CC BY
69
УДК 615.014.22+615.256.303:618.1
С. С. Камаева1, И. В. Мухина1, Л. А. Поцелуева1, Н. В. Жемарина1, Н. Н. Проданец2
ИЗУЧЕНИЕ КОНТРАЦЕПТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЭТОНИЯ
1Казанский государственный медицинский университет ^Нижегородская медицинская академия
Современная медицина предлагает различные методы предотвращения нежелательной беременности. Наиболее эффективным следует признать сочетание барьерных методов контрацепции (мужских и женских презервативов, диафрагм, цервикальных колпачков) со спермицидным средством, что помимо предупреждения беременности предохраняет и от возбудителей заболеваний, передающихся половым путем (вируса простого герпеса, хламидий, вируса папилломы человека, гонококка, трихомонады, вируса гепатита В, сифилиса) со снижением в 2-3 раза риска возникновения половых инфекций [1-3]. Наиболее оправдано применение барьерных методов контрацепции кормящими матерями в послеродовый период, когда недопустимо использование средств гормональной контрацепции.
Спермициды — это химические агенты, инактивирующие сперму во влагалище и препятствующие ее прохождению в матку. Спермицидные средства выпускают в виде кремов, мазей, гелей, суппозиториев, таблеток, растворимых пленок, пенных аэрозолей. В числе первых спермицидов были известны хинина сульфат, хинозол, входящий в состав суппозиториев «Контрацептин Т», алкильные и арильные производные бензохинонов, а также молочная и борная кислоты. Важным открытием явилось применение в качестве спермицидных агентов поверхностно-активных веществ (ПАВ), оказывающих, как известно, повреждающее действие на мембрану сперматозоидов. К таким веществам относятся бензалконий хлорид и ноноксинол-9.
Бензалконий хлорид — алкилбензилдиметиламмония хлорид — действующее вещество препарата «Фарматекс» (Франция), выпускаемого в виде вагинальных таблеток, свечей, крема и тампонов фирмой «Иннотек Интернасьональ» [1, 4]. При регулярном использовании контрацептивных лекарственных средств, содержащих бензалкония хлорид, число заболеваний, передающихся половым путем, уменьшается в среднем на 42 %, в частности, заражаемость хламидиозом уменьшается на 45 %, а гонореей — на 65 % [2, 3]. Недостатками бензалкония хлорида являются вызываемые им при применении аллергические реакции, зуд и жжение во влагалище, отмечаемые примерно у 8 % женщин, а также контактный дерматит, инфекции мочевыводящей системы, кандидоз, вульвоваги-нит, аллергический вагинит [4].
Ноноксинол-9 — моно (пара-нонилфениловый) эфир полиэтиленгликоля — действующее вещество препарата «Патентекс Овал», выпускаемого фирмой «Мерц» (Германия) в виде суппозиториев, является сильнодействующим ПАВ, разрушающим слизистую оболочку сперматозоидов и обладающим при этом бактерицидным действием [1, 4].
© С. С. Камаева, И. В. Мухина, Л. А. Поцелуева и др., 2009
При использовании контрацептивных препаратов, содержащих ноноксинол-9, отмечено снижение заболеваемости гонореей на 24 %. Недостатком ноноксинола-9 как местного противозачаточного средства является его выраженное раздражающее действие на слизистые оболочки, что способствует передаче ВИЧ-инфекции [5, 6].
С целью расширения номенклатуры спермицидных средств с сочетанным антимикробным действием нами была изучена спермицидная активность этония-1,2 — этилен-бис- (N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорида, используемого до настоящего времени в качестве официнального антимикробного, противовоспалительного и стимулирующего репаративные процессы средства для лечения трещин сосков, вульвовагинитов, зудящих дерматозов, проктитов и сигмоидитов [4, 7].
Материалы и методы исследования. На первом этапе изучение спермицид-ной активности этония проводилось в опытах in vitro на 24 образцах спермы человека (табл. 1) с помощью цитоморфологических методов: под микроскопом подсчитывалось число подвижных спермиев, число активно подвижных спермиев, время переживания спермиев, определялась рН спермы до и после эквилибрации спермы с водными растворами этония [8, 9].
