CC BY
12
ЗАЩИТА рАСТЕНИЙ
о-
doi: 10.24412/0044-3913-2023-6-37-40 УДК 635.21:578.864.1
Изучение изолятов У-вируса картофеля, распространенных на территории различных регионов Российской Федерации, с использованием новых молекулярных маркеров
А.А. СТАХЕЕВ1, кандидат биологических наук, научный сотрудник А.И. УСКОВ2, доктор сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник (e-mail: [email protected]) Ю.А. ВАРИЦЕВ2, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник П.А. ГАЛУШКА2, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник Л.Б. УСКОВА2, старший научный сотрудник
С.В. ЖЕВОРА2, доктор сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник С.К. ЗАВРИЕВ1, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, зав. отделом Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, Москва, 117997, Российская Федерация 2Федеральный исследовательский центр картофеля имени А. Г. Лорха, ул. Лорха, 23, пос. Красково, Люберецкий р-н, Московская обл., 140051, Российская Федерация
Исследования проводили с целью изучения генетического полиморфизма изолятов YBK с использованием новых маркерных последовательностей. Работу выполняли в 2022-2023 гг. Для анализа использовали предварительно отселектированные по серо-типу изоляты YBK, отобранные в 2017г. на материале отечественных и зарубежных сортов из различных регионов Российской Федерации. В качестве потенциальных маркеров, обладающих высокой филогенетической информативностью, были выбраны 3локуса: ген белка оболочки (Cp), 5'-нетранслируемая область NTR, а также ген белка VPg, который ковалентно связывается с 5'-концом РНК и выполняет функцию регулятора транскрипции. Наибольшая эффективность амплификации (100 % исследуемых образцов кДНК) достигнута при использовании фрагмента NTR. Он
также был наиболее филогенетически информативным: сравнительный анализ изучаемых последовательностей показал наличие 23,8 и 15 % вариабельных и филогенетически информативных позиций соответственно. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа маркерной последовательности NTR, содержало несколько кластеров, поддержанных высокими бутстрэп-значениями, в которые входили изоляты подгрупп YBKNTN - Ред Скарлетт (III), Ред Скарлетт(5-4), Дуня (7-12); YBKN:0 - Пом-дор, Загадка, Нида; YBK°/C - Пикассо, Фаворит (III), CH991131 (8-2), Флорис (7-14), Романо (5-3); YBKWilga - Ред Скарлетт (6-10), Кенза, а также типовые штаммы, относящиеся к этим подгруппам, маркерные последовательности которых депонированы в базе данных NCBI. Изолят, выделенный на сорте картофеля Жуковский ранний (5-2), при филогенетическом анализе маркерных последовательностей нуклеотидов локуса NTR занимал промежуточное положение между некротическим и ординарным кластерами, образуя отдельную ветвь и не группируясь ни с одним из типовых штаммов. Анализ отсеквенированных последовательностей в целом подтвердил первоначальную серологическую идентификацию исследуемых образцов, демонстрирующую преобладание некротической и рекомбинант-ной групп штаммов.
Кпючевые слова: Y-вирус картофеля, ординарные штаммы, некротические штаммы, генетические маркеры, филогенетический анализ.
Дпя цитирования: Изучение изолятов Y-вируса картофеля, распространенных на территории различных регионов Российской Федерации, с использованием новых молекулярных маркеров / А. А. Стахеев, А. И. Усков, Ю.А. Варицев и др. //Земледелие. 2023. № 6. С. 37-40. doi: 10.24412/0044-39132023-6-37-40.
Y-вирус картофеля (YBK) - наиболее вредоносный из вирусов, поражающих эту культуру, широко распространен повсеместно в мире, в том числе на территории Российской Федерации [1]. Развитие тяжелых форм заболеваний, вызываемых YBK, приводит к значительному
снижению урожая культуры и ухудшению семенных и товарных качеств клубней картофеля [2].
В природной популяции УВК представлен рядом штаммов, различающихся по патогенезу, серологическим и молекулярным свойствам [3]. Важной особенностью УВК служит высокая способность к рекомбинации геномов его штаммов, в результате чего появляются новые изоляты, сочетающие свойства ординарной и некротической групп штаммов [4].
