CC BY
49
УДК 615.322
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОТОКСИЧНОСТИ СУХОГО ЭКСТРАКТА ИЗ КЛУБНЕЙ ЗОПНИКА КЛУБНЕНОСНОГО
© Цыренова Дарима Золтоевна
аспирант лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН
Россия, 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 E-mail: [email protected] © Хобракова Валентина Бимбаевна
старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, доктор биологических наук, доцент кафедры общей патологии человека Медицинского института Бурятского государственного университета Россия, 670047, г. Улан -Удэ, ул. Сахьяновой, 6 E-mail: [email protected]
© Цыренжапова Октябрина Даши-Дондобовна
ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, доктор медицинских наук, профессор Россия, 670047, г. Улан -Удэ, ул. Сахьяновой, 6 E-mail: [email protected]
В статье представлены результаты экспериментального изучения иммунотоксических свойств сухого экстракта из клубней зопника клубненосного. Показано, что курсовое пероральное введение растительного средства не выявило изменений относительной массы и клеточности селезенки и тимуса, не зафиксировало изменений в реакции гиперчувствительности замедленного типа, реакции антителообразования и оценке фагоцитарной активности макрофагов. Результаты проведенного комплексного исследования свидетельствуют о том, что растительное лекарственное средство — сухой экстракт из клубней зопника клубненосного — не обладает иммунотоксическим действием.
Ключевые слова: сухой экстракт из клубней зопника клубненосного, растительное средство, им-мунотоксические свойства, гиперчувствительность замедленного типа, фагоцитоз, антителообра-зование.
STUDY OF IMMUNOTOXICITY OF DRY EXTRACT FROM THE TUBERS OF PHLOMIS TUBEROSA (L.)
Darima Z. Tsyrenova
Research Assiatant of the Laboratory of Experimental Pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS 6 Sakhyanovoi St., Ulan-Ude, Russia 670047 Valentina B. Khobrakova
Senior Researcher of the Laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, DSc in Biology, A/Professor, Department of general human pathology, Medical Institute, Buryat State University 6 Sakhyanovoi St., Ulan-Ude, Russia 670047
Oktyabrina D.-D. Tsyrenzhapova
Leading Researcher of the Laboratory of experimental pharmacology, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, MD, Professor 6 Sakhyanovoi St., Ulan-Ude, Russia 670047
In the article the results of experimental study of immunotoxic properties of Phlomis tuberosa (L.) dry extract are presented. It is shown that the course of oral administration of the phytoremedy has not revealed the changes in relative mass and cellularity of spleen and thymus, it has not recorded changes in the reaction of delayed-type hypersensitivity, antibody production and evaluation of phagocytic activity of macrophages. The results of a comprehensive study testify that a plant remedy — dry extract from Phlomis tuberosa (L.) has no immunotoxic effect.
Keywords: Phlomis tuberosa (L.) dry extract, phytoremedy, immunotoxic properties, delayed-type hyper-sensitivity, phagocytosis, antibody production.
Одним из обязательных этапов доклинических исследований новых лекарственных средств является изучение их влияния на функциональную активность иммунной системы лабораторных животных.
Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в ходе эксперимента над животными доказать или исключить возможность развития иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами. Под иммунотоксическим действием понимают модифицирующее влияние фармакологических средств на иммуногенез, включая иммуносупрессию и гиперстимуляцию иммунитета, способное привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и аллергизации организма [3; 6].
Предложенный подход к оценке иммунотоксического действия фармакологических средств заключается в исследовании ряда интегральных иммунологических функций, позволяющих с учетом результатов гематологических и морфологических исследований лимфоидных органов оценить возможный риск при применении нового фармакологического средства [2; 4].
Объектом исследования явилось перспективное иммуномодулирующее средство — сухой экстракт из клубней зопника клубненосного Phlomis tuberosa (L.) Moench. Данный вид произрастает на территории России и за рубежом: в Центральной и Восточной Европе, широко распространен в умеренном климате Азии [5]. Зопник клубненосный является ценным лекарственным растением, клубни которого широко применяются в традиционной и народной медицине как ранозаживляющее и общеукрепляющее средство [8]. В литературе известно, что экстракт надземной части зопника клубненосного обладает гепатопротективными свойствами [7], эфирный и спиртовый экстракты надземной части проявляют цитотоксическую активность в отношении клеток линии P388 (лейкоз) и асцитного рака Эрлиха [1].
Цель исследования. Изучить иммунотоксические свойства сухого экстракта из клубней зопника клубненосного при внутрижелудочном введении.
