential of carbon nanotubes in tissue engineering applications // Journal of Nanomaterials, 2012, ID 343747, p.10
8. Мустафаев Н.Дж., Мехтиев А.А. Характер изменения уровня серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка и цитохрома Р-450 в тканях восточной быстрянки Alburnoides bipunctatus eichwaldi из рек Азербайджана // Журнал эволюц. биохимии и физиологии, 2014, v.50, (3), p. 190-195.
9. Cavanagh J.E., Burns K.A., Brunskill G.J. et al. Induction of hepatic Cytochrome P-450 1A in pikey bream (Acanthopagrus berda) collected from agricultural and urban catchments in far north Queensland // Marine Pollution Bulle-tin,2000, v.41, (7-12). p.377-384.
10. Мехтиев А.А. Обнаружение в головном мозге крыс белка, обладающего антиконсоли-дационными свойствами // Бюллетень экспер. биол. мед., 2000, №8, с.147-150.
11. Мехтиев А.А., Палатников Г.М., Мовсум-заде С.К., Касимов Р.Ю. Возрастание уровня мутаций в тканях бычков и молоди осетров в условиях блокады антителами серо-тонин-модулируемого антиконсолидацион-
ного белка // Журнал эволюц. биохимии и фи-зиологии,2010, №46, (5), с.375-379.
12. Мехтиев А.А., Мовсум-заде С.К. Антимутагенная активность серотонинерги-ческой системы и подлежащие механизмы у молоди осетров (Acipenser gueldenstaedti persicus) и серебряных карасей (Carassius auratus) // Журнал эволюц. биохимии и физиологии 2008, №44, (5), с.476-481.
13. Coquay P., Peigney A., De Grave E. et al. Coalloys for the catalytic chemical vapor deposition synthesis of single- and double-walled carbon nanotubes (CNTs). 1. The CNT-Fe/Co-MgO system // J. Phys. Chem. Bull., 2005, v.109, (38), p.17813-17824.
14. Patil K.C. Advanced ceramics- combustion synthesis and properties // Bull. Mater. Sci., 1993, v. 16(6), p.533-41.
15. Hernadi K., Fonseca A., Nagy J.B. et al. Fe-catalyzed carbon nanotube formation // Carbon, 1996, v.34(10), p.1249-1257.
16. Tang S., Zhong Z., Xiong Z. et al. Controlled growth of single-walled carbon nanotubes by catalytic decomposition of CH4 over Mo/Co/MgO catalysts // Chem. Phys. Lett., 2001, v.350, p. 19-26.
17. Мустафаев Н.Дж., Мехтиев А.А. Адаптивное повышение уровня серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка в тканях пролупроходных и проходных рыб при повышении солёности воды // Журнал эволюц. биохимии и физиологии, 2013, v.49(6), c.443-448.
18. Kayat J., Gajbhiye R.K., Jain N.K.T. Pul-monaty toxicity of carbon nanotubes: a systematic report. Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. 2011, 7: 40-49.
19. National Toxicology Program (group of authors). NTP Technical Report on the Toxicology and Carcinogenesis Studies of Molybdenum
trioxide (CAS NO. 1313-27-5) in F344/N rats and B6C3F mice 1 (inhalation studies), U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NTP TR 462, NIH Publication No. 97-3378, 1997, pp. 34-35,44-45.
20. Hussain S.M., Hess K.L., Gearhart J.M. et al. In vitro toxicity of nanoparticles in BRL 3A rat liver cells // Toxicol. in Vitro, 2005, v.19(7), p.975-983.
21. Коваленко Л.В., Фолманис Г.Е. Биологически активные нанопорошки железа. 2006. М.: Наука, 214 с.
SUMMARY Study of long-term impact of synthetic carbon nanotubes on level of cytochrome P-450 and serotonin-modulating anticonsolidation protein in liver of mice S. G.Abdullayeva, A.A.Mekhtiev Center of Studies and Development in High Technologies, Ministry of Transport, Communications and High Technologies of Azerbaijan, A.I.Karaev Institute of Physiology, NAS of Azerbaijan, Baku The study revealed toxic impact of synthetic carbon nanotubes (CNT) on the organism of mice through evaluation of the levels of biomarker cytochrome P-450 and novel serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP) with application of the indirect ELISA-test in the liver of mice. Though cytochrome P-450 did not change under impact of synthesized nanotubes within prolonged (20 days) period of time, downregula-tion of protein SMAP (p<0.001; up to 18%) was noticed. These data indicate to toxic effects of synthetic CNTs on the tissues of the mice under their prolonged impact.
_Поступила: 25.01.2017
Серологические маркеры инфицирования вирусами гепатитов В и С у доhоров крови, живущих в разных городах Азербайджана
27
