CC BY
25
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ БОЛЕЗНЕЙ ОРГАНОВ КРОВООБРАЩЕНИЯ FUNDAMENTAL ISSUES IN CIRCULATORY SYSTEM DISEASES
УДК 616.13-089.844-77:577.12:615.9]-092.9
ИЗУЧЕНИЕ КАРДИОТОКСИЧНОСТИ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ТРУБЧАТЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИКСОВ, ПРИГОДНЫХ ВЫСТУПИТЬ В КАЧЕСТВЕ СОСУДИСТОГО ИМПЛАНТА МАЛОГО ДИАМЕТРА
Л. В. АНТОНОВА1, Е. А. СЕРГЕЕВА1, О. О. БАБИЧ2, А. Ю. ПРОСЕКОВ2, Т. В. ГЛУШКОВА1, О. В. ГРУЗДЕВА1, А. А. КУЗЬМИНА1, Л. С. БАРБАРАШ1 1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Россия 2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Кемеровский технологический институт пищевой промышленности», Кемерово, Россия
Проведен анализ кардиотоксичности продуктов деградации полимеров полигидроксибутирата/валерата и поликапролакто-на, явившихся основой для изготовления трубчатого каркаса методом электроспиннинга и подвергнутых 6-месячной гидролитической деградации в стерильном фосфатно-солевом буфере при температуре 37 °С. Исследование состава аналитов на наличие мономеров и прочих соединений после инкубации матриксов в буфере проводили ежемесячно с помощью жидкостной хроматографии. Кардиотоксичность аналитов оценивали на модели изолированного сердца крыс-самцов линии Wistar методом Langendorff. На фоне введения аналитов измеряли скорость коронарного протока и изучали ферментативную активность миокардиальной фракции креатинфосфокиназы и лактатдегидрогиназы. Полигидроксибутират/валерат и поликапролактон не имели достоверных признаков распада до мономеров через 6 месяцев гидролитической деградации, а фосфатно-солевой буфер, в котором инкубировали данные образцы в течение 6 месяцев, не вызывал кардиотоксического эффекта в экспериментах на модели изолированного сердца и достоверного повышения активности ферментов в перфузате.
Ключевые слова: биорезорбируемые полимеры, гидролитическая деградация, лактатдегидрогеназа.
EVALUATION OF CARDIOTOXICITY OF HYDROLYTIC DEGRADATION PRODUCTS OF TUBULAR POLYMER MATRICES SUITABLE FOR SMALL DIAMETER VASCULAR GRAFTS
L. V. ANTONOV^, E. A. SERGEEVA1, O. O. BABICH2, A. YU. PROSEKOV2, T. V. GLUSHKOVA1, O. V. GRUZDEVA1, A. A. KUZMINA1, L. S. BARBARASH1 1 Federal State Budgetary Scientific Institution Research Institut for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia 2 Federal State Budget Educational Institution of Higher Education Kemerovo Institute of Food Science and Technology, Kemerovo, Russia
The evaluation of cardiotoxicity of the degradation products of electrospunpolyhydraxybutyrate-valerate and polycaprolactone tubular matrices, subjected to 6-month hydrolytic degradation in sterile phosphate buffered saline (PBS) at 37 °C, was performed. After matrices incubation in PBS, high performance liquid chromatography was used to analyze individual analytes for the presence of monomers and other compounds each month. Cardiotoxicity of analytes was evaluated in a model of isolated perfused rat heart (male Wistar rats) using the Langendorff technique. The rate of coronary flow and enzymatic activity of creatine phosphokinase and lactate dehydrogenase myocardial fractions were measured during the analytes injections. Both, polyhydroxybutyrate-valerate and polycaprolactone, had no significant signs of hydrolytic degradation of polymers into monomers after 6-month storage time. PBS after 6-month incubation of the studied samples did not produce any cardiotoxic effect in the experiments on isolated rat heart and did not demonstrate any significant increase of enzyme activity in the perfusate.