Таблица 1
Исходные показатели нормального эякулята
Показатель Значение
Количество спермиев в 1 мл 60,6±4,86х106
Число подвижных спермиев, % 54,27±4,49
Число активно подвижных спермиев, % 42,07±1,57
рН спермы 7,546±0,18
Время переживания спермиев, с 315,38±14,24
После исследования нативной спермы в образцы спермы добавлялись изучаемые водные растворы этония различных концентраций от 0,01 до 1 %. Действие водных растворов этония оценивалось в момент их добавления к нативной сперме, далее через 30 и 60 с, наконец, через 10, 15 и 30 мин и через 1 ч после инкубации. В контроле использовался 1 %-ный раствор хинозола, обладающий хорошо известной спермицид-ной активностью [8, 10]. Сперма и исследуемые растворы использовались в равных объемах. Полученные данные обработывались на компьютере с помощью пакета программ Statgraphics Plus.
Было установлено, что эффективность этония проявляется уже в концентрации
0,5 %, вызывая мгновенную гибель спермиев при полном отсутствии подвижных, активно подвижных и живых сперматозоидов. Для гарантированного 100 %-ного спермицидного эффекта этоний в концентрации 1 % вводили в состав разработанной нами мази с этонием на гидрофильной основе, которая легко смешивается с вагинальным секретом и при этом не обладает запахом, легко смывается и не оставляет пятен на белье.
Контрацептивное действие разрабатываемой лекарственной формы в виде мази с 1 %-ным содержанием этония было изучено в опытах in vivo на половозрелых кроликах породы Шиншилла массой 4,20±0,32. Препаратом сравнения служил препарат «Фарматекс, крем вагинальный» (лаборатория Иннотек Интернасиональ, Франция).
Животные были распределены на 4 группы по 10 особей в каждой. Животные первой группы — интактные животные (без введения препаратов) — контроль I.
Экспериментальным животным вводили вагинально:
• мазевую основу (контроль II);
• «Фарматекс, крем вагинальный» (препарат сравнения);
• мазь этония 1 %-ная (опыт).
При изучении контрацептивного действия in vivo препараты вводили самкам интравагинально перед ссаживанием их с самцами. При отсутствии коитуса через 60 мин введение препаратов повторялось [11].
Влагалищные мазки брались на анализ через 10 и 20 мин после коитуса. Подвижность сперматозоидов оценивали после последовательного их просмотра не менее чем в пяти полях зрения микроскопа. Оценку подвижности сперматозоидов проводили при температуре 37 оС на предметном столике с подогревом, так как температура сильно влияет на подвижность и скорость движения сперматозоидов. Препарат исследовали под микроскопом сначала при 100-кратном совокупном увеличении, при этом получали общее представление о равномерности распределения сперматозоидов на стекле. Затем препарат исследовали при 400-кратном совокупном увеличении.
Подвижность каждого сперматозоида классифицировали по категориям (а), (b) и (с) с использованием следующих критериев [8, 9]:
a) быстрое поступательное движение;
b) колебательное (медленное и вялопоступательное) и непоступательное движение;
c) неподвижность сперматозоидов.
При оценке морфологического строения сперматозоидов для определения понятия морфологической «нормы» сперматозоида применяли строгие критерии. Сперматозоид рассматривали как нормальный, если его головка, шейка, средняя часть и хвост являлись нормальными, т. е. морфологическое описание соответствовало следующим критериям:
1. Головка сперматозоида овальной формы, отношение длины к ширине от 1,50 до 1,75. Длину и ширину сперматозоидов измеряли при помощи окуляр-микрометра.
2. Хорошо очерченная акросомная область, составляющая 40-70 % площади головки.
3. Средняя часть (шейка) — тонкая, составляет 1,5 длины головки и прикрепляется к головке вдоль ее оси.
4. Хвост сперматозоида прямой, одинаковой толщины на всем протяжении, меньше по ширине средней части, не закрученный.
