CC BY
107
УДК 577.12(665.931.7:006.354):62-405.8]616.24
DOI: 10.12737/article_5d0acbcea40c00.87521521
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ СВОЙСТВ ПОРИСТОГО СКАФФОЛДА ЖЕЛАТИНА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ ЛЕГКИХ
А.А.Яценко12, В.А.Кушнарев2,3, Д.В.Леонов1, Е.М.УСТИНОВ1, С.С.Целуйко1
1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Амурская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95 2Общество с ограниченной ответственностью «Ай Кью Биофабрик», 121205, г. Москва, Сколково,
Большой бульвар, 42, корп. 1 3Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н.Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 197758, г. Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68
РЕЗЮМЕ
Использование искусственно созданных 3D скаффолдов на основе коллагена или желатина, повторяющих условия микроокружения живого организма, становится все более распространенным. Этому способствует углубление понимания межклеточных взаимодействий in vivo, что позволяет искусственно сформировать подходящую для клеток гистоархитектонику и микроокружение скаффолда. Желатин, как производное коллагена является одним из перспективных недорогих материалов для созданиях таких матриц. Цель исследования - изучить морфологические, биодеградируемые свойства, а также скорость деградации скаффолдов in vivo и in vitro желатин-глутарового полимера, модифицированного дигидрокверцетином и арабинога-лактаном. Изучение морфологических свойств скаффолда проводили с помощью гистологического исследования с окраской гематоксилин-эозин и сканирующей электронной микроскопией. Изучение скорости деградации скаффолда проводили при температуре 37°С и воздействии ферментов (трипсин, коллагеназа). Деградацию in vivo изучали морфологически после подкожной имплантации исследуемого скаффолда лабораторным крысам. При морфологическом исследовании установлено, что скаффолд имеет высокую пористость - до 3545%. Скаффолд обладает высокой термостабильностью и не деградирует при 37°С. При воздействии растворами трипсина и коллагеназы I типа, деградация наблюдается в течение 540±15 и 200±10 минут, соответственно. При морфологическом исследовании деградации in vivo, скаффолд полностью исчезает в течение 3 недель, заменяясь грануляционной тканью. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования же-латин-глутарового скаффолда, модифицированного дигидрокверцетином и арабиногалактаном, для исследований в области тканевой инженерии легких.
Ключевые слова: скаффолд, тканевая инженерия легких, пористость, желатин, дигидрокверцетин.
SUMMARY THE STUDY OF MORPHOLOGICAL AND
BIODEGRADABLE PROPERTIES OF POROUS SCAFFOLD OF GELATIN FOR USE IN TISSUE ENGINEERING OF LUNG
A.A.Yatsenko12, V.A.Kushnarev2'3, D.V.Leonov1, E.M.UstinovS S.S.Tseluyko1
'Amur State Medical Academy, 95 Gorkogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation 2Scientific Research Center "IQ Biofabric", 42/' Bolshoi Boulevard, Skolkovo Innovation center, Moscow, '21205, Russian Federation
3N.N.Petrov National Medical Research Center of Oncology, 68 Leningradskaya Str., Pesochny, St Petersburg, '97758, Russian Federation
The use of collagen or gelatin-based scaffolds mimicking the in vivo conditions of the microenvironment is beginning to be used more widely. This is facilitated by the deepening of the understanding of cell-cell interactions in vivo, which allows to artificially form a his-toarchitecture suitable for cells and the microenvironment of the scaffold. Gelatin is a collagen derivative. This is one of the most promising and inexpensive materials for creating scaffolds. The purpose of the study was to investigate the morphological, biodegradable and antibacterial properties, as well as the rate of scaffold degradation in vivo and in vitro of glu-taraldehyde-crosslinked gelatin polymer modified by dihydroquercetin and arabinogalactan. The study of the morphological properties of the scaffold was performed using histological examination with hematoxy-lin-eosin staining and scanning electron microscopy. The study of the rate of degradation of the scaffold was performed at 37°C and the action of enzymes (trypsin, collagenase). In vivo degradation was studied morphologically after subcutaneous implantation of the studied scaffold to laboratory rats. When morphological study, the scaffold has a high porosity - up to 35-45%. Scaffold shows high thermal stability and does not degrade at 37°C. When exposed to trypsin and type I collagenase solutions, degradation is observed for 540±15 and 200±10 minutes, respectively. When the morphological study of in vivo degradation, scaffold completely degrades within 3 weeks, being replaced by the granulation tissue. The results obtained indicate the possibility
of using glutaraldehyde-crosslinked gelatin scaffold modified by dihydroquercetin and arabinogalactan for research in tissue engineering of the lungs.
