CC BY
23
УДК 504.054;504.064
ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ РАЗДЕЛЬНОГО И СОВМЕСТНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ТОКСИКАНТОВ НА DAPHNIA MAGNA
© 2006 г. А.А. Мунгиев, М.А. Мунгиева, З.М. Алиева
The purpose of work was research of the combined influence on the test - object (Daphnia magna) of two pollutants (petroleum and copper vitriol). The conclusion about an acceptability of a hypothesis "of a bottle neck" for the description of collateral influence of inhibitors on the zooplankton on a method of enzymatic kinetics is made.
Многие из химических соединений поступают в природные водоемы и почвы, но количество критериев оценки качества окружающей среды ограничено. Наиболее широко используются понятия предельно допустимой концентрации (ПДК) вещества, индексы загрязненности воды (ИЗВ) или атмосферы (ИЗА), учитывающие совокупную загрязненность среды химическими веществами - загрязнителями. Эти оценки проводятся с помощью формализованного расчета, включающего от 4 до 15 показателей загрязнения. К недостаткам такой оценки следует отнести слабое биологическое обоснование используемых критериев. В частности, ПДК никак не определяют степень биологического воздействия веществ, не имеют количественного биологического эквивалента их воздействия на экосистемы. Аналогично и ИЗВ и ИЗА, базирующиеся на ПДК, хотя и позволяют дать формализованную оценку суммарной загрязненности среды, не имеют определенного биологического смысла, а следовательно, не могут использоваться для прогнозирования отдаленных биологических последствий комплексного загрязнения окружающей среды.
Наш подход основан на предположении, что воздействие токсикантов на организм происходит на молекулярном (ферментативном) уровне. Методы, используемые при описании ферментативной кинетики, позволяют количественно оценить совокупное влияние нескольких ингибиторов на суммарную скорость процесса ферментативной реакции. Успешное использование принципа «узкого места» для описания поведения популяции микроорганизмов с помощью кинетических зависимостей [1, 2] позволяет предположить возможность применения этого метода и в экологии для прогнозирования отклика организма (и, следовательно, популяции в целом) на комбинированное воздействие токсикантов [3-5]. В качестве ингибиторов ферментов при этом предполагаются отдельные токсиканты.
Целью работы было исследование комбинированного (или совокупного) воздействия на тест-объект нескольких загрязнителей (в нашем случае двух) и оценка возможности использования моделей ингиби-рования для количественной оценки связи между концентрациями химических загрязнителей и мерой угнетения ими водной фауны. Положив в основу нашей работы принцип «узкого места» или лимитирующего звена, когда эффективность функционирования всей водной экосистемы определяется наиболее малоэффективным компонентом, мы провели ряд исследований по определению констант ингибирования
и максимальных скоростей гибели рачков Daphnia magna в случае загрязнения экосистем нефтью и медным купоросом [6].
Объект и методы исследований
В экспериментах был использован стандартный тест-объект - ветвистоусый рачок Daphnia magna Straus. В мг/л) и медь (CuSO4 ' 5H2O, 0,03-0,5 мг/л). Выбор загрязнителей объясняется тем, что данные по ним имеют наибольшие превышения над ПДК в прибрежной зоне Каспия [7]. Контролем служила вода без токсиканта. Критерием токсичности среды служила выживаемость дафний за 24, 48, 72 и 96 ч в каждой концентрации.
Экспериментальная проверка комплексного влияния ингибиторов на зоопланктон состояла из трех этапов. Сначала ставились острые опыты на выживаемость рачков для каждого токсиканта, затем были получены кинетические зависимости скорости гибели для нефти и медного купороса. На основании полученных констант был проведен опыт по их комплексному влиянию на жизнедеятельность дафний.
Результаты и обсуждения
Для получения первичных приближений кинетических коэффициентов использовался подход, аналогичный линейной анаморфозе Лайнуивера-Бэрка [8]. Мы имеем дело с кинетикой ингибирования, а не роста, поэтому использовали следующее модифицированное уравнение:
V = V maxS/ (Ks+S) х Кд/( Kp1 + P1) х
х Kp2/(Kp2 + P2) - V*, (1)
где Kp1, Kp2 - константы ингибирования токсикантов; S - субстрат; P1, P2 - ингибиторы; V- скорость поддержания.
Поскольку в опыте субстрат присутствует постоянно, дафнии получают достаточно корма, то S/(Ks+S) = 1 и формула (1) приобретает вид:
V = V maxx KpJ(Kp1 + P1) х Kp2 /(Kp2 + P2) - V\ (2)
Уравнение (2) использовалось для изучения совместного влияния двух загрязняющих веществ -нефти и медного купороса. Для каждого из них были получены константы и максимальная скорость инги-бирования.
Для практического получения величин Kp и Vmax обе части формулы выразили в виде обратных величин:
IV = - IV х(К тах/Р +1) (3)
/V /V тах V /Рп ' у '
Согласно уравнению (3), строится график зависимости IV от 1/Р, выражающийся прямой линией (рис.1). Отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен величине -1/Ктах, а абсцисс - величине —1/Кр.
На основании полученных данных можно рассчитать и предсказать теоретическую скорость гибели рачков дафний при совместном воздействии двух токсикантов.
Среднее количество выживших рачков в каждой концентрации, а также вычисленные средние удельные значения скорости их гибели представлены в табл. 1.