При изучении штаммового разнообразия УВК было выявлено, что около половины изолятов, отобранных из различных регионов Российской Федерации, проявляли серологическое родство к ординарному штамму УВКО/С[5]. Одновременно в образцах, поступивших из Беларуси, напротив, выявляли до 40 % изолятов с серологическим родством к некротическому штамму УВКМ [б].
При оценке фитопатологических характеристик с использованием индикаторных растений табака у 1/3 российских изолятов УВК выявлены симптомы, характерные для ординарной группы штаммов (мозаика и просветление жилок). Остальные изоляты УВК на индикаторах вызывали образование некрозов, характерных для некротической группы штаммов [7].
Сопоставление серологических и фитопатологических характеристик изолятов УВК, распространенных на территории Российской Федерации, выявило значительное преобладание (около 70 %) некротических и рекомбинантных штаммов, что в наибольшей степени было характерно для Московской, Кемеровской и Вологодской областей. На долю ординарных штаммов приходилось не более четверти всех изолятов с моноинфекцией, при этом большая их часть выделена в образцах из Новосибирской и Брянской областей [7].
Использование методов моле-кулярно-генетического анализа позволяет контролировать генетическую изменчивость изолятов УВК и проводить их штаммовую идентификацию [8].
В молекулярно-генетических исследованиях продуктов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) изолятов УВК из различных российских регионов с использованием ряда специфических праймеров [9] вы- е явлено значительное распространение Л в выборке некротической и особенно ® рекомбинантной групп штаммов. При ^ этом почти в половине образцов были и идентифицированы совместно изоляты о руу^™ и руум-™/И: 0 [6]. Аналогичные ре- О зультаты, демонстрирующие преоблада- о ние рекомбинантных штаммов, получены 0 при использовании для идентификации з изолятов У-вируса картофеля системы ы
мультиплексного ОТ-ПЦР [10], в которой использовали набор праймеров, подобранных к пяти точкам рекомбинации генома YBK [5].
В то же время в образцах из Беларуси преобладали изоляты некротической группы, в том числе штамма кольцевого некроза клубней PVYNTN, на долю которого приходилось свыше 45 % всех анализируемых изолятов [6].
В рамках совершенствования стратегии борьбы с Y-вирусом картофеля важно отслеживать генетический полиморфизм его штаммов на территории Российской Федерации.
Цель исследований - поиск новых маркерных последовательностей для создания высокоспецифических систем диагностики патогена, а также анализа генетического полиморфизма разработанных маркеров у изолятов YBK из различных регионов России.
Работу выполняли в 2022-2023 гг. В исследовании использовали предварительно отселектированные по серо-типу изоляты YBK из коллекции ФИЦ картофеля имени А. Г Лорха, отобранные в 2017 г на материале отечественных и зарубежных сортов из Московской и Вологодской областей РФ. Названия сортов использованы для обозначения изолятов УВК, на которых они были выделены при тестировании материала из различных регионов. В опыте изучали изоляты: Ред Скарлетт (6-10), Жуковский ранний (5-2), Любава(4-6), Романо (53), Ред Скарлетт (5-4), Пикассо, Помдор, СН991131 (8-2), Блондин (7-10), Флорис (7-14), Дуня (7-12), Кенза, Ред Скарлетт (III), Фаворит (III), Загадка, Нида.
Нуклеиновые кислоты выделяли с применением комплектов реактивов Проба-НК (ООО «АгроДиагностика», Россия) в соответствии с протоколом производителя. Для реакции обратной транскрипции использовали набор RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit («ThermoScientific», США).
Дизайн праймеров и флуоресцентно меченых зондов проводили с помощью выравнивания последовательностей нуклеотидов ряда локусов детектируемых организмов, депонированных в базе данных Национального центра биотехнологической информации (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank). Для выравнивания использовали алгоритм ClustalW [11].
