CC BY
136
DEVELOPMENT THE RECEIPT OF TECHNOLOGY OF EXTRACT FROM SEEDS OF HORSE-CHESTNUT (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)
O.G. Zharova, V.I. Sheichenko, T.A. Sokolskaya
All-Russian Institute of Medical and Aromatic Plants Grina str., 7, Moscow, Russia, 117216
V.V. Vandishev
Department of botany, physiology, pathology of plants and agrobiotechnology
Pharmaceutical faculty Peoples' Friendship University of Russia
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
The plants of Aesculus genus (Family Hippocastanaceae) have attracted much interests of phyto-chemists for many years due to the discovery of triterpene glycosides — escin with extraordinary antiinflammatory activity from horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) seeds and the successful applications of its seeds extract for treatment of peripheral chronic venous insufficiency now. The powdered seeds (with reduction range 3 mm) were extracted three times with 70% (v/v) aqueous EtOH under reflux for 2 h at 60 °C with a water bath and the extracts were combined, filtered. After removal of the solvent in vacuum using a rotary evaporator at 50 °C, the extract was further partitioned between H2O and EtOAc (1 : 2, v/v) to give H2O-soluble and EtOAc-soluble fractions. The H2O-soluble fraction was evaporated to dry-ness using a rotary evaporator at 50 °C. High-performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed for the quantitative determination of escin. Thus, it was developed the receipt of technology of dry extract from seeds of horse-chestnut (not less 15% of escin).
Keywords: seed, horse-chestnut, Aesculus, extract, High-performance liquid chromatography (HPLC).
ИЗУЧЕНИЕ ЛИПИДОВ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА ОБЫКНОВЕННОГО (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)
О.Г. Жарова, В.И. Шейченко, Т.А. Сокольская
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) ул. Грина, 7, Москва, Россия, 117216
В.В. Вандышев
Кафедра ботаники, физиологии, патологии растений и агробиотехнологии Фармацевтический факультет Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Москва, Россия, 117198
Проведены исследования содержания и состава жирного масла и липофильной фракции семян конского каштана обыкновенного, произрастающего в условиях Подмосковья, методами газо-
жидкостной хроматографии (ГЖХ) и :Н-ЯМР спектроскопией. Жирное масло семян конского каштана обыкновенного характеризуется примерно равным содержанием триглицеринов олеиновой и линолевой кислот.
Ключевые слова: липиды, жирное масло, семена, конский каштан обыкновенный.
В настоящее время фитопрепараты препараты все более успешно применяются для лечения хронических заболеваний, таких как хроническая венозная недостаточность. Возрастающее внимание к ним объясняется прежде всего хорошей переносимостью при длительном применении и системным действием на патогенез заболевания.
Основными биологически активными соединениями семян конского каштана обыкновенного (ККО) — Aesculus hippocastanum L., семейство конскокаштано-вые Hippocastanaceae, обеспечивающими венотонизирующее и ангиопротектор-ное действие препаратов на их основе, является эсцин, представляющий собой комплекс тритерпеновых гликозидов. По данным литературы, за рубежом проводятся исследования состава жирного масла семян в связи с таксономией рода Aesculus [6]. На фармацевтическом рынке РФ оно существует в виде биологически активных добавок под такими комерческими названиями, как «Масло Конский каштан» (ООО Камелия), в составе «Крем Сабельник для тела» (ООО Фора-Фарм) и др. Однако о составе и фармакологической активности жирного масла семян ККО нет сведений в доступной нам отечественной литературе. Кроме того, необходимо отметить, что в семенах ККО содержится лишь 4,13—8,0% жирного масла [1, 6]. По этой причине их нельзя отнести к традиционному жиромаслич-ному сырью, в котором содержание масла должно составлять не менее 18%. Тем не менее известны случаи успешного использования в медицине экстракционного жирного масла шиповника, в орешках которого его содержится всего 9,27% [1].
В связи с этим представляется актуальным проведение исследований содержания и состава жирного масла семян ККО, произрастающего в Московской области.
В ВИЛАРе разработана технологическая схема получения сухого экстракта семян ККО (с содержанием эсцина не менее 15%). При этом неиспользуемыми отходами являются шрот измельченных семян и липофильная фракция, получающаяся в результате очистки экстракта (с выходом около 8%). Последняя представляет собой маслянистую, легкоподвижную, мутную жидкость зеленовато-желтого цвета с коэффициентом преломления [1,4728]D .