Сперматозоид рассматривали как патологический, если его головка, шейка, средняя часть и хвост имели нарушения:
1. Дефекты головки, а именно, большие, маленькие, конические, грушевидные, круглые и аморфные головки, головки с вакуолями (>20 % площади головки заполнена неокрашенными вакуолями), головки с маленькой акросомной областью (<40 % площади головки) и с двойными головками или любая их комбинация.
2. Дефекты шейки и средней части, а именно, «склоненная» шейка (шейка и хвост образуют угол более 90о к длинной оси головки), асимметричное прикрепление средней части к головке, утолщенная или неравномерная средняя часть, патологически тонкая средняя часть или любая их комбинация. Если головки подвергались абсорбции, в эякуляте обнаруживались только отдельные хвосты или так называемые «булавочные головки». «Булавочные головки» не учитывали при подсчете как дефект головки, а подсчитывались как дефект шейки и средней части.
3. Дефекты хвоста: короткие, множественные, в виде шпильки, сломанные, наклонные (угол больше 90°), хвосты неравномерной толщины, закрученные или любая их комбинация.
При исследовании окрашенных препаратов под микроскопом с иммерсией использовали объектив с увеличением х 100 с ярко освещенным полем зрения и окуляр с увеличением не менее х10.
Морфологическую оценку проводили в нескольких последовательно выбранных участках мазка. По мере того как препарат систематически просматривали от одного поля зрения к другому, производили оценку и подсчет всех нормальных сперматозоидов, а также отмечали все их дефекты. Не учитывали сперматозоиды, наслоившиеся друг на друга и с головками, лежащими на ребре. Их можно было оценить при изменении фокуса микроскопа. Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (SD). Для сравнения данных различных групп использовали критерий Уилкоксона. Полученные результаты были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5.
На следующие сутки анализировали в моче и крови содержание хорионического гонадотропина, подтверждающего наличие беременности.
Для полного подтверждения беременности или ее отсутствия ориентировались на ожидаемый срок беременности и только при отсутствии впоследствии родов делали заключение о контрацептивном действии препаратов.
Полученные данные были обработаны на компьютере с помощью пакета программ Statgraphics Plus.
Результаты исследования. При исследовании спермицидной активности этония in vitro после смешивания нативной спермы и раствора хинозола в равных количествах и последующего нанесения смеси на предметное стекло спермии в каком-либо виде (подвижные, активно подвижные и живые) не наблюдались. Иллюстрация результатов исследований представлена в табл. 2.
Таблица 2
Влияние водных растворов этония различных концентраций на жизнеспособность спермиев
Концентрация водного раствора этония Время контакта спермы с растворами Число подвижных спермиев Число активно подвижных спермиев
%
1 2 3 4
0,01 % 30 с 21,2±2,54 14,0±8,95
5 мин 3,66±3,79 4,0±2,48
10 мин 3,66±3,79 3,66±3,79
20 мин 13,33±3,79 9,0±2,48
30 мин 13,33±3,79 9,0±2,48
0,05 % 30 с 16,33±7,17 6,33±3,79
1 мин 13,0±4,3 6,0±2,48
5 мин 6,66±3,08 4,33±2,86
10 мин 4,33±2,86 4,33±2,86
1 2 3 4
0,1 % 30 с 20,8±7,04 10,0±2,01
60 с 11,86±2,87 7,33±1,603
10 мин 2,5±2,24 0,083±0,18
15 мин 0 0
30 мин 0 0
60 мин 0 0
0,2 % 30 с 6,41±4,25 3,08±1,9
60 с 4,58±4,49 2,5±1,54
10 мин 0 0
15 мин 0 0
30 мин 0 0
60 мин 0 0
0, 3 % 30 с 4,77±3,53 2,55±1,84
60 с 3,0±1,92 1,555±1,094
10 мин 0 0
15 мин 0 0
30 мин 0 0
60 мин 0 0
0,4 % 30 с 0,33±0,38 0,42±0,49
60 с 0,5±0,57 0
10 мин 0 0
15 мин 0 0
30 мин 0 0
60 мин 0 0
0,5 % 30 с 0 0
60 с 0 0
10 мин 0 0
15 мин 0 0
30 мин 0 0
60 мин 0 0
В экспериментах in vitro, как отмечалось выше, было установлено, что после смешивания в равных количествах нативной спермы с растворами этония и хинозола — препарата сравнения — подвижных и живых спермиев в изучаемых смесях не наблюдалось. Установлено, что 100%-ная эффективность этония проявлялась в концентрации 0,5 %.
