CC BY
45
Изучение химического состава зубов с применением электронно-зондового и масс-спектроскопического микроанализа
Ю. В. Мандра, кандидат медицинских наук, доцент, зав. кафедрой пропедевтики и физиотерапии стоматологических заболеваний Уральской государственной медицинской академии Екатеринбург
Г. И. Ронь, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой терапевтической стоматологии Уральской государственной медицинской академии Екатеринбург
С. Л. Вотяков, доктор геолого-минералогических наук, профессор, член-корреспондент РАН, зав. лабораторией физико-химических методов исследования Института геологии и геохимии Уральского отделения Академии наук РФ Екатеринбург
Д. В. Киселева, кандидат геолого-минералогических наук, научный сотрудник Института геологии и геохимии Уральского отделения Академии наук РФ Екатеринбург
Е. С. Шагалов, кандидат геолого-минералогических наук, научный сотрудник Института геологии и геохимии Уральского отделения Академии наук РФ Екатеринбург
Изучение микроэлементного состава твердых тканей зубов вызывает в настоящее время большой интерес вследствие как уникальных свойств этих тканей, так и желания прогнозировать, моделировать и корректировать изменения под влиянием патологических факторов с целью достижения стабильных результатов профилактики и лечения основных стоматологических заболеваний [1, 3, 4].
Апатиты эмали и дентина зубов человека характеризуются переменным химическим составом, поскольку последний зависит от множества причин (биохимических условий в местности проживания, экологических и профессиональных факторов, возраста пациента, сопутствующих соматических заболеваний, диеты и др.). Особенности строения эмали и дентина в существенной степени определяют их физико-химические и физиологические свойства, такие, например, как прочность, проницаемость, процессы обмена, деминерализации и реминерализации, склерозирования [5]. Морфологическое строение, химический состав и структура эмали являются ведущими факто-
рами обеспечения кариесрезистентности или кариес-восприимчивости зубов [1].
Тем не менее закономерности изменения химического состава и параметров кристаллической решетки гидроксиапатитов эмали и дентина при повышенной стираемости зубов остаются на сегодняшний день практически не изученными [4, 5].
В настоящее время для исследования неорганической фракции эмали и дентина применяется множество методов. Среди тестов in vivo наибольшее распространение получила методика кислотной биопсии поверхностного слоя эмали по В. К. Леонтьеву с последующим определением элементов в биоптате комплек-сонометрическим, спектрофотометрическим методами, витальное окрашивание по JI. А. Аксамит [1]. Совершенствование в последние годы методик и техники исследования позволило расширить возможности экспериментального изучения твердых тканей зубов, несмотря на трудности, вызываемые их морфологической и крис-таллохимической структурой (малый размер объекта, высокая минерализация, сложность строения и т.д.). Такие лабораторные методы исследования минералов in vitro, как рентгеноструктурный анализ, спектральный анализ, электронное микрозондирование, инфракрасная спектроскопия, электронный парамагнитный резонанс, масс-спектральный анализ, являются высокочувствительными и также широко применяются при исследовании минералов. С помощью данных методов стало возможным изучение на количественном уровне микропримесей в кристаллической структуре гидроксиапатитов, в том числе и входящих в состав твердых тканей зубов [1-5]. Однако в настоящее время не существует общепризнанных биокристаллохимических представлений и элементов - биоиндикаторов условий образования и преобразования зубных тканей. Очевидно, что процесс необратимого изменения зубных тканей, их «деградации» при повышенной стираемости развивается в организме пациента достаточно индивидуально: он зависит от его возраста, биогеохимических условий местности проживания, экологических и профессиональных факторов, сопутствующих соматических заболеваний и др.
Материалом для нашего экспериментального исследования послужили образцы 30 зубов (128 образцов) пациентов различных возрастных групп, проживающих в Уральском регионе и страдающих повышенной стира-емостью зубов первой - третьей степени; контрольную группу составили образцы интактных зубов, удаленных по ортопедическим и ортодонтическим показаниям.
Исследование основного элементного состава (кальций, фосфор, сера, железо, магний, натрий, хлор) и вариаций их содержания в продольных сечениях зубов выполнялось на электронно-зондовом микроанализаторе SX 100 (фирма Сатеса). Для проведения ана-
терапевтическая стоматология
лиза специальные шашки с зафиксированными в эпоксидной смоле пришлифованными продольными сечениями зубов напылялись углеродом; анализ выполнен при ускоряющем напряжении 15 кВ и силе тока 40 нА; в качестве стандартных образцов использовались природные минералы фтор- и хлорапатит, доломит, альбит и ангидрит. Микрофотографии различных участков зубных тканей получены в режиме вторичных электронов при напряжении 20 кВ.
Исследование микропримесного элементного состава образцов методом ИСП-МС проводилось на приборе ELAN 9000 (фирма PerkinElmer). Для изучения особенностей пространственного распределения микроэлементов в эмали была разработана методика послойного кислотного растворения зубной эмали и последующего ИСП-МС-анализа [2].