Key words: bioresorbable polymers, hydrolytic degradation, chromatography, cardiotoxicity, creatine phosphokinase, lactate dehydrogenase.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в реконструктивной хирургии, по-прежнему остается актуальным поиск новых высокофункциональных материалов, пригодных для кон-
струирования систем, способных воспроизвести биологические функции живого организма [1, 2]. На сегодняшний день одной из нерешенных проблем в кардиохирургии является отсутствие
протезов для замещения артерий малого диаметра. Однако интенсивное развитие тканевой инженерии в последние годы стимулировало разработку методов создания различных гибридных органов, в том числе протезов кровеносных сосудов [2-6].
Наиболее перспективными для создания сосудов малого диаметра являются биодеградиру-емые полимеры, такие как полиоксиалканоаты и поликапролактон. Отличительная особенность этих полимеров - способность постепенно замещаться новообразованной тканью, претерпевая деградацию и разлагаясь в организме до простейших нетоксичных веществ (в идеале - углекислый газ и вода). На основе данных полимеров создаются шовные материалы, трансплантаты для восстановления хрящевой, костной ткани и кожи [2, 7-9]. Ведутся разработки по созданию сосудистых протезов [10-13]. При этом материал, на основе которого создаются конструкции, предназначенные для имплантации в сосудистое русло, помимо достаточных прочностных характеристик должен обладать высокой биологической совместимостью с клетками и тканями организма и низкой токсичностью продуктов собственной резорбции. Место локации сердечно-сосудистых имплантов обеспечивает длительное влияние продуктов резорбции материалов, на основе которых изготовлены импланты, в первую очередь на сердечнососудистую систему. Поэтому изучение кардио-токсичности данных материалов должно являться неотъемлемым атрибутом при разработке изделий для нужд сердечно-сосудистой хирургии.
Цель. На модели изолированного сердца крысы изучить кардиотоксичность продуктов гидролитической деградации полимерных трубчатых каркасов на основе полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона, инкубируемых в стерильном фосфатно-солевом буфере в течение 6 месяцев.
Материалы и методы
Для осуществления 6-месячного эксперимента по изучению кардиотоксичности продуктов гидролитической деградации полимеров, потенциально пригодных выступить в качестве материала для изготовления биорезорбируемого каркаса сосудистого импланта малого диаметра, на основе раствора полигидроксибутирата/валерата (ПГБВ) с включением гидроксивалерата не более 10 % (Sigma-Aldrich, США) и поликапролактона (ПКЛ) с молекулярной массой 80 тыс. кДа (Sigma-АЫйЛ, США) в хлороформе ХЧ (Вектон, Россия) методом электроспиннинга на аппарате КАКОК (МЕСС, Япония) были изготовлены трубчатые не-
тканые матриксы с использованием следующего режима: напряжение - 20 кВ, скорость подачи -0,3 мл/ч, игла - 22G, диаметр намоточного коллектора - 4 мм.
Структуру поверхности матриксов изучали методом сканирующей электронной микроскопии в условиях высокого вакуума на микроскопе Hitachi S 3400 N (Япония).
Полученные трубчатые нетканые матриксы были разделены на одинаковые части длиной 2,5 см, взвешены в сухом состоянии и подвергнуты газовой стерилизации с использованием этиленоксида. Затем матриксы (всего 18 шт.) помещены по одному в стерильные пробирки типа Эппендорф, заполненные стерильным фосфатно-солевым буфером с рН 7,4±0,2, и в термостат с выставленной температурой 37 °С. В течение 6 месяцев ежемесячно (в соответствии с требованиями ГОСТа ИСО 10993-13-2009) начиная со второго месяца по три пробирки с образцами изымали и осуществляли следующие виды исследований: определение массы высушенного образца после инкубации, измерение рН аналита, определение мономеров и прочих соединений в аналите методом газовой хромато-масс-спектрометрии, выявление кардиотоксичности аналитов на системе изолированного сердца с измерением скорости коронарного протока и ферментативной активности миокардиальных маркеров в оттекаемом перфуза-те. В качестве контроля во всех исследованиях выступил интактный стерильный фосфатно-солевой буфер (группа PBS0).