ПЦР проводили в амплификато-ре Терцик (ДНК-технология, Россия) в соответствии со следующими программами амплификации: для праймеров со NTRF-R - 93 °C - 90 с; 93 °C - 20 с, 64 °C - 5 о с, 67 °C - 5 с(5 циклов); 93 °C - 1 с, 64 °C - 5 N с, 67 °С-5с (40циклов); для праймеров ® VPgF-R - 93 °C - 90 с; 93 °C - 20 с, 62 °C - 10 z с (5 циклов); 93 °C - 1 с, 64 °C- 5 с, 67 °C - 5 с s (40 циклов); для праймеров CpF-R - 93 °C -§ 90 с; 93 °C - 20 с, 55 °C - 10 с (5 циклов); J 93 °C - 1 с, 64 °C - 5 с, 67 °C - 5 с (40 циклов).
Состав буфера для проведения ПЦР | был универсальным для всех реакцион-П ных смесей: 18 мкл 10-кратного буфера
AJ890350 .1 (210)
НМ991454 .1 (175)
КУВ4в017 .1 (160)
MN607711 .1 (209)
ОИ 50414 Л (209)
QL472163 Л (201)
F (1)
AJ890350 .1 (942)
НМ991454 .1 (907)
KY84B017 .1 (S92)
МК607711 Л (941)
OL472163 .1 (933)
ОР150414 .1 (941)
R (1)
TGTTTCGGTTCGT ТТ'ЗАА^П CA A§CTgCCAT ACTfiAC ССС.ЯВЯПВ CAATTCGGTTCCATTGAAT Л А : .Т -..Т', CCCCTTTTGA CAGTTTGGTTCCATTGAAT ■ V , А • ¡T С CTCCTTTTGG
TGTTTCGGTTCGT TTGAAÏG С АйИствс СЛТАСТЕ АССО "JÇCTCT TGC GG TGTTTCGOïrcGT TTGAAÎGC лак;ЖССАТ ACTMCÍCCíÍg&TTGCGG TGTTTCGGTTCGT TTGAAÎ1 ¡САЛНСТИССАТ АСТЖАС СС< :CCTCTTGCG(3
-------------------GCAARCTHCCAT ACTCAC CCG--------
94 0 ___995
GAGGGCATAT TGAT AG T : G : 0C A0G AAC A A. A АА'ГСТ A T G AT GG GAGGGTCTATTTATAGT ' T A: G AT .-V ■ A AAATCTATGATGC G A G GG ССТЛТТС AT AG'EGC GT GGfcJcAlG AAG A ЛАЛТГ TAT G AT GC G AGGG CCTATTC ATÎBgcGT GGKT Je AIG AAG ( ЙлАААТСТАТСАТ GC G A GGG CCT AT TC AT AGÏGCGT IgItC^C AGG AAG i .г ДЛ AAATGT AT G AT GG G AGGGCCT ATTCATAGiGffiGT GGSTA; AJGAAG GS A^AATCTATGAI'ÖC -----------------GCGTGGRTCGCAYGAAGGAA-------------
Рис. 1. Выравнивание участков 5'-нетранслируемой области (NTR), использованных для подбора прямого (верхняя часть рисунка) и обратного (нижняя часть рисунка) праймеров.
(750 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 200 мМ сульфат аммония, 0,1 % Твин-20); 0,5 мМ каждого dNTP; по 6,25 пмоль праймеров; 1,25 ед. Taq - полимеразы и кДНК в концентрации 10 нг на реакцию.
Маркерные фрагменты УВК клонировали с использованием набора Quick-TA kit (Евроген, Россия) по протоколу производителя. Секвенирование молекул кДНК проводили в ЗАО «Евроген» с использованием набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.
Продукты амплификации разделяли с использованием гель-электрофореза [12].
Филогенетический анализ трех маркерных последовательностей осуществляли в пакете программ MEGAX. ДНК-маркеры с охарактеризованной последовательностью нуклеотидов сравнивали с типовыми последовательностями, депонированными в базах данных GenBank NCBI с использованием алгоритма BLAST. Построение филогенетических деревьев осуществляли методами максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) и связывания соседей (neighbor joining, NJ), а также модели нуклеотидных замен
Инсерции и делеции не учитывали. Количество вариабельных, филогенетически информативных нуклеотидов и гапло-типов для каждого маркера вычисляли в программе DnaSP v6 [15].
В качестве потенциальных маркеров, обладающих высокой филогенетической информативностью, были выбраны 3 локуса: белок оболочки (Ср), 5'-нетранс-лируемая область NTR, а также белок VPg, который ковалентно связывается с 5'-концом РНК и выполняет функцию регулятора транскрипции. Эти белки ранее использовали для филогенетических исследований УВК, однако не проводили сравнений ключевых филогенетических характеристик этих генов друг с другом.