Материалы и методы исследования
Иммунотоксическое действие сухого экстракта из клубней зопника клубненосного (ЭЗК) изучено на мышах-самцах линий СВА и F1 (СВА*С57В1/6) массой 18-20 г. Исследование проведено в соответствии с «Методическими указаниями по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ» [6]. Животных распределяли по группам, используя при рандомизации в качестве основного критерия массу тела (отклонение значений массы тела в пределах группы составило не более 10 %). Количество животных в каждой экспериментальной группе — 10. Для оценки иммунотоксического действия ЭЗК вводили в экспериментально-терапевтической дозе 200 мг/кг массы тела перорально в течение 14 дней 1 раз в сутки. Рабочие разведения ЭЗК готовили в день введения. Интактная группа животных получала по аналогичной схеме в соответствующем объеме очищенную воду. Для оценки иммунотоксических свойств исследовали показатели гуморального, клеточного и макрофагального звеньев иммунитета мышей.
Мышей умерщвляли с помощью дислокации шейных позвонков, извлекали тимус и селезенку, взвешивали на торсионных весах и рассчитывали отношение их массы к массе тела мыши в %. Для определения клеточности лимфоидные органы гомогенизировали в среде 199. Суспензию клеток отделяли от элементов стромы фильтрованием через капроновый фильтр и 3 раза отмывали от частиц жировой ткани центрифугированием при 200 град. в течение 5 минут. При подсчете ядросодержащих клеток (ЯСК) каплю клеточной суспензии для освобождения от сопутствующих эритроцитов помещали в 3-процентный раствор уксусной кислоты с генцианвиолетом (0,01 %) и вносили в камеру Го-ряева [6].
Состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) согласно стандартной методике локальной ГЗТ [6]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1-процентной взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена — 50 мкл 50-процентной взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 часа по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок.
Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A. J. Cunningham (1965) [9]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2*108 клеток/мышь. Величину иммунного ответа оценивали по
числу антителообразующих клеток (АОК) на селезенку и на 106 ядросодержащих клеток (ЯСК) на 5-е сутки после иммунизации.
Состояние макрофагального звена иммунного ответа оценивали в реакции фагоцитоза перитоне-альных макрофагов в отношении частиц коллоидной туши. Оптическую плотность лизата клеток пе-ритонеального экссудата, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными макрофагами, определяли при длине волны 620 нм [6].
Результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и ее стандартной ошибки (т). Применялись критерии непараметрической статистики Манна-Уитни (и). Обработка полученных данных производилась с использованием пакета прикладных программ 81ай8йса 6.
Результаты исследования и их обсуждение
Лимфоидные органы (тимус и селезенка) экспериментальных животных взвешивали и определяли относительную массу и количество ЯСК (клеточность). Введение ЭЗК не сопровождалось изменениями величины относительной массы и клеточности тимуса и селезенки у животных опытной группы. Размеры и форма селезенки и тимуса у животных опытной группы не отличались от таковых в интактной группе (табл. 1). Полученные данные позволили сделать вывод, что введение ЭЗК в дозе 200 мг/кг не привело к изменению массы и клеточности тимуса и селезенки.
Таблица 1
Относительная масса и клеточность тимуса и селезенки мышей при введении сухого экстракта зопника клубненосного
Группы Исследуемые органы
Тимус Селезенка
Относительная масса, % Клеточность, кол-во ЯСК в 1 мг органа, х106 Относительная масса, % Клеточность, кол-во ЯСК, в 1 мг органа, х106
Интактная (п = 10) 0,057 ± 0,003 35,6 ± 2,7 0,77 ± 0,023 104 ± 4,8
ЭЗК (п = 10) 0,052 ± 0,004 33,2 ± 3,1 0,74 ± 0,061 96 ± 5,8
Из данных, представленных в таблице 2, следует, что введение животным исследуемого средства не повлияло на фагоцитарную активность макрофагов. Фагоцитарный индекс значимо не изменялся в группе животных, которым вводили ЭЗК по сравнению с данными в интактной группе. Таким образом, введение ЭЗК экспериментальным животным не оказало влияния на изменение функциональной активности макрофагов.
Таблица 2
Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов
Группы Фагоцитарный индекс, %
Интактная (п = 10) 36,95 ± 1,58
ЭЗК (п = 10) 33,56 ± 0,03
Введение животным ЭЗК не оказало влияния на интенсивность клеточного иммунного ответа. Индекс реакции ГЗТ у животных, которым вводили ЭЗК, существенно не отличался от такового интактной группы (табл. 3).
Таблица 3
Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на реакцию гиперчувствительности замедленного типа
Группы Индекс реакции ГЗТ, %
Интактная (п = 10) 38,96 ± 3,12
ЭЗК (п = 10) 34,32 ± 2,87
Данные эксперимента, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что введение ЭЗК не влияет на развитие антителообразования у мышей: абсолютное и относительное число АОК существенно не изменилось по сравнению с данными в интактной группе.