Исследование состава аналита на наличие мономеров и прочих соединений было проведено методом газовой хромато-масс-спектрометрии (газовый хромато-масс-спектрометр GCMS-QP2010 Ultra / GCMS-QP2010 SE, Shimadzu, Япония) с предварительным определением общей фракции липидов по методу Фолча.
Кардиотоксичность аналитов оценена на модели изолированного сердца крыс-самцов линии Wistar методом Langendorff с выполнением всех требований и принципов гуманного обращения с экспериментальными животными. Все эксперименты проводились в осенний период. Было выполнено шесть серий экспериментов, послуживших формированию пяти опытных групп и одной контрольной, каждая из которых включала по шесть животных. Все серии следовали одному алгоритму.
Через 15 минут после наркотизации тиопента-лом натрия (25 мг/кг внутрибрюшинно) животному проводили срединную торакотомию. Быстро извлекали сердце с достаточно длинной аортой
для канюлирования и погружали в «ледяной» (t = 2-4 °С) раствор Кребса - Хензеляйта следующего состава (мМ): NaCl - 118; NaHCO3 - 25; глюкоза -11; KCl - 4,8; KH2PO4 - 1,2; MgSO4 - 1,2; CaCl2 -1,2. После прекращения спонтанных сокращений выделяли аорту, фиксировали, надев ее на канюлю перфузионной системы. Начинали перфузию методом Langendorff по открытому контуру 25 минут раствором Кребса - Хензеляйта, обогащенным карбогеном (95 % O2, 5 % CO2), pH = 7,3-7,4 при t = 37 °C под давлением 80 см вод. ст.
На 26-й минуте поток раствора Кребса - Хензеляйта перекрывали. Вместо него в течение 6 секунд через канюлю вводили подогретый до 37 °C 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), что определило первую серию экспериментов как контрольную группу (PBS0). Аналогично сформированы опытные группы:
2-я группа - введение аналита (инкубируемого с образцом буфера), в котором образец граф-та находился в течение двух месяцев (PBS2),
3-я группа - в течение трех месяцев (PBS3),
4-я группа - четырех месяцев (PBS4), 5-я группа - пяти месяцев (PBS5) и 6-я группа - шести месяцев (PBS6).
Дальнейший этап был един для всех групп. После введения «интактного» PBS или PBS, в котором определенное количество времени находились образцы, поток раствора Кребса - Хензе-ляйта восстанавливали и незамедлительно начинали собирать перфузат, оттекающий от сердца каждую минуту в течение 5 минут, для измерения коронарного протока и последующего проведения прочих вышеуказанных исследований. Повреждение кардиомиоцитов определяли по ферментативной активности миокардиальных маркеров в забранном перфузате: миокардиальной фракции креатинфосфокиназы (КФК - МБ) и лактатдеги-дрогиназы (ЛДГ). Активность ферментов определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30i фирмы Thermo Fisher Sientific (Финляндия) с использованием стандартных тест-систем этой же фирмы.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statis-tica 6.0. Нормальность распределения оценивали при помощи критерия Колмогорова - Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни для несвязных пар. При всех видах статистического анализа учитывался уровень статистической значимости 95,0 % (р<0,05). Данные представляли как медиана и квартильный размах Ме (25 %; 75 %).
Результаты и обсуждение
На основе раствора ПГБВ/ПКЛ методом электроспиннинга получены трубчатые матриксы с высоким отношением площади поверхности к объему. Матриксы образованы хаотично расположенными нитями толщиной 1,8-2,45 мкм, формирующими при своем расположении поры размером 21,3-34,8 мкм (рис. 1).
Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия нетканых матриксов на основе ПГБВ/ПКЛ, выполненных методом электроспиннинга: а, б - внутренняя поверхность; в, г - вид трубчатых матриксов на поперечном разрезе
Суммарная масса сухих образцов трубчатых каркасов на основе ПГБВ/ПКЛ до начала эксперимента составила 0,5149 г, а на последней временной точке эксперимента (спустя 6 месяцев инкубации) - 0,5082 г. Таким образом, достоверной разницы изменения суммарной массы инкубируемых полимерных образцов не выявлено. Также не отмечено изменений рН аналита на разных сроках инкубации.
Результаты исследования аналитов (стерильного фосфатно-солевого буфера, в котором инкубировали трубчатые полимерные матриксы) методом газовой хромато-масс-спектрометрии показали, что анализируемые образцы содержат следующие компоненты: 1-фенантрен-карбо-новую кислоту; 1,2,3,4,4а,9,10,10а-тетрагидро-1-метил-метиловый эфир; 2-метил-6-фенил-1,6-гептадиен; 1,3,5-трис(3-метил)-3-бутенилбензол; 1,1'-бис(2-пентен-1,5-диил)-бензол; 1,Г-бис(2-пентен-1,5-диил)-бензол; 2-бензофуранкарбоно -вую кислоту; цис-2,4,5,6,7, 7а-гексагидро-4,4,7а-триметил-метиловый эфир; 5-(фенил-цикло-пентил)-[1,3,4] оксадиазол-2-2-тиол, додекаме-тилциклогексилоксан и 3-изопрокси-1,1,1,7,7,7-
в
г
гексаметил-3,5,5,-трис (триметилсилокси)- тетра-силоксан, додекаметилциклогексилоксана, 3-изо-прокси-1,1,1,7,7,7-гексаметил-3,5,5,-трис (триме-тилсилокси)-тетрасилоксан. Данные соединения являются остатками растворителя, фосфатно-солевого буфера, а также побочными продуктами взаимодействия компонентов, используемых при пробоподготовке образцов.
Известно, что изменение скорости коронарного протока изолированного сердца крысы во времени при введении испытуемых аналитов может отражать угнетение функционирования миокарда в динамике. Поэтому нами была измерена скорость коронарного протока каждую минуту в течение 5 минут при введении образцов аналитов контрольной и опытных групп. Выявлено, что изменение скорости коронарного протока каждой исследуемой минуты между опытными группами (PBS2 - PBS6) и контролем (PBS0) на фоне введения аналитов находилось в недостоверном разбросе значений (рис. 2).
Как известно, увеличение выхода ферментов различной ультраструктурной локализации в коронарный проток указывает на повышение проницаемости мембран кардиомиоцитов [14]. Перфузия изолированных сердец PBS, в котором различное время инкубировали образцы трубчатых матрик-сов на основе ПГБВ/ПКЛ, не повлияла на увеличение выхода ферментов (КФК-МВ, ЛДГ) в коронарный проток. Самая низкая ферментативная активность КФК-МВ отмечена в перфузате групп PBS2, PBS3 и PBS4 (рис. 3). Подъем ферментативной активности КФК-МВ групп PBS5 и PBS6 мог указать на минимальное накопление продуктов гидролитической деградации полимеров, которое
тем не менее достоверно не повлияло на проницаемость мембран кардиомиоцитов (рис. 3).
При изучении активности ЛДГ в перфузате после введения аналитов и контрольного раствора PBS выявлено, что при введении аналита опытных групп ферментативная активность ЛДГ в перфузате на 1, 2, 3 и 5-й минутах достоверно отличалась от таковой в контрольной группе. Так, активность ЛДГ в группах PBS3 - PBS6 на 1, 3, 5-й минутах практически равнялась 0, что привело к достоверному отличию от контрольной группы (рис. 4а, б, в, д). Недостоверный всплеск активности ЛДГ на 1-й минуте в группе PBS2 мог явиться адаптивной реакцией в ответ на присутствие в аналите остатков органического растворителя на ранних сроках проводимого эксперимента, что было доказано при проведении хроматографического исследования. А появление на 4-й минуте недостоверного повышения активности ЛДГ в группах PBS5 и PBS6 могло указывать на возможное (неулавливаемое) накопление минимального количества продуктов распада полимеров спустя 5 месяцев гидролитической деградации и далее (рис. 4г).
