CC BY
6DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-33-95-101 УДК 616.24-036.12:575.174.015.3
Е. А. Хотько, А. Д. Таганович, А. Г. Кадушкин
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ RS2234693 ГЕНА ESR1 И RS731236 ГЕНА VDR У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ
БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Учреждение образования «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220083, г. Минск, пр. Дзержинского, 83 e-mail: qwert.poilk@mail.ru
Исследована частота встречаемости полиморфных вариантов rs2234693 (PvuII, Т^-С) гена ESR1 и rs731236 (TaqI, Т^-С) гена VDR у 95 пациентов, страдающих хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и у 95 здоровых людей. Обнаружено статистически значимое увеличение (р = 0,006) частоты встречаемости гетерозиготного генотипа rs2234693 в 1 интроне гена ESR1 в группе пациентов с ХОБЛ по сравнению с группой условно здоровых людей. Гетерозиготный генотип ТС rs2234693 ассоциирован с повышенным риском развития хронической обструктивной болезни легких (ОШ = 5,21, 95% ДИ: 1,43-19,0). В отношении полиморфизма rs731236 гена VDR не определено статистически значимых отличий в частоте встречаемости того или иного генотипа у пациентов с ХОБЛ и здоровых людей.
Ключевые слова: полиморфизм генов, хроническая обструктивная болезнь легких, рецепторы, эстрогены, кальцитриол.
Введение
Воспаление является ведущим признаком хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). При этом заболевании наблюдается повышенная экспрессия медиаторов воспаления в результате усиления транскрипции генов [1]. Это связано с тем, что индукция многих генов представляет собой специфический ответ во время воспалительного процесса [2].
Многие факторы транскрипции, такие как AP-1 и NF-kB, являются общими для нескольких типов клеток и играют основную роль в регуляции экспрессии генов провоспали-тельных белков [3]. Факторы транскрипции также могут напрямую активироваться лиган-дами, такими как глюкокортикоиды, эстрогены и витамин D [4].
Активная форма витамина D опосредует свое биологическое действие через ядерный рецептор витамина (VDR). В кроветворной системе VDR экспрессируется в различных типах клеток, включая макрофаги, дендритные клетки и активированные Т- и В-лимфо-циты. Показано, что in vitro кальцитриол приводит к уменьшению пролиферации Т-клеток за счет снижения синтеза провоспалительно-
го ГЬ-2 и [118]. Также наблюдается уси-
ленная наработка противовоспалительного ГЬ-4 Т-хелперами 2 типа [5]. Экспериментальные работы показали, что при инактивации гена VDR в крови мышей отмечается увеличение количества медиаторов воспаления [6]. Также отмечено, что в клетках легких пациентов, страдающих ХОБЛ, снижена экспрессия рецептора VDR и его мРНК по сравнению с группой здоровых лиц [7].
Эстрогены, в отличие от кальцитриола, обладают как иммуностимулирующими, так и иммуносупрессивными свойствами [8]. Эстрановые стероидные гормоны действуют через свои собственные уникальные рецепторы — ESR1 ^-а) или ESR2 ^-Р) [8]. Показано, что все рецепторы женских половых стероидных гормонов экспрессируются в легочной ткани [9]. Роль ESR1 заключается в регуляции дифференцировки клеток во время развития, что приводит к нормальному количеству альвеол на единицу площади поверхности легких [10]. Кроме того, было продемонстрировано, что именно ESR1 опосредует противовоспалительный ответ клетки [11]. После активации ESR1 происходит ингибиро-
вание внутриклеточного транспорта NF-кB, что предотвращает экспрессию воспалительных генов [12].
Изменение количества или структуры ESR1 и VDR может быть обусловлено модификацией структуры генов, которые кодируют образование этих рецепторов. Так, одним из вариантов генетических изменений являются однонуклеотидные замены. Среди большого числа полиморфизмов в структуре гена Е8Я1 особый интерес представляет ге2234693. Предполагается, что замена Т (тимина) на С (цито-зин) в полиморфном локусе ге2234693 может влиять на связывание с факторами транскрипции семейства туЬ и изменять экспрессию мРНК ESR1 [13]. Среди полиморфных вариантов гена VDR на стабильность мРНК влияет замена Т (тимина) на С (цитозин) в локусе ге731236 [14].
