CC BY
20
УДК 615.73:616.36-92.4/9
ИЗУЧЕНИЕ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО 3-ОКСИПИРИДИНА
В. Е. Новиков, Е. И. Климкина
Смоленская государственная медицинская академия
В условиях экспериментального токсического гепатита изучено гепатопротекторное действие оригинального химического соединения - 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат. Показано, что соединение эффективно снижает активность печеночных ферментов (аспарагиновой и аланиновой аминотрансфераз, лактатдегидрогеназы), содержание общего билирубина и активность ПОЛ, инициированных интоксикацией СС14. Протекторное действие вещества на функцию печени подтверждено морфологически.
Поражения печени являются широко распространенной причиной заболеваемости и смертности населения. По мере индустриализации возрастает количество токсических поражений печени, обусловленных загрязнением окружающей среды, профессиональными и бытовыми вредностями [10]. С целью лечения и профилактики заболеваний печени используются препараты разных фармакологических групп. Особое место среди них принадлежит гепатопротекто-рам - лекарственным средствам, улучшающим метаболические процессы в печени и способствующим восстановлению ее функций при различных повреждениях [2]. Свободнорадикальная концепция поражения печени открыла новые возможности для применения в практической гепа-тологии лекарственных средств с антиоксидант-ной направленностью действия [7]. Из истинных антиоксидантов в терапии заболеваний печени препаратами-лидерами являются лекарственные средства биофлавоноидной природы. К числу наиболее изученных гепатопротекторов относятся и эссенциальные фосфолипиды [3]. Однако эффективность этих препаратов при поражениях печени различной этиологии недостаточно высока. Рациональная терапия поражений печени до сих пор остается трудной задачей.
В последние годы синтезировано достаточно много новых соединений с антиоксидантным и антигипоксантным действием. В экспериментальных и клинических исследованиях были выявлены гепатозащитные свойства производного 3-оксипиридина - мексидола [12]. Тем не менее проблема применения синтетических антиокси-дантов в качестве гепатопротекторов все еще остается практически неизученной.
Целью настоящего исследования явилось изучение гепатопротекторных свойств нового производного 3-оксипиридина - 2,6-диметил-3-ок-сипиридина адамантанкарбоксилат. Соединение синтезировано в НИИ биохимической физики РАН (г. Москва) доктором химических наук, профессором Л. Д. Смирновым и любезно нам предоставлено в виде субстанции в соответствии с договором о совместной научной работе по изучению синтетических антиоксидантов и антигипоксантов.
Материалы и методы. Опыты проведены на белых лабораторных крысах обоего пола массой 180-230 г. Токсическое поражение печени вызывали четыреххлористым углеродом (СС14). Опытным крысам подкожно вводили СС14 в виде 50% раствора в подсолнечном масле в дозе 0,4 мл на каждые 100 г массы животного 1 раз в день на протяжении 4-х первых дней опыта. Эта схема и доза считаются достаточными для создания полноценной биохимической картины острого токсического поражения паренхимы печени крыс [3, 12]. Наблюдение за животными вели в течение 7 дней, по истечении которых крысы подвергались одномоментной декапи-тации. Развитие экспериментального токсического гепатита подтверждали биохимическими и морфологическими методами исследования. Изучаемое оригинальное химическое соединение 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат (ОПАК) и мексидол вводили в одинаковой дозе 10 мг/кг/сут внутрибрюшинно. Препарат сравнения альфа-токоферола ацетат - в дозе 50 мг/кг/сут внутримышечно. Дозы веществ подобраны в соответствии с данными литературы, где показана их фармакологическая активность [4, 5]. Все вещества вводили 1 раз в сутки первые 4 дня параллельно с тетрахлоридом углерода за один час до его введения, затем еще три
дня. Биохимическому исследованию подвергалась сыворотка крови животных. В ней определяли активность ферментов: аспарагиновой (АсАТ) и ала-ниновой аминотрансфераз (АлАТ), щелочной фос-фатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а также общий белок и концентрацию общего билирубина. Эти исследования выполнены на биохимическом анализаторе «Ultra» фирмы «Kone» (Финляндия) с использованием реактивов фирм «Vital» и «Olvex» (Россия) и фирмы «Human» (Германия).