Результаты макроскопического анализа содержимого влагалища самок в экспериментах in vivo после коитуса, представленные в табл. 3, свидетельствуют о наличии в исследуемой слизи из влагалища интактных животных (группа 1) жизнеспособных сперматозоидов, способных к оплодотворению.
Макроскопический анализ эякулята после применения 1 %-ной мази этония выявил 100 %-ный спермицидный эффект препарата in vivo, сопоставимый с эффективностью препарата сравнения — «Фарматекс, крем вагинальный».
Таблица 3
Влияние мази этония 1 %-ной на жизнеспособность сперматозоидов в сравнении с препаратом
«Фарматекс, крем вагинальный» (М±ББ)
Группа животных Подвижность спермиев, % Жизнеспособность спермиев (% живых)
a b с 10 мин 60 мин
1. Интактные животные (контроль I) 82,3±9,6 10,8±5,2 6,2±10,5 82,6±10,65 63,1±10,2
2. Мазевая основа (контроль II) 57,0±3,2 4,8±2,6 36,9±3,8 75,5±8,37 71,2±8,11
3. «Фарматекс®, крем вагинальный» (препарат сравнения) 0 0 100 0,68±0,4 0
4. Мазь этония 1 %-ная (опыт) 0 0 100 0,85±0,35 0
Результаты морфологического анализа мазков, позволяющего выявить структурные изменения сперматозоидов после применения объектов исследования в течение 10 и 20 мин, представлены в табл. 4. Для 2-кратной оценки готовили не менее двух мазков и окрашивали их по Папаниколау. Головка сперматозоида в акросомальной области приобретала бледно-синий, а в постакросомной — темно-синий цвет. Средняя часть сперматозоида окрашивалась в красный цвет, а хвост — в синий или красноватый цвет. Размеры головок сперматозоидов в окрашенных препаратах слегка меньше, чем размеры головок живых сперматозоидов в эякуляте, однако их форма существенно не меняется.
При воздействии мази этония 1 %-ной и «Фарматекс, крем вагинальный» в большинстве случаев происходило быстрое разделение головки и хвоста за счет морфологических нарушений в области головки и шейки, что, вероятно, обусловлено значительным снижением поверхностного натяжения мембраны и ее разрушением при действии катионных поверхностно-активных веществ [12]. Наблюдалось набухание головки и шейки спермиев с разрывами в месте их соединения с образованием «булавочных» головок.
Результаты контрацептивного действия изучаемых препаратов в опытах in vivo, представленные в табл. 5, свидетельствуют об абсолютной спермицидной активности изучаемой 1 %-ной мази этония, сопоставимой с действием зарубежного контрацептивного препарата «Фарматекс, крем вагинальный» (Франция).
Обсуждение результатов. Изучение спермицидной активности этония выявило 100 %-ную его эффективности как в опытах in vitro при использовании в виде водного
0,5 %-ного раствора, так и в опытах in vivo при вагинальном введении половозрелым крольчихам в виде 1 %-ной мази. Спермицидная активность этония определяется, по-видимому, его принадлежностью к классу катион-активных соединений, проявляющих свое действие за счет снижения поверхностного натяжения мембраны сперматозоида и ее разрушения под воздействием ПАВ катионного типа.