Цель данного исследования — изучение связи полиморфных вариантов ге2234693 гена Е8Я1 и ге731236 гена VDR с хронической обструктивной болезнью легких, а также их распределение в изучаемой группе и в группе сравнения (здоровые люди).
Материалы и методы
В ходе исследования были использованы инструментальные, лабораторные и статистические методы исследования. В работе проанализированы образцы ДНК 95 пациентов, имеющих диагноз ХОБЛ, и 95 здоровых людей.
Всем обследуемым были проведены диагностические тесты для оценки функции внешнего дыхания. Критериями исключения пациентов из основной группы являлись наличие бронхиальной астмы, атопии, аллергического ринита, туберкулеза легких, заболевания соединительной ткани с изменением функции дыхательной системы, онкологических заболеваний, бронхоэктатической болезни и других заболеваний бронхолегочной системы, а также неспособность правильно выполнить дыхательный маневр при тестировании функции внешнего дыхания.
Из числа здоровых обследуемых были исключены пациенты, у которых в ходе спирометрии объем форсированного выдоха за первую секунду маневра (ОФВ1) был менее 80% и величина отношения этого показателя к форсированной жизненной емкости легких (ОФВ1/
ФЖЕЛ) составляла менее 70%.
Сбор биологического материала и анкетных данных проводился с соблюдением всех этических норм после подписания опрашиваемыми пациентами формы информированного согласия.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено в лаборатории биохимических методов исследования, структурном подразделении Научно-исследовательской части Белорусского государственного медицинского университета с помощью набора NucleoSpin Blood (MACHERY-NAGEL, Германия) согласно инструкции производителя.
Определение однонуклеотидных замен проводили при помощи ПЦР в реальном времени с использованием коммерческих наборов, которые содержали аллель-специфичные TaqMan-зонды, связанные с двумя различными флуоресцентными красителями (ООО «Тест-Ген», Россия) с помощью детектирующего амплификатора ДТ-322 («ДНК-Технология», РФ). Регистрация аллели производилась на основании появления флюоресценции не позже 32 цикла амплификации последовательно для каждой из пробирок при ее позиционировании относительно оптического блока. Условия для проведения ПЦР согласно рекомендации фирмы изготовителя наборов.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel (Microsoft Corporation, USA) и SPSS версии 23.0 (IBM, USA). Тест на соответствие контрольной выборки равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием метода х2 (а = 0,05; df = 1). При сравнении частот встречаемости полиморфных вариантов в группах пациентов с ХОБЛ и контроля использовался стандартный критерий х2 Пирсона; при условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали точный двусторонний критерий Фишера. Связь между генотипами и заболеванием оценивали по отношению шансов (ОШ). ОШ указан с 95-процентным доверительным интервалом (ДИ).
Результаты и обсуждение
Распределение частот генотипов по всем изученным полиморфизмам в группе сравнения и группе пациентов с ХОБЛ соответствовало теоретически ожидаемому равновесно-
му распределению Харди-Вайнберга (для ге2234693 р = 0,11 и р = 0,83 соответственно, для ге731236 — р = 0,60 и р = 0,81).
Картина аллельного статуса в точке ге731236 гена VDR у здоровых людей (Т = 64,2% и С = 35,8%) оказалась подобна результатам исследования, проведенного среди белорусов шести регионов, в которых частота встречаемости минорной аллели составила от 29,9% до 35,0% [15]. В то же время данные метаана-лиза, проведенного Jolliffe D. А. и соавт., указывают на то, что среди здоровых людей носители генотипа ТС встречаются чаще, чем
среди пациентов с ХОБЛ. Так, количество событий на одного участника в год в контрольной группе составило 2,09, в группе пациентов с ХОБЛ — 1,83, однако полученные данные не имели статистически значимых различий [16]. Аналогичная картина была отмечена и в нашей работе, где доля носителей ТС в группе сравнения составила 48,4%, а в группе пациентов, страдающих ХОБЛ — 44,2%. Однако при сравнении частоты носительства генотипов этого полиморфного локуса в контрольной и опытной группах статистически значимых отличий выявлено не было (табл. 1).