Key words: scaffolds, lung tissue engineering, porosity, gelatin, dihydroquercetin.
Коллаген присутствует во всех типах соединительной ткани в легких, представляя одну из самых изученных молекул внеклеточного матрикса. Он является одним из основных компонентов легких и костной ткани, и занимает до 25% сухого веса млекопитающих. Существует 29 типов коллагена, имеющих схожую двухцепочечную структуру. Коллаген типов I, II, III, V и XI формирует структуру волокон, состоящую из а-цепей. Коллаген и его производные активно используются в биомедицине. Существуют различные варианты применения - от инъекционных форм до матриц, используемых в тканевой инженерии [9]. В настоящее время для создания тканеинженерных конструкций активно применяется коллаген I [6].
Желатин - гидролизат коллагена, сохраняющий ряд его биологических и физико-химических свойств. Это делает желатин перспективным материалом для биоинженерии. В зависимости от метода гидролиза коллагена, выделяют желатин А (гидролиз кислотой) и желатин В (гидролиз щелочью) [8]. В аминокислотном составе желатина отсутствует тирозин и триптофан, а уровень содержания фенилаланина минимальный. Это обусловливает низкий риск появления ароматических радикалов, сопряженных с иммуногенностью [13]. В связи с этим желатин обладает низкой иммуногенностью по сравнению с коллагеном. Биомеханические свойства желатина меняются при его взаимодействием с веществами, модифицирующими его структуру. Биосовместимость желатина и возможная деградация кол-лагеназами в ткани с моделированием in vivo позволяют использовать его для биомедицинских исследований [14].
Скаффолд - основа тканеинженерной конструкции легких и других органов, создаваемая на основе желатина, и необходимая для прикрепления, жизнедеятельности и пролиферации клеточных элементов. Его создание требует решения ряда задач на тканевом уровне: сформировать подходящее для клеток микроокружение из межклеточного вещества, обеспечить контакты «клетка-внеклеточный матрикс» и определить градиент растворимых и нерастворимых факторов (VEGF, PDGF, FGF и др.). Для решения указанных задач скаффолд на основе желатина должен сохранять свою архитектуру при температуре до 37°С, повышенной влажности и быть устойчивым в отношении про-теолитических ферментов. Подобные требования обусловлены процессами, происходящими в тканях при повреждении и регенерации. Для улучшения доставки питательных веществ и кислорода, а также возможности создания межклеточных контактов, скаффолд должен иметь пористую структуру [12, 17]. Создание пористой структуры скаффолда возможно несколькими путями: различные варианты 3D-6to-печати, стереолитография и т.д. [11]. В настоящее
время выделяют ряд методов повышения стабильности желатина для тканевой инженерии: химическое сшивание с помощью альдегидов кислот, использование ферментов и изменение температуры желатинизации [16].
