CC BY
166
© Коллектив авторов, 2007 УДК 612.79:599.323.4:611-018
ИЗУЧЕНИЕ ПЕНЕТРИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЛИПОСОМ
Е.Н. Шиханова1, В.С Боташева2, В.А. Батурин2 1 Краевой клинический кожно-венерологический диспансер 2Ставропольская государственная медицинская академия
Под проницаемостью кожи понимают ее способность пропускать или задерживать различные вещества или живые тела [2]. Для проникновения в кожу имеется два альтернативных пути: через тонкий, но относительно непроницаемый роговой слой (трансдермальный путь) [3, 9] или через волосяные фолликулы, включая сальные железы, и экк-ринные потовые железы («шунт») [5, 6].
Барьерные свойства эпидермиса определяются, главным образом, кератином [3]. Большую роль играют липиды эпидермиса и кожное сало, которые герметизируют поры между пластинками кератина и препятствуют смачиванию кожи водой и другими жидкостями [1]. Электростатические свойства кожи также участвуют в механизме задержки контактирующих с ней веществ. Наиболее важная в функциональном отношении часть кожного барьера гистологически совпадает с блестящим слоем. Этот тонкий слой обладает большой механической прочностью и устойчивостью к химическим веществам [2].
Для большинства лекарственных препаратов роговой слой эпидермиса является труднопреодолимым барьером. Наибольшей проникающей способностью обладают липиды и жирорастворимые вещества. Более свободное прохождение через кожу жиров и растворимых в них веществ объясняется тем, что в роговом слое, помимо кератина, содержится до 30% липидов [1].
Проникновению лекарственных веществ в кожу способствуют различные «переносчики», к которым можно отнести липосомы [8, 10]. Однако возможность использования липосом в качестве транспортеров лекарственных средств недостаточно изучена.
Цель исследования: определить глубину проникновения липосом в кожу при их наружном применении у лабораторных животных (мышей).
Материал и методы. Для определения проникающей способности липосом использовали 1% раствор трипанового синего, относящийся к кислотным красителям. Краситель в липосомы включали методом обращения фаз. Низкая молекулярная масса краски (М=947д) позволила удалить не включившийся материал из взвеси липосом методом диализа.
Для определения глубины проникновения липосом в толщу кожи брали 40 белых нелинейных мышей массой 50-60 г. На участке кожи спины, площадью 20 мм2, безопасной бритвой удаляли волосы. Животные, взятые в эксперимент, были разделены на четыре группы по 10 мышей в каждой. Первой группе мышей наносили на-
кожно 1% раствор трипанового синего. Второй группе
- гель с добавлением трипанового синего. В третьей группе мышей использовали липосомальный гель с включением 1% раствора трипанового синего. Четвертой группе наносили липосомальную эмульсию с включением трипанового синего.
При помощи дерматома производили биопсию исследуемого участка кожи вместе с подкожно-жировой клетчаткой. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 10 дней, затем промывали и проводили через спирты возрастающей крепости. После проводки кусочки заливали в парафин, готовили срезы толщиной 0,5-0,6 микрон. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон.
Результаты. Кожа мыши очень тонкая, состоит из 3 слоев: эпидермис, дерма и гиподерма (подкожножировая клетчатка). Эпидермис кожи мыши состоит из 4 слоев: базальный, шиповатый, зернистый и роговой. В эпидермисе мыши основную массу эпидермальных клеток составляют кератиноциты, встречаются мела-ноциты, внутриэпидермальные макрофаги. Базальные клетки располагаются на базальной мембране в 2-3 ряда, кубической формы, в некоторых местах низкой цилиндрической формы. Базальные эндокриноциты окрашиваются базофильно, соединены между собой десмосомами. Базальная часть клеток располагается на базальной мембране.
Шиповатый слой представлен кератиноцитами полигональной формы. Эти клетки больше базальных и располагаются в 3-4 ряда. В верхних слоях шиповатого слоя кератиноциты уплощаются и располагаются параллельно поверхности кожи. Ядра их уплощенной формы. В цитоплазме имеются плотные гранулы овальной формы. Между клетками имеются плотные контакты типа десмосом. Наличие большого количества десмосом обеспечивает образование шипиков. Помимо десмосом прочные клеточные контакты обеспечивает специфический белок (десмоикин), который обладает адгезивными свойствами. В клетках шиповатого слоя содержатся многочисленные тонофибриллы, которые образуют сеть. Сеть тонофибрилл расположена вокруг ядра. В цитоплазме поверхностно расположенных кера-тоцитов значительно увеличивается количество плотных гранул овальной формы - кератиносом (гранулы Одланда), окруженных мембраной. Кератиносомы располагаются равномерно по всей цитоплазме.
Зернистый слой образован эпителиоцитами, которые располагаются в 2-3 ряда, имеют уплощенную
Рис. 1. Отложение глыбок трипанового синего на поверхности эпидермиса.