Таблица 1
Частота встречаемости генотипов/аллелей в опытной и контрольной группах и оценка риска развития ХОБЛ по полиморфным вариантам генов
Ген/га Генотип/ аллель Частота носительства, % (п) р ОШ 95% ДИ
Пациенты с ХОБЛ, п = 95 Здоровые лица, п = 95
Е8К1 ге2234693 ТТ1 ТС СС 41,0 (39) 45,3 (43) 13,7 (13) 64,2 (61) 28,4 (27) 7,4 (7) 0,006 0,19 0,05-0,70
5,21 1,43-19,0
0,95 0,02-48,3
ТТ/ТС2 СС 86,3 (82) 13,7 (13) 92,6 (88) 7,4 (7) >0,05 0,50 0,19-1,32
0,95 0,02-48,3
ТС/СС3 ТТ 59,0 (56) 41,0 (39) 35,8 (34) 64,2 (61) 0,002 2,58 1,43-4,63
0,19 0,05-0,70
Т4 С 63,7 (121) 36,3 (69) 78,4 (149) 21,6 (41) 0,002 0,48 0,31-0,76
2,07 1,32-3,27
VDR ге731236 ТТ1 ТС СС 43,2 (41) 44,2 (42) 12,6 (12) 40,0 (38) 48,4 (46) 11,6 (11) >0,05 1,14 0,64-2,03
0,84 0,48-1,49
0,64 0,46-2,64
ТТ/ТС2 СС 87,4 (83) 12,6 (12) 88,4 (84) 11,6 (11) >0,05 0,91 0,38-2,17
0,64 0,46-2,64
ТС/СС3 ТТ 56,8 (54) 43,2 (41) 60,0 (57) 40,0 (38) >0,05 0,30 0,49-1,56
1,14 0,64-2,03
Т4 С 65,3 (124) 34,7 (66) 64,2 (122) 35,8 (68) >0,05 1,05 0,69-1,60
0,96 0,63-1,46
Примечание. 1 — аддитивная модель наследования; 2 — рецессивная модель наследования; 3 — доминантная модель наследования; 4 — мультипликативная модель наследования
Полиморфизм TaqI (^731236) приводит к синонимичной замене изолейцина в 352 ко-доне 9-го экзона. Хотя наличие полиморфизма TaqI не изменяет структуру белка VDR, но такая однонуклеотидная замена влияет на стабильность мРНК VDR и трансляцию белков, ответственных за снижение количества VDR [14, 17]. Отмечено, что носительство минорной аллели С полиморфного локуса ге731236 связано с более высокими уровнями экспрессии мРНК VDR [18].
Распространенность различных полиморфных вариантов гена VDR имеет расово-этниче-ские различия. Так, встречаемость минорной аллели С полиморфизма TaqI у африканцев составвляет 28,5% случаев, у азиатов — 37% случаев, а среди европейцев носителями данного варианта являются 39%. Поскольку VDR широко представлен во многих клетках и тканях организма, в том числе и клетках иммунной системы (моноцитах, лимфоцитах, макрофагах), в последние годы были предприняты многочисленные попытки изучения ассоциации полиморфных вариантов гена VDR с развитием остеопороза, псориаза, бронхиальной астмы, туберкулеза легких в различных этнических группах [19].