Для получения порогенных скаффолдов в тканевой инженерии широко используется метод выщелачивания. Предложено несколько способов формирования необходимого размера пор на разных типах материала и этапах применения в моделировании тканей [15]. Кроме того, для применения скаффолда в клинической практике может быть перспективным использование ряда флавоноидов, придающих скаффолду противовоспалительные, антибактериальные и противовирусные свойства. В качестве одного из таких веществ мы рассматриваем производное полифенола кверцетина - ди-гидрокверцетин, природный антиоксидант, обладающий всеми вышеперечисленными эффектами [18]. Ряд исследований показал, что кверцетин и его производные обладают способностью вызывать химическую сшивку коллагена, повышая механическую стабильность скаффолда c использованием желатина [7]. Дигидрокверцетин вызывает снижение оксидатив-ного стресса, повышает миграцию фибробластов в зону повреждения и способствует синтезу коллагена [4]. Полисахарид арабиногалактан также обладает сильными антиоксидантными свойствами и проявляет иммуномодулирующую активность [3]. Конъюгация дигидрокверцетина с арабиногалактаном способствует растворимости дигидрокверцетина в водных растворах [1].
Цель исследования - изучить морфологические, биодеградируемые свойства, а также скорость деградации скаффолдов in vivo и in vitro желатин-глутаро-вого полимера, модифицированного дигидро-кверцетином и арабиногалактаном.
Материалы и методы исследования
Скаффолды были изготовлены из пищевого желатина (ЗАО «Компания Проксима», Россия). Для создания пористой структуры использовали хлорид натрия (ООО «АО РЕАХИМ», Россия). В качестве антиокси-данта использовался препарат Лавитол-В (АО «Аме-тис», Россия), который является смесью дигидрокверцетина и арабиногалактана, с растворимостью в воде 8 г/л.
Нами было приготовлены стандартизированные по площади образцы скаффолдов: 26 пористых желатиновых скаффолдов методом выщелачивания хлорида натрия, 26 образцов пористых желатиновых скаффолдов с модификацией Лавитол-В, а также 10 образцов желатиновых скаффолдов без химической сшивки. Размеры скаффолдов - 5^5x2 мм. Скаффолды получали путем нанесения разогретого до 56°С 20% раствора желатина на поверхность слоя хлорида натрия с размером кристаллов от 4 до 50 мкм в чашке Петри, в весовом соотношении 1:9. Для получения скаффолдов с Лавитол-B при приготовлении 20% раствора желатина добавляли Лавитол-B в концентрации 0,5% от общей массы рас-
твора. Чашка Петри помещалась в термостат при 37°С на 24 часа. После чего производилась химическая сшивка образца 2,5% раствором глутарового альдегида (Sigma Aldrich, Германия), приготовленного на фос-фатно-солевом буфере при pH 7,4, путём добавления его в чашку Петри [10]. Выщелачивание хлорида натрия проводилось с помощью последовательной инкубации образцов в деионизированной воде на протяжении 48 часов со сменой растворов каждые 24 часа.
Структура полученных скаффолдов оценивалась с помощью светового микроскопа (Olympus BX46, Япония) и сканирующего электронного микроскопа (Hita-chi-S3400N, Япония). Скаффолды фиксировались в 10% забуференном формалине, заливались в парафин с последующим этапом микротомии и окраски гематоксилином и эозином по стандартной схеме для све-тооптической микроскопии. Пробоподготовка для сканирующей электронной микроскопии осуществлялась последовательной дегидратацией и напылением золота на образцы скаффолдов по стандартному протоколу [5]. Исследование проходило при высоком вакууме, в стандартном режиме работы сканирующего электронного микроскопа. Проводилась оценка структуры, количества и размеров пор, наличия перемычек в скаффолде.
Оценка термостабильности осуществлялась путём погружения исследуемых скаффолдов в физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия) с температурой 23°С и 37°С. Изменения оценивались визуально с фиксацией точки начала растворения скаф-фолда и точки его полной диссоциации в растворе.
Для исследования ферментативной стабильности мы использовали 0,25% трипсин (Sigma Aldrich, Германия) и коллагеназу I типа (>125 CDU/мг) (Sigma Ald-rich, Германия). Исследование ферментативной устойчивости осуществлялось путём инкубации пористых скаффолдов, массой 0,5 г при 37°С и 23°С в 0,25% раствора трипсина (0,1 мг/мл) и растворе коллагеназы I типа (2 мг/мл). Изменения оценивались визуально и по динамической массе скаффолдов. Фиксировалось время после начала растворения скаффолда и его полной диссоциации в растворе.
