CC BY
62
ИЗВЕСТИЯ
ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 29 2012
IZVESTIA
PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 29 2012
УДК 597.554.3-118+597-151.3 РОЛЬ СЕРОТОНИН-МОДУЛИРУЕМОГО АНТИКОНСОЛИДАЦИОННОГО БЕЛКА В КОНСОЛИДАЦИИ СЛЕДОВ ПАМЯТИ У СЕРЕБРЯНОГО КАРАСЯ CARASSIUS AURATUS
© Д. В. ГАРИНА*, А. А. МЕХТИЕВ**
* Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН e-mail: [email protected] ** Институт физиологии им. А. И. Караева НАН Азербайджана e-mail: [email protected]
Гарина Д. В., Мехтиев А. А. - Роль серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка в консолидации следов памяти у серебряного карася Carassius auratus // Известия ПГПУ им. В.Г. Белинского. 2012. № 29. С. 201-205. - Исследовали роль серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка (СМАБ), обладающего свойством нарушать формирование следов памяти у млекопитающих, в обучении и памяти у серебряного карася в условно-рефлекторной модели одностороннего активного избегания. После обучения в течение 10 сеансов рыб забивали, извлекали мозг и методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа (ТНИФА) определяли в нём содержание СМАБ. Установлено, что содержание СМАБ в мозге обученных рыб было на 88 % ниже такового у особей из группы активного контроля, получавших несочетанные предъявления условного и безусловного сигналов, и интактной группы. Данные результаты подтверждают ранее полученные сведения об ингибирующем эффекте СМАБ на формирование долговременной памяти у костистых рыб в опыте с прямым введением белка в мозг, а также согласуются с антиконсолидационным действием белка в экспериментах с обучением млекопитающих условно -рефлекторному поведению с отрицательным покреплением.
Ключевые слова: карась Carassius auratus (L.), серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок (СМАБ), консолидация следов памяти, условный рефлекс одностороннего активного избегания, твердофазный непрямой иммуноферментный анализ.
Garina D. V., Mekhtiev A. A. - The role of serotonin-modulating anticonsolidation protein in consolidation of memory traces in goldfish Carassius auratus // Izv. Penz. Gos. pedagog. univ. im.i V.G. Belinskogo. 2012. № 29. P. 201-205. - The role of serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP) participating in negative regulation of memory traces formation in rats, has been studied in the processes of learning and memory formation in goldfish Carassius auratus (L.) in active one-way avoidance conditioning model. After the learning during 10 sessions fish were sacrificed, the brains were removed, and the levels of SMAP were determined by solid phase indirect ELISA-test. Significant downregulation (by over 88%) of the levels of SMAP in the whole brains of goldfish from the experimental group relatively to the animals from the active control group exposed to random presentation of conditioned and unconditioned signals as well as to the animals from the intact group was revealed. The results suggest negative effect of SMAP on the formation of long-term memory in teleosts established earlier in the experiments with direct injection of the protein in fish brain, and show the similarity with anticonsolidation effect of this protein in mammals in the experiments with learning of conditioning with negative reinforcement.
Keywords: goldfish Carassius auratus (L.), serotonin-modulating anticonsolidation protein (SMAP), consolidation of memory trace, one-way avoidance conditioning, solid phase indirect ELISA-test.
Изучение молекулярных механизмов памяти в сравнительном и эволюционном аспектах - чрезвычайно интересная и мало разработанная проблема. Согласно современным представлениям, память и способность к обучению у рыб развиты гораздо лучше, чем было принято думать ранее. Установлено, что у рыб существует долговременная память [11, 14], способность как к простым (классический условный реф-
лекс), так и к довольно сложным формам научения, например, к пространственному распознаванию [12]. Многочисленными исследованиями продемонстрировано участие серотонинергической системы головного мозга в формировании следов памяти у млекопитающих [3, 10, 13]. Поскольку эффекты серотонина на консолидацию следов памяти в нервных клетках мозга обусловлены активацией специфических генов
и синтезом белков [7, 8], изучение участия серотонина в механизмах памяти предполагает исследование роли этих белков в формировании следов памяти у животных в различных поведенческих моделях. Сведения об участии серотонинергической системы мозга в формировании памяти у рыб полностью отсутствуют.