Подбор праймеров осуществляли с таким расчётом, чтобы они могли амплифи-цировать участки генома максимального количества штаммов различных групп, но при этом не амплифицировали неспецифические участки генома. Для этого проводили выравнивание консервативных участков генома, характеризующихся низким уровнем вариабельности (рис. 1). Еще одним важным требованием к подбираемым праймерам была температура отжига не менее 55 °С и разность расчетных температур прямого и обратного праймеров не более 5 °С (табл. 1).
1. Структура праймеров, использованных для секвенирования маркерных
Локус Структура праймера, 5'...3' Размер ампликона T * m
NTR F: GCAARCTWCCATACTCACCCG R: TYCCTTCGTGYGAYCCACGC ~ 700 п.о. (пар оснований) 65
VPg F: AGT TGR RAC TGT GTC TCA CCA RGG R: AAR CCT CTC ATG AGYGAT TTR GC ~ 600 п.о. 64
Cp F:CTT ATG AAG TRC ACC ATC AAG R: ATA AGC CCA TTC ATC ACA GT ~ 400 п.о. 55
- расчётная температура отжига; F - прямой праймер; R - обратный.
GTR+G (General Time Reversible, с гамма-распределением) [13] в программе MEGA5.1. Достоверность топологий филогенетических деревьев подтверждали методом бутстрэп-анализа (англ. bootstrap) с 1000 повторностей [14].
Отсеквенированные фрагменты маркерных генов анализировали с помощью программы BLASTи сравнивали с последовательностями типовых штаммов УВК различных групп (табл. 2).
2. Номера типовых штаммов У-вируса картофеля различных групп в базе данных GenBankNCBI
Подгруппа Номер последовательности в GenBankNCBI
Ординарные штаммы Wilga KR816261, KR816227, KX130918, MN607716, MH006955 AJ890350, AM113988, KY847997
NTN HM368660, HQ631374, KX856968, AJ890343, KC634006, HQ631375
3. Результаты сравнительного анализа структуры последовательностей изолятов Y-вируса картофеля
Образец Маркерный участок, соответствие базе данных Kластер
С D NTR VP 1 a
Ред Скарлетт (6-10) YBK™'98 YBK™'9® YBKN YBK^'a®
Жуковский ранний (5-2) rii^fii-ini-i/ л а\ - YBK(?) VD l/Wilaa - YBK(?) VD l/Wilaa
люоава(4-б) Романо (5-3) YBKN:O YBK9® YBK0^ YBK^'a® YBKW"aa YBK0/С
Dan Pfiin пon—г / [> Л \ УВКО/С VRk'NTN VRk'NTN
Ред Скарлеп (5-4) Пикассо YBK°/i: TBK YBK0^ YBK^'a® YBK YBK0/С
Помдор YBKN:O YBKN:O - YBKN:O
YBK^
СН991131 (8-2) YBKN:O YBK0^ YBKNTN YBK0/С
YBK0^
Блондин (7-10) YBK0^ YBK0^ YBK0/С YBK0^
Флорис (7-14) - YBK0/С YBK^'a® YBK0/С
Дуня (7-12) YBKN:O YBKN™ YBK^'a® YBKNTN
YBK0^
Кенза YBKN:O YBK^'a® YBK^'a® YBKWilaa
Dan f^i/an поп—г /111\ YBK0^ VRk'NTN VRk'NTN NTN
Ред Скарлеп (III) Фаворит (III) YBK0^ YBK YBK0/С YBK YBK^'a® YBK YBK0/С
Загадка YBKN:O YBKN:O YBK^'a® YBKN:O
YBK0^
Нида YBKN:O YBKN:O YBK^'a® YBKN:O
УВКО/С
YBK™'3®
Последовательности нуклеотидов типовых штаммов также были включены в выравнивание и филогенетический анализ с использованием двух независимых алгоритмов - максимального правдоподобия и связывания соседей.