Масс-спектрометрический и электронно-зондовый микроанализ выполнены на базе Института геологии и геохимии УрО РАН (руководитель - доктор геолого-минерологических наук, член-корреспондент РАН С. Л. Вотяков, Екатеринбург).
В образцах интактных резцов и резцов с повышенной стираемостью исследованы четыре основные зоны, хорошо выделяющиеся визуально и представляющие наибольший интерес в связи с происходящими в них изменениями при развитии процесса склерозирования: I - эмаль, II - поверхностный (плащевой) дентин, III -глубинный (околопульпарный) дентин, IV- новообразованный склерозированный дентин, формирующийся в полости зуба при повышенной стираемости.
Особенности элементного состава эмали и дентина по данным электронно-зондового микроанализа (ЭЗМА). Анализ выполнен по профилям от поверхностных слоев эмали к центру через эмалево-дентинную границу (рис. 1); полученные результаты по вариациям содержания кальция, фосфора, магния, натрия, фтора, хлора и серы приведены далее на рис. 3.
Содержание, % 50
40 30 20 10
Са Р
Са/Р
Mg
F
S
Cl
Na
1 234 5678910 1 23456789
Рис. 1. элементный состав по данным эзМА различных зон твердых тканей интактного зуба (а, в) и зуба с проявлениями сти-раемости первой степени (б, г). Пояснения в тексте
Анализ полученных данных позволяет выявить некоторые закономерности по вариациям содержания основных элементов. Кальций, фосфор и натрий распределены по эмали и дентину достаточно равномерно (рис. 2), с уменьшением их концентрации при пере-
Толщина растворенного слоя эмали, мкм
1000 800 600 400 200
0 5 10 15 20
Время растворения, мин
Рис. 2. Время расворения и толщина растворенного в зМ хлорной кислоте слоя эмали интактного зуба (7) и зубов с проявлениями повышенной стираемости первой (2) и второй (3) степени
ходе через дентиноэмалевую границу (кальций - с 39 до 34-35 %, фосфор - с 18,7 до 16-17 %); различия между содержанием натрия, кальция, фосфора и молярными отношениями Са/Р в интактном зубе и зубе с повышенной стираемостью незначимы. Концентрация магния в эмали равномерно возрастает в направлении дентиноэмалевой границы и увеличивается в дентине почти в 3 раза; различия в содержании магния в интак-тном зубе и зубе с повышенной стираемостью также практически незначимы. Содержание хлора уменьшается в направлении от внешнего края эмали через дентиноэмалевую границу к плащевому дентину; в около-пульпарном дентине его среднее содержание увеличивается до 0,14 %, а для точек, прилежащих к пульпарному каналу, характерно самое низкое содержание хлора -0,05 %; в эмали зуба с повышенной стираемостью отмечается несколько более высокое содержание хлора. Внешние слои эмали заметно обеднены серой по сравнению с дентином, где величина ее концентрации возрастает примерно в 6 раз. Содержание фтора резко увеличивается в околопульпарном дентине; эмаль зуба с повышенной стираемостью сильно обеднена фтором, так же, как и дентин. Для склерозированного дентина характерно пониженное содержание кальция и фосфора (32,85 и 15,71 % соответственно), магния (1,15 %) и хлора (0,04 %).
Особенности динамики химического растворения и микроэлементного состава эмали и дентина по данным ИСП-МС. Для исследования физико-химических свойств эмали разработан ряд стоматологических тестов как in vivo, так и in vitro, основанных на воздействии на нее химических реагентов (в частности,
14
Проблемы стоматологии. 2008. № б
кислот) [1,5]. В настоящей работе для разложения зубных тканей in vitro и последующего микроэлементного ИСП-МС-анализа растворов предложено использовать трехмолярную (ЗМ) хлорную кислоту, которая хорошо окисляет органические компоненты эмали и дентина и при этом дает низкий фон контрольного опыта [2]. Данные по временной динамике растворения эмали зубов представлены в таблице и на рис. 2. Видно,
Экспериментальные данные по химическому растворению эмали
№ пробы | Характеристика пробы № слоя Навеска, мг Время растворения, мин. Толщина слоя эмали, мкм Скорость растворения, мкм/мин
1 Интактный резец 1 31,8 3 133 44
2 59,3 5 282 56
3 54,7 5 360 73
2 Резец с проявлениями стираемости первой степени 1 38,4 3 182 60
2 54,5 5 360 72
3 48,0 5 400 80
3 Резец с проявлениями стираемости второй степени 1 62,7 3 143 47
2 103,3 5 285 57
3 79,6 5 530 106
4 56,2 5 936 186
что в серии зубов, расположенных в порядке убывания их сохранности (пробы 1-3), наблюдается монотонное увеличение скорости растворения глубинных слоев эмали от 73 до 80 и 186 мкм/мин соответственно. Это свидетельствует о понижении резистентности к химическому воздействию эмали зубов с повышенной стира-емостью, что может быть следствием нарушения кристаллической структуры, увеличения размеров кристаллов гидроксиапатита, а также ослабления связи «минерал - органическая матрица».