Таблица 4
Влияние сухого экстракта зопника клубненосного на антителообразование
Группы Абсолют. число АОК АОК на 106 спленоцитов
Интактная (n = 10) 40872±3105 348,3 ± 30,8
ЭЗК (n = 10) 37602 ± 2393 322,7 ± 29,5
Заключение
Изучение иммунотоксических свойств сухого экстракта зопника клубненосного показало, что исследуемое средство не вызывает изменений иммунитета, выявляемых по влиянию на лимфоидные органы, в реакциях гиперчувствительности замедленного типа, антителообразования и фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.
Литература
1. Войнова Е., Дафинова К., Димитрова С. Изследоване на спиритен екстракт от растение то Phlomis tuberosa — Lamiaceaea за противотуморно действие у мишки // Онкология. — 1995. — Т. 32, № 3-4. — С. 16.
2. Принципы оценки иммунологической безопасности фармацевтических продуктов / А. С. Иванова, Т. Б. Мастернак, Е. Ю. Малкина, А. И. Мартынов // Биомедицина. — 2011. — Т. 1, № 3 — С. 94-97.
3. Крепкова Л. В. Современные подходы к доклинической оценке безопасности лекарственных средств растительного происхождения // Биомедицина. — 2011. — № 4. — С. 150-152.
4. Лесиовская Е. Е., Саватеева-Любимова Т. Н. Критерии доклинической оценки эффективности и безопасности лекарственных растительных средств // Биомедицина. — 2011. — № 3. — С. 91-94.
5. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 4 Семейства Caprifoliaceae — Lobeliaceae / отв. ред. А. Л. Буданцев. — СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2011. — 630 с.
6. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А. Н. Миронова. — М.: Гриф и К, 2012. — Ч. 1. — 944 с.
7. Румянцева Ж. Н., Гудивок Я. С. Поиски гепатопротекторов среди препаратов растительного происхождения // Растительные ресурсы. — 1993. — Т. 29, вып. 1. — С. 88-97.
8. Хайдав Ц., Меньшикова Т. А. Лекарственные растения в монгольской медицине: историко-медицинские исследования. — Улан-Батор, 1978. — С. 39.
9. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. — 1965. — Vol. 207, № 5001. — P. 1106-1107.
References
1. Voinova E., Dafinova K., Dimitrova S. Izsledovane na spiriten ekstrakt ot rastenie to Phlomis tuberosa — Lamiaceaea za protivotumorno deistvie u mishki [Investigation of antineoplastic action of Phlomis tuberosa — Lamiaceae alcohol extract on mice]. Onkologiya — Oncology. 1995. V. 32. No. 3-4. P. 16. (in Bulg.)
2. Ivanova A. S., Masternak T. B., Malkina E. Yu., Martynov A. I. Printsipy otsenki immunologicheskoi bezopas-nosti farmatsevticheskikh produktov [Principles of immunological safety assessment of pharmaceutical products]. Bio-meditsina — Biomedicine. 2011. V. 1. No. 3. Pp. 94-97.
3. Krepkova L. V. Sovremennye podkhody k doklinicheskoi otsenke bezopasnosti lekarstvennykh sredstv ras-titel'nogo proiskhozhdeniya [Modern approaches to preclinical safety assessment of herbal medicines]. Biomeditsina — Biomedicine. 2011. No. 4. Pp. 150-152.
4. Lesiovskaya E. E., Savateeva-Lyubimova T. N. Kriterii doklinicheskoi otsenki effektivnosti i bezopasnosti le-karstvennykh rastitel'nykh sredstv [Criteria for preclinical assessment of herbal medicines effectiveness and safety]. Biomeditsina — Biomedicine. 2011. No. 3. Pp. 91-94.
5. Rastitel'nye resursy Rossii: Dikorastushchie tsvetkovye rasteniya, ikh komponentnyi sostav i biologi-cheskaya aktivnost'. T. 4 Semeistva Caprifoliaceae — Lobeliaceae [Plant Resources of Russia: wild flowering plants, their composition and biological activity. V. 4. Caprifoliaceae — Lobeliaceae family]. St Petersburg; Moscow: KMK Scientific Press Ltd., 2011. 630 p.
6. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovanii lekarstvennykh sredstv [Guidance for preclinical trials of remedies]. Moscow.: Grif i K Publ., 2012. Part 1. 944 p.
7. Rumyantseva Zh. N., Gudivok Ya. S. Poiski gepatoprotektorov sredi preparatov rastitel'nogo proiskhozh-
89
deniya [Search for hepatoprotectors among herbal preparations]. Rastitel'nye resursy — Plant Resources. 1993. V. 29. Iss. 1. Pp. 88-97.
8. Khaidav Ts., Men'shikova T. A. Lekarstvennye rasteniya v mongol'skoi meditsine: istoriko-meditsinskie issle-dovaniya [Medicinal plants in Mongolia: historical and medical research]. Ulaanbaatar, 1978. P. 39.
9. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells. Nature. 1965. V. 207. No. 5001. Pp. 1106-1107.