100 % поддержкой, входят изоляты подгрупп YBKNTN (Ред Скарлетт III, Ред Скарлетт (5-4), Дуня (7-12) и YBKN:0 (Помдор, Загадка, Нида), а также типовые штаммы, относящиеся к этим подгруппам, маркерные последо-
4. Сравнение ключевых характеристик трёх маркерных генов
Локус 1 Размер ампликона, п.о. | C*, % V, % Pi, %
NTR 710 67 2 23,8 15,0
vPa 600 61 ,0 17,8 9,9
CD 400 46 ,0 13,9 9,2
*C - консервативные позиции; V - вариабельные позиции; Pi - филогенетически информативные позиции.
В результате сравнительного анализа последовательностей исследуемых изолятов YBK по локусам совпадение по всем трем маркерам выявлено при идентификации изо-лята Блондин (7-10), который был однозначно отнесен к штамму УВКО/С (табл. 3). На основании совпадения по двум маркерам идентифицированы изоляты Ред Скарлетт (III) (YBKNTN), Пикассо и Фаворит (III) (УВКО/С), Кенза и Ред Скарлетт (6-10) (YBK™ga).
Наибольшая в опыте эффективность амплификации достигнута при использовании в качестве маркера фрагмента NTR (100 % амплификация исследуемых образцов кДНК). Маркер NTR отмечен как более филогенетически информативный: сравнительный анализ изучаемых последовательностей выявил наличие 23,8 и 15 % вариабельных и филогенетически информативных позиций соответственно (табл. 4). При этом количество филогенетически информативных позиций в двух других проанализированных маркерах (Cp и VPg) не превышало 10 %. Кроме того, не все изучаемые образцы удалось амплифицировать. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа маркерной последовательности NTR, содержит несколько кластеров, поддержанных высоким уровнем бутстрэп-поддержки (рис. 2). В один из таких кластеров, обеспеченный
вательности которых депонированы в базе данных ЫСВ1.
Другой крупный кластер, также характеризующийся 100 % бутстрэп-
поддержкой, включал в себя изоляты, относящиеся к ординарной (YBKO/c: Пикассо, Фаворит (III), CH991131 (8-2), Флорис (7-14), Романо (5-3)) и Wilga (Ред Скарлетт (6-10), Кенза) подгруппам, а также типовые штаммы этих подгрупп. Изоляты Любава (YBK™193) и Блондин (YBKO/c) формировали отдельные кластеры, поддержанные 100 и 95 % бутстрэпа соответственно, группируясь при этом с типовыми штаммами YBK, маркерные последовательности которых получены из базы данных NCBI.
При этом отмечено, что при анализе других маркеров идентификация некоторых изолятов отличалась от идентификации на основе маркера NTR. Так, изолят, выявленный на сорте картофеля Загадка, при анализе локуса PVg охарактеризован как относящийся к группе Wilga. То же можно сказать и про изолят образца сорта Нида. Образец СР991131 по результатам анализа локуса PVg был отнесен к некротической, а по результатам анализа локуса NTR - к ординарной группе. Эти данные могут указывать на рекомбинантную природу изолятов. Детальный анализ маркерных последовательностей нуклеотидов показывает наличие у изолята, выделенного на образце Дуня (7-12), наличие в структуре последовательности NTR мотива, характерного для некротических штаммов, и его отсутствие при анализе других генов.
Наиболее интересным в таксономическом отношении оказался изолят, выделенный в Домодедовском районе Московской области на сорте
57
100
100 SO Àl
100 -ZhukovskySi
-FICJ3SO -Favorit III
— CH99113I82
■ -Fiona 714 r- Romano 5 3 L-Retf scarlen 6 10
66 - Kerns
02 AJS90350 Wilgi нмзето Wilga
mo fLuybava46
Iamhsw miga
_I Blondin 710
Red Scarlett >11 HQW 374 NTN -КХШШНТЫ
■ Red Scarlett 3 4 ЙдП Dunya 712 -FJ204165HTN AY745494NO
KY112T47NO ■ IForm/or si\Zagadka
-AB714134 Ordinary
0.02
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе результатов сравнительного анализа маркерньх участков 5'-NTR.