Методика получения экстракционного жирного масла сводилась к следующему: семена ККО, собранные в Ботаническом саду ВИЛАР в 2005—2007 гг., измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещали в аппарата Сокслета и экстрагировали гексаном до истощения семян. Извлечение фильтровали через бумажный складчатый фильтр и удаляли растворитель с помощью вакуум-ротационного испарителя на водяной бане при температуре 50 °С и остаточном давлении 0,2 атм. Полученный остаток представлял собой маслянистую, легкоподвижную, прозрачную жидкость зеленовато-желтого цвета с коэффициентом преломления [1,4726]D . Выход жирного масла составил 6,1% от сырья.
Нами проведены предварительные исследования глицеридного состава ли-пидной фракции и жирного масла семян ККО методоми ЯМР-спектроскопии, ГЖХ, ТСХ и денситометрии.
Качественный анализ полученных продуктов проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках «БНиМ» с закрепленным слоем силикагеля. Пластинку предварительно смачивали в 2%-м растворе фосфорномолибденовой кислоты в ацетоне. На пластинку наносили около 10 мкг жирного масла в эфирном растворе в виде полосы длиной 10 мм. Проявление хроматограммы проводили в системе растворителей гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота — 80 : 30 : 1,5. Пластинку высушивали на воздухе до исчезновения запаха растворителей и помещали в шкаф с принудительной вентиляцией при температуре 80 °С до появления синих пятен отдельных групп липидов на желтом фоне. Идентификацию отдельных групп соединений и жирного масла семян ККО проводили сравнивая стандартных веществ с зонами адсорбции на хроматограмме [2].
Количественное определение отдельных групп липидов проводили денси-тометрическим методом [2] на приборе «Хромоскан 200». Расчет содержания отдельных групп липидов проводили методом внутренней нормализации с использованием поправочных коэффициентов. Групповой состав жирного масла представлен в табл. 1.
Таблица 1
Групповой состав жирного масла семян конского каштана обыкновенного
Наименование групп липидов Содержание, %
Полярные липиды 0,7
Стерины 1,8
Свободные жирные кислоты 35,7
Триацилглицерины 58,5
Эфиры стеринов 3,3
Определение профиля жирных кислот изучаемых продуктов проводили методом ГЖХ [2]. Метиловые эфиры получали методом переэтерификации жиров метанолом в присутствии хлористого водорода [10]. Условия анализа: газовый хроматограф — Carlo Erba Strumentazione, HRGC 5300 Mega Series, Италия; хро-матографическая колонка — Chrompack Capillary column test Reporp CP 7420, длина 100 мм, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки неподвижной жидкой фазы 0,25 ^м; температурный режим — термостат колонок: 110 °С (10 мин.), 5 °/мин. — 175 °С (15 мин.), 4 °/мин. — 200 °С (5 мин.), 3 °/мин. — 225 °С (60 мин.); температура инжектора — 260 °С; температура детектора — 240 °С; детектор — пламенно-ионизационный; газ-носитель — азот.
Идентификацию жирных кислот проводили: а) путем сравнения времен удерживания стандартных веществ с временем удерживания отдельных компонентов анализируемой смеси; б) по величине эквивалентной длины цепи (ЭДЦ); в) по графику зависимости логарифма времени удерживания от числа углеродных атомов в цепи.
Количественный анализ содержания отдельных жирных кислот определяли на интеграторе С-Я6А СЬгоша1орас фирмы БЫшаёги. Расчет проводили методом внутренней нормализации [2]. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Содержание МЭЖК жирного масла семян конского каштана обыкновенного
№ п/п Метиловые эфиры ЖК Индекс ЖК Содержание в сумме, %
1 2 3 4
1 Капроновая 6:0 0,01
2 Каприловая 8:0 0,02
3 Каприновая 10:0 0,03
4 Лауриновая 12:0 0,08
5 Миристиновая 14:0 0,23
6 Пентадекановая 15:0 0,04
7 Пентадеценовая 15:1 0,04
8 изо-гексадекановая 16:01 0,03
9 Пальмитиновая 16:0 10,00
10 Гексадеценовая 16:1 0,05
11 Пальмитолеиновая 16:1 9-цис 0,34
12 Гексадекадиеновая 16:2 0,03
13 Маргариновая 17:0 0,36
14 Гептадеценовая 17:1 0,14
15 изо-октадекановая 18:01 0,04
16 Стеариновая 18:0 2,87
17 Элаидиновая 18:1 9-транс 0,03
18 Олеиновая 18:1 9-цис 43,40
19 Вакценовая 18:1 11 -транс 0,49
20 изо-октадекадиеновая 18:21 0,19
21 Линолевая 18:2 29,86
22 у-линоленовая 18:3 ю-6 1,26
23 а-линоленовая 18:3 ю-3 0,66
24 Паринаровая 18:4 0,07
25 Арахиновая 20:0 0,14
26 Гондоиновая 20:1 4,82
27 Эйкозадиеновая 20:2 0,13
28 Бегеновая 22:0 0,20
29 Эруковая 22:1 2,65
30 Лигноцериновая 24:0 0,14
31 Тетракозеновая 24:1 1,62
Таким образом, в жирном масле семян ККО преобладают олеиновая (43,4%), линолевая (29,86) и пальмитиновая (10,00) кислоты.