При анализе частот встречаемости аллелей ге2234693 гена ЕБШ в исследуемых группах было обнаружено преобладание носитель-ства аллели С среди лиц, страдающих ХОБЛ (36,3%), по сравнению со здоровыми людьми (21,6%). Носительство гетерозиготного генотипа ТС среди пациентов с ХОБЛ составило 45,3%, а гомозиготного генотипа СС — 13,7%. До настоящего времени исследований, посвященных изучению полиморфизма ге2234693 гена Е8Я1 при ХОБЛ, не проводилось. Однако в литературе имеются сведения, что среди пациентов (русские) с идиопатическими ин-терстициальными пневмониями и саркоидо-зом органов дыхания гетерозиготный генотип ТС встречается в 48,1% и 55,0% случаев [20].
Следует отметить, что распространенность полиморфизма ^2234693 гена ЕБЯ1 также имеет выраженные этнические различия. Так, частота встречаемости минорной аллели С среди европейцев составляет 42,3%, среди американцев — 34,9%, а среди африканцев — 57%.
Далее был проанализирован уровень от-
ношения шансов для локуса ге2234693 гена Е8Я1 с хронической обструктивной болезнью легких. Полученные данные свидетельствуют о том, что носительство генотипа ТС ге2234693 гена ЕБЯ1 повышает риск развития ХОБЛ (ОШ = 5,21; 95% ДИ: 1,43-19,0; р = 0,006). Также показатель ОШ, рассчитанный для генотипа ТТ и соответствующий 95% ДИ, свидетельствует о том, что пациенты с ХОБЛ в 5,26 раза реже являются носителями этого гомозиготного генотипа по сравнению со здоровыми людьми, что указывает на его возможное протективное влияние (ОШ = 0,19; 95% ДИ: 0,05-0,70, р = 0,006). Результаты оценки связи генотипов с ХОБЛ также свидетельствуют о том, что генотипы с аллелью С встречаются в 2,58 раза чаще среди пациентов, страдающих ХОБЛ, по сравнению с группой здоровых лиц.
Ген эстрогенового рецептора 1 типа расположен на 6 хромосоме, содержит 8 экзонов и 7 интронов и состоит приблизительно из 140 тыс. пар оснований [21]. В настоящее время известно более 2 200 полиморфизмов ESR1 [22]. Наиболее широко изучены полиморфизмы длин рестрикционных фрагментов 1-го интрона PvuII (Т397С) и ХЬа1 (С35Ш) и (ТА) п-тандемные повторы (VNTR) в промоторной области гена. В литературе имеются данные о связи этих полиморфизмов с развитием различных заболеваний, таких как рак молочной и предстательной желез, остеопороз, болезнь Альцгеймера и сердечно-сосудистые заболевания [23-27]. Однако полученные результаты довольно противоречивы, а сведения о полиморфном локусе ге2234693 при ХОБЛ вовсе отсутствуют.
Вместе с тем ряд авторов указывает на сопряженность однонуклеотидной замены ге2234693 с развитием других заболеваний легких. Так, установлена статистически значимая связь носительства этого полиморфизма с возникновением немелкоклеточного рака легкого в тайваньской популяции [28]. При этом носительство аллели Т характеризовалось как протективное, препятствующее развитию заболевания. В то же время у женщин, страдающих бронхиальной астмой, обнаружена связь генотипа ТС этого полиморфного локу-са со снижением функциональной активности легких [29]. Следует добавить, что полимор-
физм rs2234693 может влиять на экспрессию гена ESR1 как за счет нарушения связывания с факторами транскрипции, так и немелкокле-точного рака легкого в тайваньской популяции путем усиления альтернативного сплайсинга в процессе созревания соответствующей мРНК [29]. Имеющаяся в литературе информация дает основание полагать, что полиморфный локус rs2234693 причастен к развитию ХОБЛ, а гетерозиготное носительство может быть ассоциировано с повышенной вероятностью заболевания.
Заключение
Таким образом, выявлены достоверные различия частоты встречаемости генотипов полиморфного варианта rs2234693 в 1 интроне гена ESR1 между группами пациентов с хронической обструктивной болезнью легких и здоровыми людьми. Среди пациентов, страдающих хронической обструктивной болезнью легких, достоверно чаще встречались носители гетерозиготного генотипа ТС (ОШ = 5,21; 95% ДИ: 1,43-19,0; p = 0,006). Для подтверждения выявленных ассоциаций необходимы дальнейшие исследования.