Были взяты 6 белых аутбредных крыс самцов, массой около 200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария Амурской ГМА. Исследование выполнялось с соблюдением этических требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными (Приказ №755 МЗ ССР от 12.08.1977 г.). Наркоз осуществлялся с использованием диэтилового эфира (Sigma Aldrich, Германия). Для имплантации пористые скаффолды с Лавитол-В подвергались паровой стерилизации (121°С, давление 2 атмосферы, 30 минут). Имплантация осуществлялась подкожно в латеральную часть спины с правой стороны. На коже делали разрез до подкожной жировой клетчатки до 10 мм в длину и формировали подкожные карманы с помощью хирургических ножниц. После погружения скаффолдов в подкожный карман, рану послойно ушивали с помощью хирургической иглы и ниток (кетгут).
Выведение животных проводилось на 7, 14 и 21 сутки эксперимента путём глубокого усыпления диэти-ловым эфиром. Полученные участки кожи фиксировали в 10% забуференном формалине в течение суток и подвергали стандартному морфологическому исследованию с использованием программы для морфомет-рического анализа «QPath» (США) [2].
Статистическую обработку материалов производили с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office 2016) в среде операционной системы Windows 10. Статистически значимое различие в группах между количественными параметрами с распределением, соответствующим нормальному закону, оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Дескриптивные статистики в тексте представлены как М±т, где М - среднее арифметическое, m - стандартная ошибка среднего. Различия во всех случаях считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные с помощью метода выщелачивания образцы скаффолдов при гистологическом исследовании имеют высокую пористость, с размером пор от 1 до 100 мкм (рис. 1). Поры занимают от 35 до 45% площади скаффолда. При исследовании образцов с помощью сканирующей электронной микроскопии, нативный желатин имеет монолитную структуру без пор (рис. 2). Скаффолд, полученный методом выщелачивания, характеризуется большим количеством пор различного размера и соединяющих их каналов (рис. 3). Мы не нашли значительных отличий в морфологической структуре пористых скаффолдов с Лавитол-В в сравнении с пористых скаффолдами без Лавитол-B, что свидетельствовало об отсутствии негативного влияния добавки.
При изучении устойчивости к протеолитическим ферментам были получены следующие результаты (табл.). Желатин без модификаций демонстрировал наименьшую устойчивость к воздействию трипсина и коллагеназы. В то же время, при температуре 37°С 20% пористый скаффолд из желатина показывал лучшие результаты по устойчивости к воздействию ферментов. Анализ времени до полного распада образцов выявил достоверные различия в ферментативной устойчивости между разными вариантами модификаций скаф-фолдов и скаффолдами из нативного желатина (p<0,05).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что образцы, приготовленные методом выщелачивания, имели достоверно значимые отличия по времени ферментативной деградации в сравнении со скаффолдами из нативного желатина. При этом в ходе эксперимента в течение 24 часов при 37°С не было выявлено никаких изменений структуры во всех образцах скаффолдов, полученных методом выщелачивания. Данные свидетельствуют о том, что использование хлорида натрия и Лавитол-B не оказывало достоверного влияния на термостабильность желатина, при фиксации последнего глутаровым альдегидом.
Рис.1
Рис.2
Рис. 1. Пористый скаффолд на основе 20% раствора желатина, приготовленного методом выщелачивания. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40.
Рис. 2. Нативный скаффолд на основе 20% раствора желатина. Сканирующая электронная микроскопия. Напряжение: 30 кВ. Увеличение: 73.
Рис. 3. Пористый скаффолд на основе 20% раствора желатина, полученный методом выщелачивания. Сканирующая электронная микроскопия. Напряжение: 30 кВ. Увеличение: 100.