Оценку активности свободнорадикального окисления (СРО) проводили методом хемилюми-несценции в сыворотке крови и супернатанте го-могената ткани печени на отечественном люми-нометре фирмы «Диалог» с помощью программы <CL3603>. Сыворотку крови получали путем центрифугирования цельной крови в течение 10 минут при 3000 об/ мин. Супернатант ткани печени готовили путем гомогенизации в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 3-4 минут в среде гомогенизации в соотношении 5 мл среды на 500 мг ткани. В качестве среды гомогенизации использовался фосфатный буфер. Для инициации ПОЛ в исследуемый материал вводили 0,1 мл 3% раствора перекиси водорода. В качестве оценочного показателя использовалась величина светосуммы, отражающая интенсивность образования свободных радикалов и участие в процессе СРО антиоксидантных систем. Результаты экспериментальных исследований
подвергали статистической обработке. Гипотезы о средних значениях проверяли с помощью ^критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Уже после первого введения тетрахлорида углерода отмечалось угнетение общего состояния животных: снижалась двигательная активность, они утрачивали интерес к пище, несмотря на предшествующее 18-часовое голодание. К концу срока затравки ядом шерсть животных тускнела, слипалась, кожа конечностей, хвоста, ушей приобретала синюшный оттенок, отмечалось снижение массы тела. К 7 дню после начала введения яда некоторые крысы погибали. В сыворотке крови опытных животных в этот период значительно повышалась активность аланиновой (АлАТ) и аспарагиновой (АсАТ) аминотрансфераз, а также фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Наряду с возрастанием активности ферментов-маркеров цитолиза в сыворотке крови опытных животных заметно увеличивалась концентрация общего билирубина, свидетельствующая о нарушении резорбции этого соединения из крови клетками печени, дальнейшего связывания его с глюкуро-новой кислотой и выведения (см. табл. 1).
Учитывая направленность изменений биохимических показателей в сыворотке крови, свидетельствующих об активации цитолитических процес-
Таблица 1. Влияние производных 3-оксипиридина и токоферола на биохимические показатели сыворотки крови при интоксикации крыс СС14 (М + т)
Группы АлТ (ед/л) АсТ (ед/л) ЛДГ ЩФ Общий Общий
животных (ед/л) (ед/л) белок (ед/л) билирубин (мкмоль/л)
Интактная
(контроль) 67,11 + 195,44+ 1601,33+ 555,89+ 64,0+ 7,83+
N=10 7,95 13,63 206,54 72,82 2,43 0,12
Гепатит (без 599,91 + 623,36+ 2781,18+ 583,36+ 70,4+ 12,67+
лечения) 153,14 40,25 194,47 37,93 2,43 2,1
N=12 p<0,01 p<0,01 P<0,01 p>0,05 p>0,05 P<0,05
135,80+ 289,70+ 1985,40+ 583,20+ 67,1+ 10,30+
Гепатит + 17,85 26,49 313,70 62,60 1,86 0,76
ОПАКп=10 p<0,01 p<0,01 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
p,<0,01 p1<0,01 p1<0,05 p1>0,05 p1>0,05 p1>0,05
Гепатит + 164,00+ 352,10+ 2235,10+ 537,50+ 71,6+ 8,29+
17,15 25,35 235,30 127,37 1,60 0,52
Мексидол N=10 p<0,01 p<0,01 p>0,05 p>0,05 p<0,05 p>0,05
p1<0,05 p1<0,01 p1>0,05 p1>0,05 p1>0,05 p1<0,05
Гепатит + 203,27+ 255,63+ 1514,80+ 503,64+ 63,0+ 8^0+
14,74 30,83 175,76 61,90 2,33 0,22
Токоферол N=10 p<0,01 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05 p>0,05
p1<0,05 p1<0,01 p1<0,01 p1>0,05 p1>0,05 p1<0,05
Примечание. Во всех таблицах достоверность различий: р - по отношению к показателям интактных животных; р1 - по отношению к группе животных с гепатитом без лечения.