Список использованных источников
1. Chung, K. F. Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation, immunity, and tissue repair and destruction / K. F. Chung, I. M. Adcock // European Respiratory Journal. - 2008. - Vol. 31, № 6. - P. 1 334-1 356.
2. Barnes, P. J. Mechanisms in COPD: differences from asthma / P. J. Barnes // Chest. - 2000. - Vol. 117, № 2. - P. 10-14.
3. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives / T. D. Gilmore // Oncogene. - 2006. - Vol. 25, № 51. -P. 6 680-6 684.
4. Saklatvala, J. The p38 MAP kinase pathway as a therapeutic target in inflammatory disease / J. Saklatvala // Curr. Opin. Pharmacol. - 2004. -Vol. 4, № 4. - P. 372-377.
5. The role of vitamin D in pulmonary disease: COPD, asthma, infection, and cancer / C. Herr [et al.] // Respir. Res. - 2011. - Vol. 12, № 1. - P. 2-9.
6. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema / M. A. Crane-Godreau [et al.] // Front. Physiol. -2013. - Vol. 4. - P. 132-142.
7. Local expression profiles of vitamin D-relat-ed genes in airways of COPD patients / C. Ma-thyssen [et al.] // Respir. Res. - 2020. - Vol. 21.
- P. 137-147.
8. Walker, S. E. Estrogen and autoimmune disease / S. E. Walker // Clin. Rev. Allergy Immunol.
- 2011. - Vol. 40, № 1. - P. 60-65.
9. The impact of sex and sex hormones on lung physiology and disease: lessons from animal studies / M. A. Carey [et al.] // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2007. - Vol. 293, № 2. -P. L272-L278.
10. Massaro, D. Estrogen regulates pulmonary alveolar formation, loss, and regeneration in mice / D. Massaro, G. D. Massaro // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2004. - Vol. 287, № 6.
- P. L1154-L1159.
11. Estrogen receptor-alpha as a drug target candidate for preventing lung inflammation / E. Vegeto [et al.] // Endocrinology. - 2010. -Vol. 151, № 1. - P. 174-184.
12. 17beta-estradiol inhibits inflammatory gene expression by controlling NF-kappaB intracellular localization / S. Ghisletti [et al.] // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol. 28, № 8. - P. 2 957-2 968.
13. Frequency of estrogen receptor-1 (ESR-1) gene Ppolymorphism (Pvull and Xbal) in patients with coronary artery disease / R. A. Mariah [et al.] // American Journal of Medical and Biological Research. - 2016. - Vol. 4, № 1. - P. 5-9.
14. Vogel, A. Genetic association of vitamin D receptor polymorphisms with primary biliary cirrhosis and autoimmune hepatitis / A. Vogel, C. P. Strassburg, M. P. Manns // Hepatology. -2002. - Vol. 35. - № 1. - P. 126-131.
15. Особенности распределения частот полиморфных аллелей гена рецептора витамина D в популяциях этнических белорусов / Е. А. Аксенова [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. / Институт генетики и цитологии НАН Беларуси; редколл.: А.В. Кильчевский (гл. ред.) [и др.]. - Т. 21. -Минск: Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, 2016. - С. 71-80.
16. Vitamin D to prevent exacerbations of COPD: systematic review and meta-analysis of individual participant data from randomised controlled trials / D. A. Jolliffe [et al.] // Txorax. -2019. - Vol. 74, № 4. - P. 337-345.
17. Vitamin D receptor gene Fokl but not TaqI, Apal, BsmI polymorphism is associated
with Hashimoto's thyroiditis: a meta-analysis / X. Wang [et al.] / Sci. Rep. - 2017. - Vol. 7. -P. 1-11.
18. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles / N. A. Morrison [et al.] // Nature.
- 1994. - Vol. 367, № 6 460. - P. 284-287.