Таблица 1
Среднее количество выживших дафний (п) и средняя скорость их гибели (V ср) при действии нефти
Р, мг/л Количество выживших дафний V ср, 1/ч
Т,ч
24 48 72 96
50 5,3 4,6 3,6 0 -0,031
25 7,3 7 4,3 2,6 -0,014
12,5 6,6 6 5,6 5,3 -0,007
7 7,6 6,3 6 5,6 -0,006
3 9 8,6 7,6 6,6 -0,004
Построив график зависимости 1/У от 1/Р, согласно формуле (3) для нахождения максимальной скорости и константы ингибирования нефти, получаем значения -1/Кр = - 0,05, следовательно Кр нефти = 20 мг/л, так как - 1/Утах = - 45, Утах = 0,022 1/ч.
Среднее количество выживших рачков в каждой концентрации, а также вычисленные средние удельные значения скорости гибели рачков представлены в табл. 2.
Таблица2
Среднее количество выживших дафний (п) и средняя скорость их гибели ^ср) при действии медного купороса
и константы ингибирования меди, получаем значения -1/Кр = - 2, тогда Кр = 0,5 мг/л, а -1/Утах = - 35, следовательно, Утах = 0,029 1/ч.
Таким образом получены следующие значения: для нефти: Кр = 20 мг/л, Утах = 0,022 1/ч; для меди: Кр = 0,5 мг/л, Утах = 0,029 1/ч. Это позволяет рассчитать и предсказать теоретическую скорость гибели рачков дафний при совместном воздействии двух токсикантов.
Для проверки гипотезы «узкого места» проводился эксперимент по совместному влиянию двух загрязнителей. В пределах изученного в раздельных опытах диапазона концентраций меди и нефти был выбран ряд сочетаний концентраций для постановки проверочного эксперимента (табл. 3).
Таблица 3 Ряд сочетаний концентраций
№ ряда Pi (нефть), P2 (медный купорос),
мг/л мг/л
1 26 0,1
2 13 0,05
3 6,5 0,025
4 3,25 0,0125
5 1,625 0,006
Рассчитаем сначала теоретические скорости гибели при совместном действии ингибиторов, исходя из гипотезы «узкого места» [1], подставляя выбранные концентрации в (2):
1. V = 0,026 х (20 /(26 + 20) х 0, /(0,1 + 0,5) -1) = -0,017.
2. V = 0,026 х (20/ (13 + 20) х 0,5/ (0,05+0,5) -1) = -0,012.
3. V = 0,026 х (20/ (6,5 + 20)х, 0,5/ (0,025 + 0,5) -1) = -0,007.
4. V = 0,026х (20/ (3,25 + 20) х 0,5/ (0,0125+0,5) -1) = -0,004.
5. V = 0,026х (20/ (1,625+20) х 0,5/ (0,006+0,5) -1) = -0,002. Рассчитав теоретические скорости гибели рачков и
имея ряд концентраций ингибиторов, важно было определить, насколько практические (экспериментальные) скорости будут отличаться от теоретически рассчитанных. Обработка результатов проводилась по схеме двух предыдущих экспериментов. Для этого был построен график зависимости скоростей гибели от ряда концентраций токсикантов (рис. 2).
Рассчитаем стандартное отклонение полученных экспериментальных скоростей гибели рачков от ожидаемых теоретических по формуле [9]:
сту=а/1/ (1 - N )х£ ^ 2 =у! 1/ (1 - N )х X (уэ - у/1 )2 , где d - отклонение; у14 - теоретически рассчитанные значения скоростей в /-м эксперименте; у1э - экспериментальные значения скоростей в /-м эксперименте. Было получено уу=0,0035.
Определив относительную величину отклонения экспериментальных скоростей от теоретических (сту/Утах х 100 %), получим 0,0035/0,026 х 100 % = 13,5 %.
Количество выживших дафний Vср, 1/ч
Р, мг/л Т,ч
24 48 72 96
0,5 7,3 4,6 2,6 0,6 -0,027
0,25 9,3 7,6 6,3 4,6 -0,008
0,125 9,6 8,3 7 6 -0,005
0,06 10 8,6 8 7 -0,004
0,03 10 9,6 9 8,6 -0,002
Построив график зависимости 1/У от 1/Р, согласно формуле (3) для нахождения максимальной скорости
V, l/ч
Ряд С, мг/л
Теоретич.
Эксперимент
Рис. 2. Зависимость скорости гибели рачков от ряда концентраций токсикантов
Таким образом, отклонение экспериментальных от теоретически ожидаемых скоростей составило 13,5 %.
На основании этого можно сделать вывод о приемлемости гипотезы «узкого места» для описания совместного влияния ингибиторов на зоопланктон по методу ферментативной кинетики.
Литература
1. Чернавский Д.С., Иерусалимский Н.Д. // Управляемый биосинтез. М., l966. С. l9-24.
2. Швытов И.А. // Журн. общ. биол. l974. Т.35. № 6. С. 904-9l0.
3. Иерусалимский Н.Д., Неронова Н.М. // Докл. АН СССР. l965. Т. l6l. № 6. С. l437.
4. Dean A.C.K., Hinshelwood C. Growth function and regulation in bacterial cells. Oxford, l966. Р. 530.
5. Nagatani M., Shoda M., Aiba Sh. // J. of Ferment Technol., l968. Vol. 46. № 3. Р. 24l-248.
6. ПНДФ Т l4..lll:2:3:4.3-99. Токсикологические методы контроля: Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. М., l999.
7. Алиев Н.К., Абдурахманов Г.М., Мунгиев А.А., Гаджиев А.А. Экологические проблемы бассейна
Каспия. Махачкала, l997.
8. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики М., l979.
9. ТейлорДж. Введение в теорию ошибок. М., l985.
Дагестанский государственный университет
3 июня 200б г.