По данным литературы [4, 5, 7, 8, 9], 1Н-ЯМР-спектр растительных жирных масел является достаточно информативными для установления некоторых их характеристик с помощью этого неразрушающего метода анализа. Интерпретация сигналов в ЯМР-спектре триацилглицеринов жирного масла позволяет отнести
его к одному из трех типов жидких растительных масел: невысыхающему, полувысыхающему, высыхающему. Для этого используется расчетная величина — эквивалент йодному числу (ЭЙЧ), вычисляемая исходя из величин интегральных интенсивностей (5) сигналов олефиновых протонов (А) и метиленовых протонов (Б) по формуле:
ЭЙЧ = 14,494 • (4 • 5а/5б - 1).
Вышеизложенный подход к характеристике ацилглицеринов с помощью их ЯМР спектра (1Н ЯМР спектры сняты в растворе CD3Cl на спектрометре Gemini фирмы Varian с рабочей частотой 200 МГц) был применен для анализа жирного масла и липофильной фракции — отхода производства сухого экстракта семян ККО.
Вычисленные на основании данных ПМР-спектров по формулам, приведенным в работе [4], величины числовых показателей, характеризующих жирное масло и липофильную фракцию, а также состав жирных кислот в них, вычисленные по 1Н-ЯМР спектрам, представлены в табл. 3. Судя по спектрам, в липофильной фракции много свободных жирных кислот, которых практически нет в жирном масле. По остальным расчетным числовым показателям триацилглицерины масла семян и липофильной фракции имеют сходные характеристики. Содержание ненасыщенных жирных кислот, представленных олеиновой, линолевой и линоле-новой кислотами, составляет 92—94%. Содержание олеиновой кислоты в сумме кислот триацилглицеринов масла семян ККО составляет 54,5%, что не противоречит данным литературы [3].
Таблица 3
Показатели, характеризующие триацилглицерины и содержание кислот в жирном масле и липофильной фракции семян ККО
Название показателя Жирное масло Липофильная фракция
Эквивалент йодного числа (ЭЙЧ) 109,0 110,0
Содержание ненасыщенных кислот, % 92,0 94,0
Содержание насыщенных кислот, % 8,0 6,0
Содержание свободных кислот,% 1,6 не определяли
На основании величины эквивалентов йодного числа, коэффициентов преломления полученные продукты находятся на границе между невысыхающими и полувысыхающими жирными маслами. Это не противоречит данным литературы о значении йодного числа жирного масла семян ККО, которое находится в пределах 90—109 [3].
Таким образом, показана возможность комплексного использования семян ККО для получения сухого экстракта и липофильной фракции. Установлен жир-нокислотный профиль масла семян ККО и липофильной фракции, произрастающего в условиях Подмосковья, методом ГЖХ (классический подход) и 1Н-ЯМР спектроскопией. Жирное масло семян ККО характеризуется примерно равным содержанием триглицеринов олеиновой и линолевой кислот. Учитывая специфичный состав липофильной фракции, целесообразно изучение фармакологической, хи-миотерапевтической активности и токсикологии.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Атлас лекарственных растений России / Под ред. В.А. Быкова. — М.: НИЦ БМТ ВИЛАР, 2006. — С. 136—138.
[2] Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна. — М.: Медицина, 1998. — 188 с.
[3] Руководство по методам исследования, технохимическому контролю и учету производства в масло-жировой промышленности / Под ред. В.П. Ржехина и А.Г. Сергеева. — Ленинград, 1969. — С. 98, 118.
[4] Стихин В.А., Шейченко В.И., Вандышев В.В. и др. Анализ жирных масел методом ЯМР // Тезисы докл. 3-ей международн. конф. «Экологическая патология и ее фармакокоррек-ция». — Чита, 1991. — Ч. 2. — С. 71.
[5] Шейченко В.И., Толкачев А.В., Толкачев О.Н. Льняное масло: ЯМР анализ // В Сб. Химия, технология медицина. Тр. ВИЛАР / Под ред. В.А. Быкова. — М. НИЦ БМТ ВИЛАР. — 2003. — С. 118—122.