сов в печени, мы провели морфо-гистологическое изучение печени. Морфологическая картина ткани печени крыс на 7 сутки после начала интоксикации четыреххлористым углеродом свидетельствовала о развитии токсического гепатоза, проявлявшегося жировой дистрофией печени, признаками снижения белковосинтетической функции, а также начальными признаками воспаления в виде незначительной лейкоцитарной инфильтрации. Наши результаты по изменению активности ферментов и морфо-гистологических показателей печени в условиях интоксикации организма животных тет-рахлоридом углерода полностью согласуются с данными других авторов, установленными в аналогичных исследованиях [11, 12, 13, 14].
Патологический процесс в печени опытных животных сопровождался значительным усилением процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Интоксикация тетрахлоридом углерода инициировала достоверное увеличение продуктов ПОЛ как в гомогенате печени, так и в сыворотке крови (см. табл. 2 и 3). Наибольшие нарушения изучаемых показателей происходили в ткани печени, что можно объяснить непосредственным действием гепатотропного яда на орган-мишень [6, 9]. Как видно из таблицы 1, введение опытным животным производных 3-оксипиридина и токоферола с целью коррекции токсического гепатита показало положительную динамику изменений и близкие значения биохимических показателей в сыворотке крови. Так, под влиянием 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилата наблюдалось снижение активности АлАТ на 77,4%, АсАТ - на 53,5%, ЛДГ - на 28,6% и снижение содержа-
ния общего билирубина на 18,7%. Применение мексидола приводило к снижению активности АлАТ на 72,7%, АсАТ - на 43,5%, ЛДГ - на 19,6%, содержание общего билирубина уменьшалось на 34,6%. При этом показатели активности щелочной фосфатазы и содержания общего белка в сыворотке крови в обеих группах достоверно не изменялись по сравнению с гепатитом без лечения.
При применении препарата сравнения токоферола ацетата для коррекции токсического гепатита было отмечено снижение активности АлАТ на 66,1%, АсАТ - на 59%, ЛДГ - на 44,5% и снижение концентрации общего билирубина в сыворотке крови на 33,1% по отношению к животным без лечения. Активность щелочной фосфатазы и содержание общего белка достоверно не изменялись. Сопоставление результатов действия препарата сравнения с производными 3-оксипиридина позволяет отметить, что токоферол по эффективности влияния на биохимические показатели примерно соответствует мексидолу и 2,6-диметил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилату.
Таким образом, приведенные результаты экспериментов свидетельствуют о том, что токсическое поражение печени тетрахлоридом углерода сопровождается выраженным синдромом цитолиза гепатоцитотов, что проявляется гиперферменте-мией АлАТ, АсАТ и ЛДГ, а также повышением содержания общего билирубина в сыворотке крови. Применение синтетических антиоксидантов с целью коррекции токсического гепатита приводит к снижению выраженности изменений биохимических показателей. Эффективность мексидола и нового
Таблица 2. Влияние производных 3-оксипиридина и токоферола на активность ПОЛ в гомогенате печени при интоксикации крыс CCl4 (M + m).
Группы животных Показатель светосуммы % к интакту
Интактная (контроль) п=12 12847,16±1028,67 100%
Гепатит без лечения п=11 28558,60±1620,06 P<0,01 222,3%
Гепатит + ОПАК п=10 13908,89±2850,19 p>0,05 p1<0,01 108,3%
Гепатит + мексидол п=10 16980,50±2082,49 p>0,05 p1<0,01 132,2%
Гепатит + токоферол п=10 14690,71±1871,86 p>0,05 p1<0,01 114,3%
производного 3-оксипиридина ОПАК сравнима с эффективностью токоферола. Применение исследуемых лекарственных веществ на фоне экспериментального токсического гепатита приводило также к достоверному снижению активности процессов ПОЛ в гомогенате печени и сыворотке крови по сравнению с группой животных без лечения.
Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что все исследуемые вещества обладают антиоксидантной активностью. Так, активность ПОЛ в гомогенате печени при интоксикации животных СС14 снижали мексидол - на 90,1% (р1<0,01), токоферол - на 108% (р1<0,01) и ОПАК -на 114% (р1<0,01). Применение ОПАК приводило к снижению показателя величины светосуммы в гомогенате печени практически до уровня показателей интактных животных. Проанализировав приведенные выше результаты по СРО, можно отметить, что наиболее эффективно корригирует процессы ПОЛ в печени крыс на фоне интоксикации животных тетрахлоридом углерода соединение 2,6-ди-метил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат, эффективность которого по показателю величины светосуммы оказалась выше, чем у токоферола ацетата. Сопоставимые данные были получены и при исследовании активности ПОЛ в сыворотке крови животных в условиях фармакологической коррекции токсического гепатита (см. табл. 3).
Так, например, под влиянием мексидола активность ПОЛ в сыворотке крови животных с интоксикацией СС14 достоверно снижалась на 56,5% по сравнению с животными без лечения (р1<0,01), оставаясь при этом выше показателей интактных животных на 38,7% (р<0,01). Применение ОПАК
приводило к достоверному снижению показателей величины светосуммы на 72% (р1<0,01) относительно животных с гепатитом без лечения. Активность ПОЛ у животных этой экспериментальной группы достоверно превышала аналогичный показатель интактной группы животных на 23% (р<0,01). Наиболее значимо снижал активность ПОЛ в сыворотке крови животных с токсическим гепатитом препарат сравнения токоферола ацетат. На фоне введения токоферола средний показатель величины светосуммы в сыворотке крови данной экспериментальной группы превышал аналогичный показатель интактных животных всего лишь на 9,5% (р>0,05).
Сопоставляя результаты исследования активности процессов ПОЛ в условиях интоксикации животных тетрахлоридом углерода, можно обнаружить некоторые различия между показателями величины светосуммы в гомогенате печени и сыворотке крови. Это объясняется тем, что повышение активности процессов пероксидации ли-пидов в сыворотке крови может быть следствием не только выхода продуктов ПОЛ из поврежденного органа в кровь, но и результатом выраженной стрессорной реакции животных на проведение манипуляций. На наш взгляд, исследование активности процессов липидной пероксидации в гомогенате печени наиболее объективно отражает изменения ПОЛ у животных с интоксикацией С^4 на фоне применения фармакологических средств, так как количество гидроперекисей в клетках этого органа зависит только от его функционального состояния, в то время как уровень гидроперекисей в плазме крови отражает суммар-
Таблица 3. Влияние производных 3-оксипиридина и токоферола на активность ПОЛ в сыворотке крови при интоксикации крыс СС14 (М_+ т)
Группы животных Показатель светосуммы % к интакту
Интактная (контроль) п=12 79086,11+2113,85 100%
Гепатит без лечения п=11 138573,30+6492,37 р<0,01 195,2%
Гепатит + ОПАК п=10 95735,29+7865,86 р<0,05 р1<0,01 122,9%
Гепатит + мексидол п=10 109670,00+3725,32 р<0,01 р1<0,01 138,7%
Гепатит + токоферол п=10 86603,64+5384,43 р>0,05 р1<0,01 109,5%
ную реакцию организма, в том числе и на стресс.
Результаты наших экспериментов находят подтверждение в литературе. Так, о способности производных 3-оксипиридина снижать перок-сидацию липидов сообщают и другие авторы [1, 8]. Положительный эффект от введения производных 3-оксипиридина, по-видимому, связан с тем, что они являются структурными аналогами витамина В6, выполняющего в организме роль физиологического антиоксиданта. Токоферола ацетат обладает многосторонним гепатотропным действием. Он стабилизирует мембраны гепато-цитов, ибо в виде токоферола входит в их состав в качестве обязательного структурного элемента, где находится в связи с липидными и белковыми компонентами. Кроме того, как антирадикальное вещество, токоферол обладает антиоксидантны-ми свойствами, являясь важным элементом анти-оксидантной системы клеток [7].