Ранее в коре головного мозга крыс был идентифицирован и из целого мозга крыс выделен серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок (СМАБ), состоящий из двух субъединиц с молекулярной массой 60 и 126 кДа, количество которого находится в прямой зависимости от уровня серотонина. Было показано, что СМАБ ингибирует консолидацию следов памяти у крыс в модели однократного обучения навыку пассивного избегания, при условии его интра-церебровентрикулярной инъекции за 24 ч до сеансов обучения [4]. Вместе с тем обнаружено, что СМАБ не нарушает процессы хранения и воспроизведения следов памяти, поскольку его введение через 48 ч после сеансов обучения и завершения процесса консолидации памяти не оказывало влияния на энграмму памяти. Методом непрямого иммуноферментного анализа присутствия СМАБ в тканях разных видов животных было установлено, что СМАБ лишён видовой и тканевой специфичности и присутствует в тканях других групп позвоночных животных [5].
Целью настоящей работы являлось выяснение влияния белка СМАБ на консолидацию следов памяти у костистых рыб (на примере серебряного карася) в модели условного рефлекса одностороннего активного избегания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследование проводили в июле 2012 г. на годовиках (1+) серебряного карася Carassius auratus (L). Рыбы были отловлены в пруду близ посёлка Борок и транспортированы в лабораторию, где содержались в течение 5 сут в 40-литровых непроточных аквариумах с принудительной аэрацией. Животных кормили искусственным желированным кормом один раз в сутки ad libitum. Перед началом эксперимента было сформировано три группы рыб по 8 особей: интактная, группа активного контроля и опытная группа. Средняя масса рыб составила 6.4-7.0 г, длина 75-87 мм. После взвешивания и измерения каждую особь помещали в индивидуальный контейнер ёмкостью 4 л, с принудительно аэрируемой водой. Температура воды в ёмкостях 22-23°С, освещение искусственное (10 ч «свет»: 14 ч «темнота», интенсивность освещения 100 лк). Рыб в течение 24 ч акклимировали к условиям содержания в ёмкостях, после чего начинали обучение.
Эксперимент проходил в три этапа: 1) Обучение рыб в течение 10 сеансов условному рефлексу одностороннего активного избегания; 2) Взятие образцов мозга; 3) Определение содержания СМАБ в целом мозге рыб методом ТНИФА.
Обучение рыб условному рефлексу одностороннего активного избегания проводили по разработанной авторами методике в течение 10 сеансов: 4 сеанса в первый день, 5 сеанса во второй и 1 сеанс в третий
день. Экспериментальная установка представляла собой непроточный аквариум с размерами 30 х 40 х 60 см, наполовину наполненный водой (рис. 1), которую принудительно аэрировали и меняли по мере загрязнения. Температуру воды поддерживали на уровне 23°С, освещение отсутствовало.
Рис. 1. Экспериментальная установка для выработки условного рефлекса одностороннего активного избегания у рыб.
Посередине аквариума была закреплена перегородка из матового оргстекла высотой 21 см, в нижней части которой в центре был сделана полукруглая выемка (высота 6,5 см, длина в основании 8 см), достаточная для свободного перехода карася в другую часть аквариума. Уровень воды в аквариуме был на 1-2 см ниже перегородки. Над серединой первой половины аквариума сверху на леске, закреплённой на штативе, на расстоянии 20 см от поверхности воды была подвешена стеклянная склянка. Положение склянки над аквариумом дистанционно управлялось экспериментатором, находившимся на удалении 1.7 м от аквариума, вне видимости рыб. При опускании склянки на поверхность воды раздавался резкий звук - хлопок, пугающий рыбу, который использовали в качестве безусловного сигнала (БС). В качестве условного сигнала (УС) использовали лампочку накаливания мощностью 100 Вт, зафиксированную на расстоянии 30 см от поверхности воды над первым отсеком.