Рис.3
Таблица
Ферментативная деградация скаффолдов
Название образца Время полного распада образцов скаффолдов при 37°С (представлено среднее арифметическое при п=3)
Вид ферментативной деградации
Трипсин (0,25 мг/мл) Коллагеназа I типа (2 мг/мл)
Желатин 20% 4±0,5 минут 30±5 минут
Желатин 20% + №С1 600±15 минут* 240±10 минут*
Желатин 20% + 0,5% Лавитол-В + №С! 540±15 минут* 200±10 минут*
Примечание: * - достоверность различий по времени ферментативной деградации между разными вариантами модификаций скаффолдов и скаффолдами из нативного желатина (р<0,05).
Исследование биодеградации скаффолдов на крысах показало следующие результаты. В месте имплантации пористого скаффолда с Лавитол-В на 7 сутки развивалась воспалительная реакция с появлением гигантских многоядерных клеток инородных тел, с фокусами лимфогистиоцитарной инфильтрации (рис. 4). Кроме того, на 14 сутки в структуре скаффолда появлялись элементы соединительной ткани с тонкими нежными волокнами коллагена, возрастало количество капилляров, объем скаффолда уменьшался. На 21
сутки эксперимента в месте имплантации исчезали практически все структуры скаффолда, уменьшалась лимфогистиоцитарная инфильтрация, грубоволокни-стая соединительная ткань отсутствовала (рис. 5). В тканях развивалась только неспецифическая реакция на трансплантат и отмечались изменения, характерные для физиологической регенерации. Выявленные результаты свидетельствовали об отсутствии адаптивного иммунного ответа на имплантированный скаффолд.
Рис. 4. Микрофотография имплантированного пористого скаффолда желатина под кожу крысе. 7 сутки. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40.
Рис. 5. Микрофотография имплантированного пористого скаффолда желатина под кожу крысе. 21 сутки. В зоне имплантации единичные фрагменты скаффолда, слабовыраженные фокусы гистиоцитарной инфильтрации на фоне выраженной васкуляризации в этой зоне. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: 40.
Полученные данные имеют значение для тканевой инженерии и 3Б-клеточного культивирования. Высокая пористость и структура скаффолда с возможностью регулирования размера пор, его постепенная биодеградация in vitro позволяют использовать скаффолд в научных исследованиях, связанных с изучением легких при различных патологических состояниях. Имеющиеся поры и каналы, соединяющие их, создают условия для межклеточного взаимодействия с учетом градиента растворимых и нерастворимых факторов (адгезионные участки желатина, цитокины, факторы роста и пр.). Скаффолд обладает низкой иммуноген-ностью и после имплантации in vitro полностью замещается соединительной тканью, без формирования хронического грануляционного воспаления. Проведённые исследования термостабильности порогенных скаффолдов показали, что образцы не деполимери-зуются при 37°С, что позволяет использовать их для тканевой инженерии легких in vivo.
ЛИТЕРАТУРА
1. Супрамолекулярный комплекс, обладающий противовоспалительной и ангиопротекторной активностью и способ его получения: пат. 2533231 RU /
авторы и заявители В.С.Остронков, С.А.Лашин; патентообладатели Остронков В.С., Лашин С.А.; заявл. 14.05.2013; опубл. 20.11.2014.