Таким образом, в условиях токсического гепатита, индуцированного тетрахлоридом углерода, у крыс, выраженное антиоксидантное действие по показателю величины светосуммы в гомогенате печени и сыворотке крови оказывает производное 3-оксипиридина 2,6-диметил-3-оксипиридина ада-
мантанкарбоксилат. Это вещество по способности снижать активность процессов пероксидации ли-пидов в сыворотке крови и особенно в гомогенате печени соответствует эффективности классического антиоксидантного препарата токоферола ацетата. Выявленная способность соединения угнетать активность процессов СРО, может лежать в основе его гепатопротекторного действия в условиях интоксикации животных тетрахлоридом углерода. При изучении гистологических микропрепаратов печени было установлено, что соединение 2,6-ди-метил-3-оксипиридина адамантанкарбоксилат значительно уменьшает выраженность жировой дистрофии печени в условиях токсического гепатоза.
Заключение. Новое оригинальное химическое соединение из группы производных 3-окси-пиридина 2,6-диметил-3-оксипиридина адаман-танкарбоксилат снижает активность печеночных ферментов-маркеров цитолиза и концентрацию общего билирубина в сыворотке крови животных, активность процессов ПОЛ, инициированных интоксикацией СС14, что свидетельствует о его гепатопротекторном действии. Протекторное действие соединения на печень подтверждено морфологически.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дюмаев К. М., Воронина Т. А., Смирнов Л. Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Изд. Института биомедицинской химии РАМН, 1995. - 272 с.
2. Минушкин О. Н. Некоторые гепатопротекторы в лечении заболеваний печени // Лечащий врач. - 2002.
- №6. - С.55-58.
3. Новиков В.Е., Климкина Е.И. Гепатопротекторы. - Смоленск: Из-во СГМА, 2006. - 140 с.
4. Новиков В. Е., Катунина Н. П. Изучение антигипоксических свойств новых производных 3-оксипиридина // Вестник Смоленской медицинской академии. - 2002.- №3.- С. 9-10.
5. Новиков В. Е., Лосенкова С.О. Фармакология производных 3-оксипиридина // Обзоры по клин. фармакологии и лекарственной терапии.- 2004. - Т.3, №1. - С. 2-14.
6. Саратиков А. С., Новожеева Т. П., Венгеровский А. И. Эффективность ферментиндуцирующих средств при экспериментальном поражении печени тетрахлорметаном // Экспериментальная и клиническая фармакология.
- 2003. - Т.66, № 4. -С. 47-49.
7. Скакун Н. П., Шманько В. В., Охримович Л. М. Клиническая фармакология гепатопротекторов. - Тернополь: Збруч.
- 1995. - 272 с.
8. Солонина Н. В. Фармакологическая коррекция препаратами с антиоксидантным действием некоторых токсических эффектов свинца в эксперименте: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Саранск, 2003. - 18 с.
9. Теселкин Ю. О., Бабенкова И. В., Колхир В. К. и др. Антиоксидантное действие дигидрокверцетина при тетрахлорметановом гепатите у крыс // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -1999.- № 3. - С. 44-47.
10. Ушкалова Е. А. Место эссенциальных фосфолипидов в современной медицине // Фарматека, 2003. -№10. - С.40-46.
11. Фомина Т. И., Ветошкина Т. В., Дубская Т. Ю. Фармакологическая коррекция гепатотоксического действия платидиама. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1999. - Т.62, № 1. - С. 62-64.
12. Цыганкова Г. М. Влияние мексидола на развитие токсического гепатита: Автореф. дис. канд. мед. наук.
- Смоленск, 2003. - 20 с.
13. Angulo P. Treatment of nonalcoholic fatty liver disease // Ann. Hepatol. - 2002. - № 1. - P. 12-19.
14. Luper S. A review of plants used in the treatment of liver diseases: part 1. // Altern. Med. Rev. - 1998. - Vol. 3. - P. 410-421.