Обучение рыб в опытной группе происходило следующим образом. После помещения карася в первый отсек аквариумной установки рыбе, помещённой впервые, давали 3 мин для адаптации (в последующих сеансах - 30 сек), после чего включали свет (УС) и через 6 сек подавали БС. Если после подачи БС рыба не переходила сразу через перегородку, то его повторно предъявляли через 20 сек. Если на протяжении 6 предъявлений БС, подаваемых подряд с интервалом в 20 сек, рыба через проход в перегородке не уходила в другую часть аквариума, то считалось, что рыба задание не выполнила. Сеансы обучения начинались
зоология ►►►►>
ежедневно в 9:30. Интервал между сеансами в течение одних суток составлял от 1 до 2 ч.
Карасям из группы активного контроля УС и БС подавали несочетанно, в случайном порядке. При этом количество предъявляемых раздражителей соответствовало среднему количеству раздражителей, предъявляемых животным опытной группы. Животные из интактной группы обучению не подвергались.
Взятие образцов мозга для анализа осуществляли через 3 ч после последнего сеанса обучения. Рыб умерщвляли декапитацией, мозг извлекали и взвешивали, после чего помещали в пробирки Эппендорф, замораживали при -18оС и хранили в течение 7 сут до начала анализа.
Определение уровня СМАБ в головном мозге рыб осуществляли методом ТНИФА на полистироло-вых планшетах со средним уровнем адсорбции (Sigma, Германия) с применением поликлональных иммуноглобулинов к СМАБ. Иммуноглобулины получали в результате 5-6-месячной иммунизации кроликов, вводя подкожно по 300 мкг очищенного белка всегда в смеси с равным объёмом полного адъюванта Фрейнда (Sigma, Германия). Схема иммунизации была следующей: первые три инъекции с интервалом в 14 дней, затем по одной инъекции в месяц. Кровь забирали из ушной вены кролика через 10 дней после 3-ей и последующих инъекций, выделяли сыворотку и осаждали иммуноглобулины путём приливания равного объёма 100%-ного сульфата аммония.
Образец мозга целиком экстрагировали в экстрагирующем буфере (рН 7.2) и доводили до концентрации 20 мкг/мл с помощью 0.1 М буфера трис-HCl (pH 8.6). Концентрацию суммарных белков определяли по методу Бредфорд с использованием 0,01%-ного раствора Кумасси бриллиантового синего G-250, на длине волны 595 нм на спектрофотометре «Lambda 25» (Perkin Elmer). В качестве первых антител использовали поликлональные кроличьи иммуноглобулины к белку СМАБ, в качестве вторых антител - противо-кроличьи козьи иммуноглобулины с конъюгированной пероксидазой хрена. Визуализацию реакции осуществляли с помощью субстрата пероксидазы хрена
- 0.05%-ного раствора ортофенилендиамина в 0.05 М цитрат-фосфатном буфере (pH 4.5). Реакцию останавливали через 20 мин после добавления субстрата с помощью 3 М раствора NaOH, и результаты реакции считывали в фотометре для иммуноферментного анализа “StatFax 303” (Awareness, США) на длине волны 492 нм. Каждую пробу дублировали дважды и по завершении анализа вычисляли среднюю арифметическую из значений двух проб. Расчёт количества СМАБ в мозге рыб производили на основании построенной заранее калибровочной кривой зависимости десятичного логарифма различных концентраций СМАБ от значений оптических единиц поглощения на длине волны 492 нм.
Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 6.0 с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Необходимо отметить, что рыбы опытной группы демонстрировали вначале нехарактерно высокую скорость обучения: уже в первом-третьем сеансах все караси выполняли задание после подачи 5-7 стимулов (1 условный и 4-6 безусловных). Однако с 4 по 9-й сеансы караси обучались несколько хуже: от 1 до 3 особей в опытной группе не выполняли задание, кроме того, все особи в целом демонстрировали низкую двигательную активность, что, вероятно, было связано с изменением погоды и значительным падением атмосферного давления. Тем не менее, к 10-му, последнему сеансу обучения караси достигали 100 %-ного уровня обученности, т.е. все 8 особей выполняли задание, что позволило сделать вывод о достаточности проведённых сеансов обучения для формирования навыка.
Анализ уровня СМАБ в головном мозге карасей трёх групп выявил следующие отличия. Обнаружено, что у рыб опытной группы содержание СМАБ в целом мозге (3.98±0.7 мкг/г ткани мозга) было ниже такового у рыб из группы активного контроля (7.47±1.8 мкг/г; p>0.05) и ниже, чем у интактных рыб (7.49±0.9 мкг/г; p<0.05) на одинаковую величину - 88 % (рис. 2).
W
<
2
О
<D
S
а
*
Рч
(D
ч
о
интактная
группа
активный
контроль
опытная
группа
Рис. 2. Содержание СМАБ в мозге интактных, контрольных и опытных рыб после обучения условному рефлексу одностороннего активного избегания
* - достоверное отличие от интактных особей (р<0.05, критерий Манна-Уитни).
Столь близкие значения содержания СМАБ в мозге карасей интактной группы и группы активного контроля свидетельствуют о том, что УС и БС, предъявлявшиеся в случайном порядке, не оказывали влияния на его уровень. Таким образом, многократное предъявление УС и БС, предъявленных рыбам из группы активного контроля в беспорядочной последовательности, позволяет исключить интерпретацию снижения уровня СМАБ у животных опытной группы вследствие одной только сенсорной стимуляции. Результаты проведённого эксперимента отчётливо указывают на негативный характер регуляции формирования долговременной памяти у рыб со стороны СМАБ и подтверждают ранее полученные данные об его ингибирующем влиянии на консолидацию следов памяти у карпа Сурпит оатрю Ь. при прямом введении в мозг с последующим обучением в той же модели одностороннего активного избегания [1]. Так, нами было показано, что введение СМАБ в желудочек мозга карпов за 24 ч до обучения не оказывает негативного влияния на процесс выработки навыка, однако приводит к нарушению его воспроизведения при итоговом тестировании: снижению количества особей, выполнивших задание и увеличению латентного времени воспроизведения [1].
В ранее проведенных исследованиях [6] было показано, что СМАБ, будучи введённым животным, подвергнутым неблагоприятным воздействиям, проявляет антимутагенную активность. Было высказано предположение, что впервые выявленная антимута-генная активность серотонинергической системы реализуется посредством конденсации хроматина, переводящей генетический аппарат в неактивное состояние. Также была выдвинута гипотеза, что в нормальных условиях СМАБ задействован в блокировании записывания в нервных клетках информации, не имеющей биологической значимости для организма [2]. В данных экспериментах нарушение формирования следов памяти под влиянием введённого извне СМАБ, возможно, также связано с конденсацией хроматина, что препятствует модификации ДНК и белков хроматина, а также считыванию информации с матрицы ДНК и синтезу специфических белков, обеспечивающих формирование долговременной памяти [9].
ВЫВОДЫ
1. Продемонстрировано снижение содержания СМАБ в нервных клетках головного мозга серебряного карася в результате обучения условному рефлексу одностороннего активного избегания относительно его уровня у интактных животных и животных из группы активного контроля, что указывает на негативный характер регуляции формирования долговременной памяти у рыб со стороны СМАБ.
2. Выявленный эффект подтверждает ранее установленное антиконсолидационное свойство белка в опытах с прямым введением СМАБ в мозг рыб и регистрацией поведенческих реакций, а также согласуется с данными по влиянию белка на формирование памяти у млекопитающих в ряде поведенческих моделей.