2. Bankhead P., Loughrey M., Fernández J., Dom-browski Y., McArt D., Dunne P., McQuaid S., Gray R.T., Murray L.J., Coleman H.G., James J.A., Salto-Tellez M., Hamilton P.W. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis // Sci. Rep. 2017. Vol.7, №1. Р.816878. doi: 10.1038/s41598-017-17204-5
3. Dion C., Chappuis E., Ripoll C. Does larch arabino-galactan enhance immune function? A review of mechanistic and clinical trials // Nutr. Metab. (Lond). 2016. Vol.13, Р.28. doi: 10.1186/s12986-016-0086-x
4. Doersch K., Newell-Rogers M. The impact of quercetin on wound healing relates to changes in aV and P1 integrin expression // Exp. Biol. Med. (May wood). 2017. Vol.242, №14. Р. 1424-1431. doi: 10.1177/1535370217712961
5. Fischer E., Hansen B., Nair V., Hoyt F., Dorward D. Scanning Electron Microscopy // Curr. Protoc. Microb. 2012. Vol.25, Iss.1. P.2B.2.1-2B.2.47. doi: 10.1002/9780471729259.mc02b02s25
6. Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens - structure,
function, and biosynthesis // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2003. Vol.55, №12. P.1531-1546. doi:
10.1016/j.addr.2003.08.002
7. Kim Y., Tarahovsky Y., Gaidin S., Yagolnik E., Mu-zafarov E. Flavonoids determine the rate of fibrillogenesis and structure of collagen type I fibrils in vitro // Int. J. Biol. Macromol. 2017. Vol.104, Pt.A. P.631-637. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.06.070
8. Lee B., Lum N., Seow L., Lim P., Tan L. Synthesis and characterization of types A and B gelatin methacryloyl for bioink applications // Materials (Basel). 2016. Vol.9, №10. P.E797. doi: 10.3390/ma9100797
9. Lee C., Singla A., Lee Y. Biomedical applications of collagen // Int. J. Pharm. 2001. Vol.221, №1-2. P. 1-22. doi: 10.1016/s0378-5173(01)00691-3
10. Maji K., Dasgupta S., Pramanik K., Bissoyi A. Preparation and evaluation of gelatin-chitosan-nanobio-glass 3d porous scaffold for bone tissue engineering // Int. J. Biomater. 2016. Vol.2016. P.9825659. doi: 10.1155/2016/9825659
11. Murphy C., O'Brien F. Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminog-lycan scaffolds // Cell Adh. Migr. 2010. Vol.4, №3. P.377-381. doi: 10.4161/cam.4.3.11747
12. Murphy C., Haugh M., O'Brien F. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering // Biomaterials. 2010. Vol.31, №3. P.461-466. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.09.063
13. Rose J., Pacelli S., Haj A., Dua H., Hopkinson A., White L., Rose F. Gelatin-based materials in ocular tissue engineering // Materials (Basel). 2014. Vol.7, №4. P.3106-3135. doi: 10.3390/ma7043106
14. Tondera C., Hauser S., Kruger-Genge A., Jung F., Neffe A., Lendlein A., Klopfleisch R., Steinbach J., Neuber C., Pietzsch J. Gelatin-based hydrogel degradation and tissue interaction in vivo: insights from multimodal preclin-ical imaging in immunocompetent nude mice // Theranostics. 2016. Vol.6, №12. P.2114-2128. doi: 10.7150/thno.16614
15. Tran R., Naseri E., Kolasnikov A., Bai X., Yang J. A new generation of sodium chloride porogen for tissue engineering // Biotechnol. Appl. Biochem. 2011. Vol.58, №5. P.335-344. doi: 10.1002/bab.44
16. Van Vlierberghe S. Crosslinking strategies for porous gelatin scaffolds // J. Mater. Sci. 2016. Vol.51, Iss.9. P.4349-4357. doi: 10.1007/s10853-016-9747-4
17. Yang S., Leong K., Du Z., Chua C. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors // Tissue Eng. 2001. Vol.7, №6. P.679-689. doi: 10.1089/107632701753337645
18. Zhang Y., Yu J., Dong X., Ji H. Research on characteristics, antioxidant and antitumor activities of dihydro-quercetin and its complexes // Molecules. 2017. Vol.23, №1. P.E20. doi: 10.3390/molecules23010020
REFERENCES
1. Ostronkov VS., Lashin S.A. Patent 2533231 RU. Su-pramolecular complex with anti-inflammatory and angio-
protective activity and method for producing it; published 11.20.2014 (in Russian).