Отсутствие достоверного повышения ферментативной активности ЛДГ и даже ее достоверное снижение указали на сохранение целостности мембраны кардиомиоцитов и отсутствие кардио-токсического влияния продуктов деградации полимеров ПГБВ и ПКЛ, из которых были изготовлены трубчатые нетканые матриксы.
Заключение
Сердечно-сосудистые импланты постоянно контактируют с кровью и элементами сердечно-
мп/мин 20
мп/мин 20
мп/мин 20
Hill ЯШ HilI
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
мл/мин
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
мл/мин
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
20 15
10
0
20
Hill
I И 111
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
Рис. 2. Изменение скорости коронарного протока (СКП) на фоне введения аналитов опытных и контрольной групп: а - на 1-й минуте введения аналитов; б - на 2-й минуте; в - на 3-й минуте; г - на 4-й минуте; д - на 5-й минуте
Ед/л
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 а
Ед/л 6
Ед/л
ь
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 б
Ед/л
ь
2 Л О
J_L
Ед/л 6
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 в
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 г
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 д
Рис. 3. Изменение ферментативной активности КФК-МВ на фоне введения аналитов опытных и контрольной групп: а - на 1-й минуте введения аналитов; б - на 2-й минуте; в - на 3-й минуте; г - на 4-й минуте; д - на 5-й минуте
РВвО РВ82 РВЯЗ РВ84 РВ85 РВвб РВЭО РВ82 РВБЗ РВ84 РВ85 РВвб г д
Рис. 4. Изменение ферментативной активности ЛДГ на фоне введения аналитов опытных и контрольной групп: а - на 1-й минуте введения аналитов; б - на 2-й минуте; в - на 3-й минуте; г - на 4-й минуте; д - на 5-й минуте
Ед/л 50 40 30 20 10 0
Ш
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
Ед/л 100 -80 -60 -40 -20 -п
Ед/л 50 40 30 20 10 0
Ед/л
50 40 30 20 10 0
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6 б
Ед/л
- 30
PBSO PBS2 PBS3 PBS4 PBS5 PBS6
20
10
I
Т
сосудистой системы. Поэтому материалы, на основе которых изготавливаются данные изделия, должны быть биосовместимы, гемосовместимы и не должны обладать кардиотоксичностью. Биосовместимые биорезорбируемые полимеры полигидроксибутират/валерат и поликапролак-тон, использованные в наших разработках в качестве основного материала для изготовления трубчатого каркаса, через шесть месяцев гидролитической дергадации не имели достоверных признаков распада до мономеров, а аналит, полученный в процессе 6-месячной инкубации трубчатых матриксов в фосфатно-солевом буфере, не вызывал кардиотоксического эффекта в экспериментах на модели изолированного сердца. Полученные результаты подтверждают
возможность использования полигидроксибу-тирата/валерата и поликапролактона в качестве основы для изготовления сосудистых имплантов малого диаметра.
Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-2500050) в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ / REFERENCES
1. Алехин А. П., Болейко Г. М., Гудкова С. А., Марке-ев А. М., Сигарев А. А., Токнова В. Ф. и др. Синтез биосовместимых поверхностей методами нанотехнологии. Российские нанотехнологии. 2010; 5 (9-10): 128-136.
Alekhin A. P., Boleiko G. M, Gudkova S. A., Markeev A. M., Sigarev A. A., Toknova V. F. et al. Synthesis of biocompatible surfaces by nanotechnology methods. Nanotechnologies in Russia. 2010; 5 (9-10): 128-136. [In Russ].