19. Association of vitamin D receptor gene polymorphisms and Parkinson's disease in Hungarians. / R. Torok [et al.] // Neurosci. Lett. -2013. - Vol. 13, № 551. - P. 70-74.
20. Влияние вариантов генов AGT, TGFB1, ESR1 и VDR на развитие и течение идиопатче-ских интерстициальных пневмоний и саркои-доза органов дыхания / А. С. Улитина [и др.] // Пульмонология. - 2017. - Т. 27. - № 3. -С. 346-357.
21. Association Study of Estrogen Receptor Alpha Gene Polymorphisms with Spontaneous Abortion: Is This a Possible Reason for Unexplained Spontaneous Abortion? [Electronic resource] / N. Anousha [et al.] // Biomed. Res. Int.
- Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pmc/articles/PMC3817802/. - Date of access: 13.09.2019. - doi: 10.1155/2013/256470.
22. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: where do we stand today? / S. Alt-mae [et al.] // Hum. Reprod. Update. - 2011. -Vol. 17, № 6. - P. 813-828.
23. Influence of sex and disease severity on gene expression profiles in individuals with idiopathic pulmonary fibrosis / S. P. McGee [et al.] //
Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. - 2014. - Vol. 5, № 2. - P. 71-86.
24. Diverse Associations between ESR1 Polymorphism and Breast Cancer Development and Progression / S. Ding [et al.] // Clin. Cancer. Res.
- 2010. - Vol. 16, № 13. - P. 3 473-3 484.
25. ESR1 Gene Polymorphisms and Prostate Cancer Risk: A HuGE Review and Meta-Analy-sis / Y.-M. Wang [et al.] // PLoS One - Mode of access: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/arti-cles/PMC3689664/. - Date of access: 27.06.2020.
- doi: 10.1371/journal.pone.0066999.
26. The estrogen receptor 1 gene affects bone mineral density and osteoporosis treatment efficiency in Slovak postmenopausal women / V. Mondockova [et al.] // BMC Med. Genet. -2018. - Vol. 19, № 174. - P. 1-13.
27. Luckhaus, C. Estrogen Receptor 1 gene (ESR1) variants in Alzheimer's disease. Results of a meta-analysis / C. Luckhaus, P. G. Sand // Aging Clin. Exp. Res. - 2007. - Vol. 19, № 2. -P. 165-168.
28. ESR1 PvuII (rs2234693 T > C) polymorphism and cancer susceptibility: Evidence from 80 studies / X. Liu [et al.] // J. Cancer. - 2018. -Vol. 9, № 16. - P. 2 963-2 972.
29. Evidence of a genetic contribution to lung function decline in asthma / G. H. Koppelman [et al.] // Journal of Allergy and Clinical Immunology. - 2011. - Vol. 128, № 3. - P. 479-484.
E. A. Khotko, A. D. Taganovich, A. G. Kadushkin
STUDY OF THE POLYMORPHISMS RS2234693 OF THE ESR1 GENE AND RS731236 OF THE VDR GENE IN PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE
Educational Institution "Belarusian State Medical University" 83 Dzerzhinsky Ave., 220083 Minsk, Republic of Belarus e-mail: qwert.poilk@mail.ru
The frequency of the occurrence of polymorphic variants rs2234693 (PvuII, T^-C) of the ESR1 gene and rs731236 (TaqI, T^-C) of the VDR gene was investigated in 95 patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and in 95 healthy people. A statistically significant increase (p = 0.006) in the frequency of the occurrence of the heterozygous TC genotype rs2234693 in the intron 1 of the ESR1 gene was found in the group of patients with COPD compared to the group of conditionally healthy people. The heterozygous TC genotype rs2234693 is associated with chronic obstructive pulmonary disease (OR = 5.21 CI = 1.43-19.0) was established. As for the rs731236 polymorphism of the VDR gene, there were no significant differences in the frequency of occurrence of one of the genotypes in patients with COPD and healthy people.
Keywords: gene polymorphism, chronic obstructive pulmonary disease, receptors, estrogens, calcitriol.
Дата поступления в редакцию: 5 сентября 2022 г.