2. Bankhead, P., Loughrey, M., Fernández, J., Dom-browski, Y., McArt, D., Dunne P., McQuaid S., Gray R.T., Murray L.J., Coleman H.G., James J.A., Salto-Tellez M., Hamilton P.W. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci. Rep. 2017; 7(1):816878. doi: 10.1038/s41598-017-17204-5
3. Dion C., Chappuis E., Ripoll C. Does larch arabino-galactan enhance immune function? A review of mechanistic and clinical trials. Nutr. Metab. (Lond). 2016; 13:28. doi: 10.1186/s12986-016-0086-x
4. Doersch K., Newell-Rogers M. The impact of quercetin on wound healing relates to changes in aV and P1 integrin expression. Exp. Biol. Med. (Maywood) 2017; 242(14):1424-1431. doi: 10.1177/1535370217712961
5. Fischer E., Hansen B., Nair V., Hoyt F., Dorward D. Scanning electron microscopy. Curr. Protoc. Microb. 2012; 25(1):2B.2.1-2B.2.47. doi: 10.1002/9780471729259. mc02b02s25
6. Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens - structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2003; 55(12):1531-1546. doi: 10.1016/j.addr.2003.08.002
7. Kim Y., Tarahovsky Y., Gaidin S., Yagolnik E., Mu-zafarov E. (2017). Flavonoids determine the rate of fibrillogenesis and structure of collagen type I fibrils in vitro. Int. J. Biol. Macromol. 2017; 104(PtA):631-637. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.06.070
8. Lee B., Lum N., Seow L., Lim P., Tan L. Synthesis and characterization of types A and B gelatin methacryloyl for bioink applications. Materials (Basel) 2016; 9(10):E797. doi: 10.3390/ma9100797
9. Lee C., Singla A., Lee Y. Biomedical applications of collagen. Int. J. Pharm. 2001; 221(1-2):1-22. doi: 10.1016/s0378-5173(01)00691-3
10. Maji K., Dasgupta S., Pramanik K., Bissoyi, A. Preparation and evaluation of gelatin-chitosan-nanobio-glass 3d porous scaffold for bone tissue engineering. Int. J. Biomater. 2016; 2016:9825659. doi: 10.1155/2016/9825659
11. Murphy C., O'Brien F. Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminog-lycan scaffolds. Cell Adh. Migr. 2010; 4(3):377-381. doi: 10.4161/cam.4.3.11747
12. Murphy C., Haugh M., O'Brien F. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2010; 31(3):461-466. doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.09.063
13. Rose J., Pacelli S., Haj A., Dua H., Hopkinson A., White L., Rose F. Gelatin-based materials in ocular tissue engineering. Materials (Basel) 2014; 7(4):3106-3135. doi: 10.3390/ma7043106
14. Tondera C., Hauser S., Krüger-Genge A., Jung F., Neffe A., Lendlein A., Klopfleisch R., Steinbach J., Neuber C., Pietzsch J. Gelatin-based hydrogel degradation and tissue interaction in vivo: insights from multimodal preclin-ical imaging in immunocompetent nude mice. Theranostics 2016; 6(12):2114-2128. doi: 10.7150/thno.16614
15. Tran R., Naseri E., Kolasnikov A., Bai X., Yang J. A new generation of sodium chloride porogen for tissue engineering. Biotechnol. Appl. Biochem. 2011; 58(5):335-344. doi: 10.1002/bab.44
16. Van Vlierberghe S. Crosslinking strategies for porous gelatin scaffolds. J. Mater. Sci. 2016; 51(9):4349-4357. doi: 10.1007/s10853-016-9747-4
17. Yang S., Leong K., Du Z., Chua C. The design of
scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue Eng. 2001; 7(6):679-689. doi: 10.1089/107632701753337645
18. Zhang Y., Yu J., Dong X., Ji H. Research on characteristics, antioxidant and antitumor activities of dihydro-quercetin and its complexes. Molecules 2017; 23(1):Е20. doi: 10.3390/molecules23010020
Поступила 19.03.2019
Контактная информация Антон Андреевич Яценко,
аспирант,
Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95.
E-mail: mdyatsenko@gmail.com Correspondence should be addressed to Anton A. Yatsenko, MD, Postgraduate student, Amur State Medical Academy, 95 Gorkogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: mdyatsenko@gmail.com