Окраска: гематоксилином и эозином.х100.
Рис. 2. Глыбки трипанового синего в толще шиповатого слоя эпидермиса (гель с трипановым синим).
Окраска: гематоксилином и эозином.х400.
Рис. 3. Скопление липосом с красителем в поверхностных слоях дермы (липосомальный гель с включением трипанового синего).
Окраска: пикрофуксином по Ван Гизон. Х400.
форму. В цитоплазме эпителиоцитов зернистого слоя располагаются кератогиалиновые гранулы. Гранулы имеют овальную форму и содержат белок филагрин. В верхних клетках зернистого слоя кератиносомы располагаются под оболочкой, из них в межклеточное пространство выбрасываются вещества, из которых формируется водонепроницаемый барьер и происходит цементирование клеток между собой. Кератиноциты зернистого слоя в верхних отделах имеют форму четыр-надцатигранника.
Роговой слой эпидермиса полностью состоит из четырнадцатигранников (корнеоцитов), между которыми располагается межклеточный «цемент». В межклеточном пространстве рогового слоя имеются мембраны, которые объединяются в многослойные пласты. Пласты плотно соединены между собой и с корнеоцитами. Роговой слой образован из безъядерных, упорядоченно расположенных клеток, заключенных в межклеточное вещество. Клетки рогового слоя постоянно слущивают-ся.
Под базальной мембраной эпидермиса располагается дерма. Дерма состоит из 2-х слоев: сосочкового и сетчатого. Сосочковый слой образован рыхлой волокнистой соединительной тканью, которая впячивается в эпидермис в виде сосочков. Сетчатый слой образован плотной волокнистой неоформленной соединительной тканью. Коллагеновые и эластические волокна сетчатого слоя переплетаются между собой и образуют сеть. В сосочковом слое дермы хорошо развито основное вещество. В обоих слоях дермы встречаются клеточные элементы, фибробласты, макрофаги, плазматические клетки, липоциты, тучные клетки, лейкоциты.
Сальные железы у мышей располагаются возле корня волоса, а их выводные протоки открываются в волосяную воронку. Это простые альвеолярно разветвленные железы.
При гистологическом исследовании в первой экспериментальной группе на поверхности эпидермиса видны отложения глыбок трипанового синего. В эпидермисе, дерме и в придатках кожи трипановый синий не определяется (рис. 1).
Во II экспериментальной группе животных при нанесении на кожу геля с добавлением раствора три-панового синего гистологическая структура не нарушена. Сохраняется гистоархитектоника всех слоев. На поверхности эпидермиса имеются отложения красителя синего. Эти отложения более массивные, чем в I экспериментальной группе. Глыбки трипанового синего встречаются на поверхности рогового слоя, а также в толще эпидермиса: в шиповатом слое и на границе шиповатого и базального слоев (рис. 2). Определяется четкая базальная мембрана, которая хорошо сохранена. В сосочковом и сетчатом слоях дермы трипановый синий не определяется. Сальные железы хорошо развиты, краситель в просвете желез не визуализируется.
В третьей экспериментальной группе животных при нанесении липосомального геля с включением в липосомы трипанового синего гистологическая структура кожи не нарушена. Сохранена гистоархитектоника всех слоев эпидермиса. В поверхностных слоях дермы определяются скопления липосом с красителем (рис. 3).
Наличие описанных скоплений свидетельствует о более глубоком проникновении липосомального геля в III экспериментальной группе. Липосомальный гель проникает через все слои эпидермиса и накапливается в поверхностных слоях дермы. Кроме того, липосомы с красителем определяются в волосяной воронке и в просвете сальной железы (рис. 4).
В 4-й экспериментальной группе на кожу мышей
Рис. 4. Скопление липосом с красителем в просвете сальных желез (липосомальный гель с включением трипанового синего).
Окраска: гематоксилином и эозином.х400.
Рис. 5. Скопления липосомальной эмульсии с включением трипанового синего в глубоких слоях дермы.
Окраска: гематоксилином и эозином.х400.
Рис. 6. Скопления липосом с красителем в просвете сальных желез и вокруг сосудов дермы (липо-сомальная эмульсия с включением трипанового синего): а) в просвете сальных желез, б) в стенке капилляра. Окраска: гематоксилином и эозином.х400.
наносили липосомальную эмульсию с включением в липосомы трипанового синего. Скопления липосом с красителем обнаружены во всех слоях дермы (рис. 5).
В этой группе лабораторных животных липосо-мальная эмульсия проникает глубоко в кожу: проходит через все слои эпидермиса, базальную мембрану, сосочковый слой дермы и накапливается в сетчатом слое. Большое количество скоплений липосом с красителем обнаружено вокруг сосудов и в сальных железах (рис. 6).