СО (D S ü
(D
g
(D S S
(D
O) 2 О N> 3
картофеля Жуковский ранний (5-2): при филогенетическом анализе последовательностей локуса NTR он занимал промежуточное положение между некротическим и ординарным кластерами, образуя отдельную ветвь и не группируясь ни с одним из типовых штаммов. Амплифицировать и определить структуру нуклеотидных последовательностей двух других маркеров для этого штамма не удалось. С нашей точки зрения, вероятна принадлежность этого изолята к редкой рекомбинантной подгруппе. Однако для подтверждения либо опровержения этой гипотезы требуется дополнительный анализ, включающий секвенирование полной структуры генома этого образца.
Анализ отсеквенированных последовательностей в целом подтвердил первоначальную серологическую идентификацию исследуемых образцов, демонстрирующую преобладание некротической и рекомбинантной групп штаммов [7].
Таким образом, в ходе проведённых исследований оценены филогенетические характеристики трёх маркерных участков геномаУВК, на основе которых проведена молекулярно-генетическая характеристика таксономического положения исследуемых изолятов.
Из трёх использованных маркеров наиболее легко амплифицируемый и генетически информативный - NTR. Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа маркерной последовательности NTR, содержало несколько кластеров с высоким уровнем бутстрэп-поддержки. В один из таких кластеров входили изо-ляты подгрупп YBKN™ (Ред Скарлетт (III), Ред Скарлетт (5-4), Дуня (7-12)) и YBKN:0 (Помдор, Загадка, Нида). Другой крупный кластер включал в себя изоляты, относящиеся к ординарной (Пикассо, Фаворит (III), CH991131 (8-2), Флорис (7-14), Романо (5-3)) и Wilga (Ред Скарлетт (6-10), Кенза) подгруппам. Изолят, выделенный в Домодедовском районе Московской области на сорте картофеля Жуковский ранний (5-2) при филогенетическом анализе последовательностей локуса NTR занимал промежуточное положение между некротическим и ординарным кластерами, образуя отдельную ветвь.
Литература
1. Диагностика и профилактика вирусных, бактериальных и грибных болезней, кон-СО тролируемых в семеноводстве картофеля О (методические рекомендации) / под общ. ред. N Б. В.Анисимова. Владикавказ: Ир, 2021.62с. о, 2. Атлас болезней, вредителей, сорня-z ков картофеля и мероприятия по борьбе s с ними / В. Н. Зейрук, С. В. Жевора, С. В. Ва-§ сильева и др. М.: Наука, 2020. 332 с. J 3. Karasev A.V., Gray S. M. Continuous and ^ emerging challenges of potato virus Y in potato | // Annual Review of Phytopathology. 2013. Vol. (0 51. P. 571-586.
4. Green K.J., Brown C. J., Karasev A. V. Genetic diversity of potato vi rusY (PVY): sequence analyses reveal ten novel PVY recombinant structures // Archives of Virology. 2018. Vol.163. P. 23-32. doi: 10.1007/s00705-017-3568-x.
5. Идентификация штаммов Y-вируса картофеля, выявленных в Центральном регионе России / В. А. Бирюкова, Ю. А. Варицев, А. И. Усков и др. // Теоретические и прикладные проблемы АПК. 2019. № 4(42). С. 19-24.
6. Изучение штаммового состава Y-вируса картофеля из различных регионов Российской Федерации и Беларуси / А. И. Усков, Ю. А. Варицев, В. А. Бирюкова и др. // Земледелие. 2016. № 8. С. 45-48.
7. Изучение серологических и фитопато-логических характеристик изолятор-вируса картофеля, распространенных на территории различных регионов Российской Федерации / А. И. Усков, Ю. А. Варицев, П. А. Галушка и др. // Достижения науки и техники АПК. 2022. Т 36. № 10. С. 18-22.
8. Разработка новых систем ПЦР-идентификации некарантинных патогенов картофеля (Solanumtuberosum L.), распространенных на территории России / А. А. Стахеев, М. С. Чигарева, А. И. Усков и др.// Сельскохозяйственная биология. 2020. Т. 55. № 1. С. 77-86.
9. A multiplex PCR assay to characterize potato virus Y isolates and identify strain mixtures / J. H. Lorenzen, L. M. Piche, N. C. Gudmestad, et al. // Plant Disease. 2006. Vol. 90. P. 935-940.