Таблица 4
Изменение морфологии сперматозоидов под влиянием 1 %-ной мази этония во влагалищном мазке после интравагинального применения (М±£Д)
Группа Норма Выявленная патология, %
головки шейки хвоста
1. Интактные животные (контроль I) (п = 10) 87,2±3,5 2,4±1,8 1,0±0,8 9,4±4,1
2. Мазевая основа (контроль II) 10 мин 63,8±14,9 58 сч сч 8,4±2,82 25,8±10,5
20 мин 60,5±20,4 10,8±4,38 25,12±9,84
(п = 10) р5-1 < 0,05 р5-1 < 0,05 р5-1 < 0,05
3. «Фарматекс®, крем вагинальный» (препарат сравнения) 10 мин 71,8±3,6 9,1±0,2 18,0±3,6 6,4±0,2
20 мин 58,3±5,77 13,3±1,5 20,6±5,01 7,6±3,05
(п = 10) рб-1 < 0,05 р6-1 < 0,05 р6-1 < 0,05 р6-1 < 0,05
4. Мазь этония 1 %-ная (опыт) 10 мин 9,7±5,8 2,4±1,23 54,2±12,5 31,3±14,8
20 мин 8,2±3,7 2,3±1,84 66,4±29,3 21,8±16,3
(п = 10) р3-1 < 0,05 р3-1 < 0,05 р3-1 < 0,05
Таблица 5
Контрацептивное действие мази этония 1 %-ной при интравагинальном введении крольчихам
Группа Число забеременевших самок в группе Число небеременных самок в группе Эффективность контрацептивного действия, %
шт.
1. Интактные животные (контроль I) 10 - -
2. Мазевая основа (контроль II) 9 1 10
3. «Фарматекс®, крем вагинальный» (препарат сравнения) - 10 100
4. Мазь этония 1 %-ная (опыт) - 10 100
Выраженность спермицидного действия этония в совокупности с широким спектром его противомикробной активности определяет как противозачаточное действие вагинальной мази, так и ее потенциальную эффективность в борьбе с сопутствующими заболеваниями половых путей. Достоинства мази этония усиливаются отсутствием у нее неприятного запаха, раздражающих и пачкающих свойств [13].
Таким образом, этоний, относящийся к катионным поверхностно-активным веществам и обладающий спермицидной активностью, сопоставимой с активностью зарубежного контрацептивного средства «Фарматекс, крем вагинальный» (Франция), может быть рекомендован в виде 1 %-ной вагинальной мази для применения в качестве отечественного контрацептивного средства
Литература
1. Корхов В. В. Медицинские аспекты применения контрацептивных препаратов. СПб., 1996. С. 146-153.
2. КосареваЕ. А. Репродуктивное поведение женщины: современные тенденции // Контрацепция и здоровье женщины. 2001. № 1. С. 26-31.
3. Прилепская В. Н., Яглов В. В. Барьерные методы контрацепции у женщин после родов // Там же. 1999. № 1. С. 3-7.
4. Регистр лекарственных средств России «РЛС — Энциклопедия лекарств®». 7-е изд., перераб. и доп. М., 2000. С. 130, 254, 659, 1118.
5. ChristineMauck. Nonoxynol-9 gel did not improve protection against sexually transmitted infections in condom users // Evidence-based Obstet. Gynecol. 2002. Vol. 4. N 4. P. 177-178.
6. DavidM. Phillips, VanajaR. Zacharopoulos. Nonoxynol-9 enhances rectal infection by herpes simplex virus in mice // Contraception. 1998. Vol. 57. N 5. P 341-348.
7. Камаева С. С., Поцелуева Л. А., Сабирова Ф. М. Спермицидная активность этония. Патент № 2229878 С 1. А 61 К 31/14, А 61 Р 15/16 15/18 № 2003102902/15 31.01.2003.
8. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. М., 2001. 144 с.
9. Шевченко Е. А., Артифексов С. Б. Диагностическое значение исследования эякулята: Алгоритм исследования: Учебн. пособие. Н. Новгород, 2003. 28 с.
10. Коптева Л. Н. Поиск контактных спермицидов // Акуш. и гинек. 1992. № 2. С. 67-70.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М., 2005. 832 с.
12. Барсуков Л. И. Как собрать мембрану (солюбилизация и реконструкция мембран) // Соросовский образоват. журн. 2004. Т. 8. № 1. С. 10-16.
13. Камаева С. С. Этоний как лекарственное средство и перспективы его применения // Нижегородский мед. журн. 2006. № 4. С. 82-84.
Статья принята к печати 17 декабря 2008 г