2. волова Т. г., Севастьянов в. и., Шишацкая е. и. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины. Красноярск; 2006.
Volova T. G., Sevastyanov V. I., Shishatskayaof E. I. Poliok-sialkanoaty - biorazrushaemye polimery dly ameditsiny. Krasnoyarsk; 2006. [In Russ].
3. Buguneid M. S., Seifalian A. M., Salacinski H. J., Murray D., Hamilton G., Walker M. G. Tissue engineering of blood vessels. Brit. J. Surg. 2006; 93: 282-290.
4. Zhang W. J. Tissue engineering of blood vessel. Cell. Mol. Med. 2007; 11(5): 945-957.
5. Pankajakshan D., Agrawal D. K. Scaffolds in tissue engineering of blood vessels. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 2010; 88(9): 855-873.
6. Naito Y., Shinoka T., Duncan D. Vascular tissue engineering: towards the next generation vascular grafts. Advanced Drug Delivery Reviews. 2011; 63(4): 312-323.
7. Luo S., Netravali A. N. Characterisation of henequen fibers and the henequen fiber/poly (hydroxybutyrate-co-hydro-xyvalerate) interface. J. Adhesion Sci. Technol. 2001; 15(4): 423-437.
8. Deng Y., Lin X. S., Zheng Z., Deng J. G., Chen J. C., Ma H. et al. Poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyhexanoate) promoted production of extracellular matrix of articular cartilage chondrocytes in vitro. Biomaterials. 2003; 24: 4273-4281.
9. Lowery J. L., Datta N., Rutledge G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human
dermal fibroblasts in electrospun poly(s-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 2010; 31: 491-504.
10. Nottelet B., Pektok E., Mandracchia D., Tille J.,, Walpoth, B., Gurny R. et al. Factorial design optimization and in vivo feasibility of poly(e-caprolactone)-micro- and nano-fiber-based small diameter vascular grafts. J. of Biomedical Materials Research. 2008; 89: 865-875.
11. Pektok E. Degradation and healing characteristics of small-diameter poly(s-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation. Circulation. 2008; 118 (24): 2563-2570.
12. Soletti L., Hong Y., Guan J., Stankus J. J., El-KurdiM. S., Wagneret W. R. et al. A bilayered elastomeric scaffold for tissue engineering of small diameter vascular grafts. Acta Biomater. 2010; 6: 110-122.
13. Севостьянова в. в., васюков г. Ю., Борисов в. в., Бураго А. Ю., Формокидова Ю. Н., головкин А. С. Стимуляция ангиогенеза матрицами из поликапролактона, содержащими VEGF. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2013; 4: 28-34.
Sevost'yanova V. V., Vasyukov G. Yu., Borisov V. V., Burago A. Yu., Formokidova Yu. N., Golovkin A. S. Stimu-lyatsiya angiogeneza matritsami iz polikaprolaktona, soder-zhashchimi VEGF. Kompleksnye problemy serdechno-sosud-istykhzabolevaniy. 2013; 4: 28-34. [In Russ].
14. Долгих в. Т. Повреждение и защита сердца при острой смертельной кровопотере. Омск; 2002.
Dolgikh V. T. Povrezhdenie i zaschita serdtsa pri ostroy smertelnoy krovopotere. Omsk; 2002. [In Russ].
Статья поступила 25.03.2015
Для корреспонденции: For correspondence:
Антонова Лариса Валерьевна Antonova Larisa
Адрес: 650002, г. Кемерово, Address: 6, Sosnoviy blvd., Kemerovo,
Сосновый бульвар, д. 6 650002, Russian Federation
Тел. 8 (3842) 64-42-38 Tel. +7 (3842) 64-42-38
E-mail: antolv@kemcardio.ru E-mail: antolv@kemcardio.ru