[6] Baraldi C., Bodecchi L.M., Cocchi M. Chemical composition and characterisation of seeds from two varieties (pure and hybrid) of Aesculus hippocastanum // Food Chemistry. — 2007. — 104. — P. 229—236.
[7] Guillen M.D., Ruiz A. High resolution 1H nuclear magnetic resonance in the study of edible oils and fats // Trends Food Sci.Technol. — 2001. — № 12. — P. 328—338.
[8] Knothe G., Kenar J.F. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMR spectroscopy // Eur. J. Lipid Sci. Technol. — 2004.— 106.— P. 88—96.
[9] Miyake Y., Yokomizo K., Matsuzaki N. Rapid determination of iodine value by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy // J. Am. Oil. Chem. Soc. — 1998. — 75. — P. 15—19.
[10] Standart methods for the analysis of oils, fats and derivatives / Prepared for publication by Paquot C. — Oxford-New York-Toronto-Sydney-Paris-Frankfurt: Pergamon Press, 1986. — P. 96—102.
INVESTIGATION LIPIDS FROM SEEDS OF HORSE-CHESTNUT (AESCULUS HIPPOCASTANUM L.)
O.G. Zharova, V.I. Sheichenko, T.A. Sokolskaya
All-Russian Institute of Medical and Aromatic Plants
Grina str., 7, Moscow, Russia, 117216
V.V. Vandishev
Department of botany, physiology, pathology of plants and agrobiotechnology Pharmaceutical faculty Peoples' Friendship University of Russia
M-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198
Horse-chestnut seeds, as all others seeds, are natural products whose chemical composition is a very complex matrix. They contain a lot of different molecules and analytes, the majority of which are triterpene glycosides, calculated as escin, polysaccharides, proteins, lipids and many minor components among others. Lipids represent not significant fraction on these original products (5—8% of the dry mass of seeds). The fatty acids and lipophilic fraction was processed by as a standard method as gas-
liquid chromatography and by method nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Some fatty acids, the most important of which are oleic and linolenic acids, have been identified in lipid fractions. Oleic acid was nearly equal linolenic acid.
Key words: lipids, fatty acid, seed, Horse-chestnut, Aesculus hippocastanum.
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ АСЦИТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКА И ЕЕ КОМПОНЕНТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ ФИЛЬТРАЦИОННОЙ ДЕТОКСИКАЦИИ
Е.Ю. Златник, И.А. Горошинская, А.П. Меньшенина, Г.А. Неродо, Л.Ю. Голотина, Н.Д. Ушакова, Е.А. Никипелова
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Кафедра онкологии Ростовский медицинский университет 14-я линия, 63, Ростов-на-Дону, Россия, 344037
Изучали состав иммунологических и биохимических факторов асцитической жидкости больных раком яичника и фракций, полученных из нее методом фильтрационной детоксикации на диализаторе с мембраной полиметилметакрилат (фильтрата и концентрата). В концентрате содержится основная часть белка (альбумин, иммуноглобулины, иммунные комплексы, белки, обладающие а-амилазной, каталазной и лактатдегидрогеназной активностью), присутствуют цитокины (1Ь-1а, 1Ь-1ЯА, 1Ь-8, 1КЫ- а). В фильтрате находится основная часть про- и противовоспалительных цито-кинов, кроме 1Ь-1а, пероксинитрит, часть иммунных комплексов. Показано различие свойств альбумина концентрата и фильтрата; подобные различия возможны и у цитокинов. Вещества, обуславливающие эндогенную интоксикацию, содержатся преимущественно в фильтрате.
Ключевые слова: рак яичника, асцитическая жидкость, цитокины, белок, фильтрационная детоксикация.
Метод фильтрационной детоксикации позволяет не только проводить удаление из крови экзогенных токсических веществ, но и разделение биологических жидкостей на различные компоненты, обладающие разными видами биологической активности. Некоторые из них могут принимать участие в формировании эндогенной интоксикации в организме онкологических больных и отягощать клиническую картину заболевания. Асцитическая жидкость (АЖ) больных раком яичника (РЯ), как известно, содержит клеточные факторы, а также целый ряд гуморальных компонентов, отчасти сходных с присутствующими в сыворотке, которые могут быть использованы для восполнения потери белка или для преинкубации с химиопрепаратами с целью проведения внутрибрюшинной послеоперационной химиотерапии [1, 2]. Однако поскольку АЖ может содержать и другие, в частности токсичные вещества, следует изучить возможность их удаления, например, методом фильтрационной детоксикации.