10. Chikh Ali M, Karasev A. V Immunocapture-Multiplex RT-PCR for the simultaneous detection and identification of plant viruses and their strains: study case, potato virusY(PVY) // Plant Pathology.
2015. Vol. 1302. P. 177-186. doi: 10.1007/978-1-4939-2620-6_14.
11. Saitou N., Nei M. The Neighbour-Joining Method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. Vol. 4. P 406-425.
12. Stakheev A.A., Khairulina D. R., Zavriev S. K. Four-locus phylogeny of Fusariumavenaceum and related species and their species-specific identification based on partial phosphate permease gene sequences // International Journal of Food Microbiology,
2016.Vol. 225. P. 27-37.
13. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics // New York: Oxford University Press, 2000. 352 p.
14. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, et al. // Molecular Biology and Evolution. 2011. Vol. 28. No. 10. P. 2731-2739.
15. DnaSP 6: DNA Sequence Polymorphism Analysis of Large Data Sets / J. Rozas, A. Ferrer-Mata, J. C. Sanchez-DelBarrio, et al. // Molecular Biology and Evolution. 2017. Vol. 34. No. 12. P. 3299-3302. doi: 10.1093/molbev/msx248.
Study of potato Y-virus isolates widespread in various regions of the Russian Federation using
new molecular markers
А. А. Stakheev1, A. I. Uskov2, Yu. A. Varitsev2, P. A. Galushka2,
L. B. Uskova2, S. V. Zhevora2, S. K. Zavriev1
1Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, ul. Mikluho-Maklaja, 16/10, Moskva, 117997, Russian Federation 2Lorkh Federal Research Center on Potato, ul. Lorkha, 23, pos. Kraskovo, Lyuberetskii r-n, Moskovskaya obl., 140051, Russian Federation
Abstract. The research aimed to study the genetic polymorphism of YBK isolates using new marker sequences. The work was carried out in 2022-2023. For the analysis, we used YBK isolates pre-selected by serotype, selected in 2017 based on domestic and foreign varieties from various regions of the Russian Federation. Three loci were selected as potential markers with high phylogenetic information content: the coat protein gene (Cp), the 5' untranslated region of the NTR, and the VPg protein gene, which covalently binds to the 5' end of RNA and functions as a transcription regulator. The highest amplification efficiency (100 % of the cDNA samples studied) was achieved when using the NTR fragment. It was also the most phylogenetically informative: a comparative analysis of the studied sequences showed the presence of 23.8 and 15 % of variable and phylogenetically informative positions, respectively. The phylogenetic tree, built on the basis of a comparative analysis of the NTR marker sequence, contained several clusters supported by high bootstrap values, which included isolates of the YBKNTN subgroups -Red Scarlett (III), Red Scarlett (5-4), Dunya (7-12); YBKN:0 - Pomdor, Zagadka, Nida; YBK0/C - Picasso, Favorite (III), CH991131 (8-2), Floris (7-14), Romano (5-3); YBKWilga -Red Scarlett (6-10), Kenza, as well as type strains belonging to these subgroups, the marker sequences of which are deposited in the NCBI database. The isolate obtained from the potato variety Zhukovsky early (5-2), during phylogenetic analysis of marker nucleotide sequences of the NTR locus, was between the necrotic and ordinary clusters, forming a separate branch and not grouping with any of the type strains. Analysis of the sequenced sequences generally confirmed the initial serological identification of the studied samples, demonstrating the predominance of necrotic and recombinant groups of strains.
Keywords: potato Y-virus; ordinary strains; necrotic strains; genetic markers; phylogenetic analysis.
Author Details: A. A. Stakheev, Cand. Sc. (Biol.), research fellow; A. I. Uskov, D. Sc. (Agr.), chief research fellow; Yu. A. Varitsev, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow; P. A. Galushka, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow; L. B. Uskova, senior research fellow; S. V. Zhevora, D. Sc. (Agr.); S. K. Za-vriev, D. Sc. (Biol.), corresponding membe rof the RAS.
For citation: Stakheev AA, Uskov AI, Varitsev YuA, et al. [Study of potato Y-virus isolates widespread in various regions of the Russian Federation using new molecular markers]. Zemledelie. 2023;(6): 37-40. Russian. doi: 10.24412/0044-3913-2023-6-37-40. ■