В проведенном исследовании установлено, что иммобилизированный в липосомы трипановый синий проникает гораздо глубже в кожу, чем при применении одного красителя или геля с красителем. При этом наибольшей проникающей способностью обладает липо-сомальная эмульсия. Полученные данные совпадают с результатами некоторых авторов, которые определяли глубину проникновения липосомальных лекарственных средств в экспериментально выращенную кожу [4, 7].
Выводы
1. При наружном использовании трипановый синий не проникает в кожу.
2. Гель способствует проникновению трипанового синего в эпидермис.
3. Иммобилизированный в липосомы трипановый синий проникает в эпидермис, дерму, в волосяной фолликул и в просвет сальной железы.
4. Наиболее глубоко в кожу проникает трипановый синий, включенный в липосомальную эмульсию. Он проходит через все слои кожи и располагается глубоко в сетчатом слое дермы. Скопления его обнаруживаются вблизи сосудов и даже в стенке сосудов.
Литература
1. Скрипкин, Ю.К. Кожные и венерические болезни / Ю.К. Скрипкин, В.Н. Мордовцев. - М., 1999. - Т. 1. - 887 с.
2. Чернуха, А.М. Кожа (Строение, функции, общая патология и терапия) / А.М. Чернуха, Е.П. Фролова. - М., 1982.
- С. 129-134.
3. Elias, P.M. Epidermal lipids, barrier function, and desquamation / P.M. Elias // J. Invest. Dermatol. - 1983. - Vol. 80.
- P. 44-49.
4. Fluhr, J.W. Antibacterial efficacy of benzoyl peroxide in phospholipid liposomes. A vehicle-controlled, comparative study in patients with papulopustular acne / J.W. Fluhr, O. Barsom, W. Gehring // Dermatology. - 1999. - Vol. 198. - № 3 - P. 273-277.
5. Li, L. Product-delivering liposomes specifically target hair follicles in histocultured intact skin / L. Li, L. Margolis, V. Lishko // In. Vitro. Cell. Dev. Biol. - 1992. - Vol. 28. - P. 679-681.
6. Lieb, L. Topical delivery enhancement with multilamellar liposomes into pilo-sebaceous units / L. Lieb, C. Ramach-andran, K. Egbaria. // J. Invest. Dermatol. - 1992. - Vol. 99.
- P. 108-113.
7. Schaller, M. Interaction of cultured human keratinocytes with liposomes encapsulating silver sulphadiazine: proof of the uptake of intact vesicles / M. Schaller, H. Korting, M. Schmid // Br. J. Dermatol. - 1996. - Vol. 134. -P. 445-450.
8. Sramlova, J. Electron microscopic demonstration ofthe penetration of liposomes through skin / J. Sramlova, K. Blazek, M. Bartackova // Folia Biol (Praha). - 1997. - Vol. 43. - №
4. - P. 165-169.
9. Stoughton, R.B. Percutaneous absorption of drugs / R.B. Stoughton // Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. - 1989. - Vol. 29. - P. 55-69.
10. Stozek, Т. Badanie wplywu zamkniecia triamcinolonu w liposomach na resorpcie przez skore / Т. Stozek, L. Krowc-zynski // Farm. pol. - 1983.-Vol. 39. - № II.-P. 651-656.
ИЗУЧЕНИЕ ПЕНЕТРИРУЮЩЕЙ STUDYING OF LIPOSOMES
способности липосом penetrating ABILITY
Е.Н. ШИХАНОВА, В.С. БОТАШЕВА, SCHIKHANOVA E.N. ,
В.А. БАТУРИН BOTASCHEVA V.S. , BATURIN V.A.
Проведено изучение проникающей способности липосом в кожу мышей. Лабораторные животные были разделены на четыре группы, по 10 мышей в каждой. Первой группе мышей наносили накожно 1% раствор трипанового синего. Второй группе - гель с добавлением красителя. В третьей экспериментальной группе использовали липосомальный гель с включением трипанового синего. Четвертой группе наносили липосомальную эмульсию с включением трипанового синего. В результате гистологического исследования установлено, что трипановый синий не проникает в кожу. Применение геля способствует проникновению красителя в эпидермис. Иммобилизированный в липосомы трипановый синий проникает во все слои и в придатки кожи.
Ключевые слова: липосомы, лабораторные мыши, пе-нетрация в слои кожи
Skin penetrating ability of liposomes was studied in mice. 40 laboratory animals have been divided into four equal groups. 1 % solution of trypan blue was applied on the skin in the first group. In the second group skin gel with addition of the stain was applied. In the third experimental group liposomal skin gel with inclusion of the trypan blue was used. The fourth group received liposomal skin emulsion containing trypan blue. The histologic study showed that trypan blue does not get into skin of mice. Application of gel promotes penetration of stain into the epidermis. Trypan blue being immobilized in the liposomes gets into all layers and appendages of skin.
Key words: liposomes, laboratory mice, penetration through skin layers