3. Предположено, что антиконсолидационный эффект белка СМАБ связан с конденсацией хроматина в нервных клетках, что блокирует считывание информации с матрицы ДНК и синтез специфических белков, осуществляющих молекулярное обеспечение формирования долговременной памяти.
Благодарности. Авторы выражают глубокую признательность д.б.н. Ю. В. Герасимову за финансовую поддержку работы, к.б.н. В. А. Непомнящих - за консультативную помощь и ценные замечания при просмотре рукописи, д.б.н. Э. К. Рустамову - за ценную методическую помощь.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гарина Д. В., Мехтиев А. А. Участие серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка в формировании долговременной памяти у карпа Cyprinus carpio // Адаптационные стратегии живых систем. Тез. докл. междисциплинар. науч. конф. Киев, 2012. С. 25-26.
2. Гусейнов Ш. Б., Мехтиев А. А. Изучение роли серотонин-модулируемого антиконсолидационного белка в формировании памяти у крыс в челночной камере // Журн. высш. нерв. деят. 2012. Т. 2. С. 1-8.
3. Кругликов Р. И. Регулирующее влияние серотонина на белковый метаболизм головного мозга в процессе консолидации. Нейрохимические механизмы обучения и памяти. М.: Наука, 1981. С. 161-173.
4. Мехтиев А. А. Обнаружение в головном мозге крыс белка, обладающего антиконсолидационными свойствами // Бюлл. экспер. биол. мед. 2000. Т. 129. № 8. С. 147-150.
5. Мехтиев А. А., Гайсина А. А., Палатников Г. М., Касимов Р. Ю. Снижение активности серотонинергиче-ской системы в процессах мутагенеза // Бюлл. экспер. биол. мед. 2006. Т. 142. № 12. С. 611-613.
6. Мехтиев А. А., Мовсум-заде С. К. Антимутагенная активность серотонинергической системы и подлежащие механизмы у молоди осетров (Acipenser gueldenstaedti persicus) и серебряных карасей (Carassius auratus) // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2008. Т. 44. № 5. С. 476-481.
7. Abel T., Kandel E. Positive and negative regulatory mechanisms that mediate long-term memory storage // Brain Res. Reviews. 1998. V. 26. № 2-3. P. 360-378.
8. Barziali A., Kennedy T. E., Sweatt J. D., Kandel E. R. 5-HT modulates protein synthesis and the supression of specific proteins during long-term facilitation in Aplysia sensory neurons // Neuron. 1989. V. 2. P. 1577-1586.
9. Borrelli E., Nestler E. J., Allis C. D., Sassone-Corsi P. Decoding the Epigenetic Language of Neuronal Plasticity // Neuron. 2008. V.60. № 6. P. 961-974.
10. Cassel J.-Ch. Experimental studies on the role (s) of serotonin in learning and memory functions // Handbook of Behavioral Neuroscience. 2010. V. 21. P. 429-447.
11. Csanyi V., Csizmadia G., Miklosi A. Long-term memory and recognition of another species in the paradise fish // Animal Behaviour. 1989. V. 37. № 6. P. 908-911.
12. Rodriguez F., Duran E., Gomez A., Ocana F. M., Avarez E., Jimenez-Moya F., Broglio C., Salas C.
зоология ►►►►>
Cognitive and emotional functions of the teleost fish cerebellum // Brain Res. Bull. 2005. V. 66. P. 365370.
13. Sitaraman D., Zars M., Laferriere H., Chen Y.C., Sable-Smith A., Kitamoto T., Rottinghaus G. E., Zars T. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 14. P. 55795584.
14. Zion B., Karplus I., Grinshpon J., Rosenfeld L., Barki A. Periodic reinforcement of acoustically conditioned behavior in St. Peter’s fish, Sarotherodon galilaeus, for ranching purposes // Aquaculture. 2011. V. 315. № 3-4. P. 394-399.