На рис. 3 представлены ИСП-МС данные по содержанию и распределению ряда микроэлементов (марганец, свинец, стронций, кадмий, барий, селен и др.) в слоях эмали и дентина интактных зубов и зубов с проявлениями повышенной стираемости. В последних содержание большинства элементов понижено по сравнению с таковым в эмали интактных зубов. Достаточно специфично и распределение микроэлементов по слоям эмали. В частности, стронций и барий распределены в эмали интактных и зубов с повышенной стираемостью достаточно равномерно, а применительно к меди, селену, цинку, марганцу, свинцу и кадмию обнаружено относительное обогащение одних зон (слоев) эмали по сравнению с другими. Следует отметить, что внешние слои как интактных зубов, так и зубов с проявлениями стираемости, характеризуются повышенным содержанием цинка (88-187 ррт) и стронция (37-80 ррт), содержание меди, селена, цинка, марганца, свинца, бария варьирует в пределах 0,1-1 ррт как в здоровой эмали, так и в эмали с признаками стираемости.
Tl Hg Со Se Pb Си V Ва Zn Bi Rb Cd Mn Cr As Al Ni Sr
Номер слоя зуба
3 4 5 6 7 8 Номер слоя зуба
Рис. 3. Содержание примесных микроэлементов (а) и их распределение (б, в) по слоям эмали (Э) и дентина (Д) интактного зуба (б) и зуба с повышенной стираемостью (в). »1 - интактный зуб; серая область соответствует содержанию микроэлементов в зубах с повышенной стираемостью. Слои эмали пронумерованы в направлении от внешней части через дентиноэмалевую границу к плащевому и околопульпарному дентину
При анализе данных по содержанию микроэлементов в твердых тканях зуба человека мы учитывали, во-первых, способ (путь) поступления микроэлементов в биоминерал (внешний - через слюну из окружающей среды с воздухом, пищей и водой или внутренний - из
жидкостей организма через пульпарный канал и ден-тиновые трубки); во-вторых, способ распределения в биоминеральной компоненте - привязанность микроэлементов к минеральной или органической компоненте (с замещением кальция на марганец, стронций, кадмий, барий, свинец в структуре гидроксиапатита или образованием металлоорганических соединений для ионов цинка, железа, меди, селена и др.); в-третьих, функциональную роль микроэлемента, его участие в процессах метаболизма («эссенциальные» элементы медь, марганец, цинк, селен и др.) или его токсичность (стронций, кадмий, барий, свинец и др.).
Таким образом, по данным масс-спектроскопии можно констатировать, что в зубах с проявлениями повышенной стираемости изменения происходят преимущественно в анионном составе эмали и дентина в содержании фторид- и хлорид-ионов, причем в пораженных зубах отмечается значительное уменьшение содержания фтора, кальция, фосфора и обогащение хлором. Выявленные изменения динамики растворения свидетельствуют о понижении резистентности эмали зубов с повышенной стираемостью к химическому воздействию, что может быть следствием нарушения ее кристаллической структуры, увеличения
тшпшичшая стоматология
размеров кристаллов гидроксиапатита, а также ослабления связи «минерал - органическая матрица».
Список использованной литературы
1. Боровский Е. В., Леонтьев В. К. Биология полости рта. М.: Мед. книга; Н. Новгород: Издво НГМА, 2001.
2. Вотяков С. Л., Киселева Д. В., Розанов А. Ю. и др. Мультиэлементный масс-спектрометрический микроанализ в исследованиях биоминеральных образований Н Литосфера. 2007. № 1. С. 123-137.
3. Недосеко В. Б., Горбунова И. Л., Дроздов В. А. Масс-спектральный анализ воды интактной эмали у лиц с различным уровнем резистентности к кариесу II Стоматология. 2004. № 4. С. 13-16.
4. Цимбалистов А. В., Пихур О. Л., Франк-Каменецкая О. В. и др. Результаты исследования морфологического строения, химического состава и параметров кристаллической решетки апатитов твердых тканей зубов II Институт стоматологии. 2004. № 2. С. 60-63.
5. Elliott J. C. Calcium phosphate biominerals II Rev. in Mineralogy and Geochemistry. Phosphates I Editors M. J. Kohn, J. Rakovan, J. M. Hughes. 2002. Vol. 48. P. 427-453.
Работа выполнена в рамках программы Президиума Российской академии наук «Фундаментальные науки - медицине», а также в рамках программы № 18 фундаментальных исследований Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы» и при финансовой поддержке РФФИ (грант 07-05-00097), гранта Президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» НШ4210.2006.5 и гранта Минобрнауки РНП.2.1.1.1840.
