CC BY
11
АГРОНОМИЯ
06.01.07 - ЗАЩИТА РАСТЕНИИ (СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ)
УДК 579.6 DOI 10.18286/1816-4501-2022-1-99-105
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМА И ПРОТЕОМА БАКТЕРИОФАГА ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SYRINGAE
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Сульдина Екатерина Владимировна, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Богданов Ильгизар Исмаилович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Абдурахманов Ильнур Мынгалиевич, аспирант кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: Pseudomonas syringae, бактериофаг, капсидные белки, молекулярная, масса, аминокислоты, протеом, ДНК
В статье представлены результаты исследований по изучению геномных и протеомных характеристик производственно-перспективного бактериофага Ps.s-27 УлГАУ, специфичного для фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae. Результаты секвенирования позволили установить размер ДНК изучаемого бактериофага, составившего 24690 п.н. Эти данные соответствуют результатам, полученным при постановке электрофореза (относительная погрешность 5= 5= 0.0383). Анализ соответствия сиквенсовых данных, аннотированным в GeneMark Prokaryotic V 3.26. протеомам, выявил 28 открытых рамок считывания. Проведен анализ локализации исследуемых протеинов и определено, что для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ капсидные белки составляют 61,2%. Были систематизированы данные, характеризующие 28 белков изучаемого бактериофага, обобщающие информацию по количеству аминокислот, молекулярной массе, изоэлектриче-ской точке и брутто-формуле. При проведении для Ps.s-27 УлГАУ выявлено три димера (gene_3, gene_17 и gene_23) с молекулярной массой 45,0, 49,1 и 40,9 kDa, что может свидетельствовать об их потенциальной роли в структуре капсида изучаемого фага. Полученные данные позволяют продолжить составление паспорта биологических свойств производственно-перспективного бактериофага Ps.s-27 УлГАУ, который входит в состав биопрепарата, направленного действия.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Ульяновской области РФ в рамках научного
проекта № 19-44-730014.
Введение
Бактерии Pseudomonas syringae считаются одной из десяти важнейших фитобактерий, имеющих и экономическое значение [1]. Бактерии Pseudomonas syringae pv. syringae вызывают заболевания груш, айвы, сирени, сливы,
фасоли, капусты белокочанной, подсолнечника, томатов, земляники, сахарной свеклы, киви [2 - 4]. Для вышеназванных болезней основной стратегией защиты, используемой в Европе, является комплексный подход к борьбе с вредителями (IPM), основанный на передовых методах
ведения сельского хозяйства, устойчивых культурах и обработках медью. Однако эффективность IPM может быть снижена из-за появления новых бактериальных штаммов [5], а сортов, устойчивых к наиболее патогенным штаммам Pseudomonas syringae, не существует [6]. Более того, обработка медью носит только профилактический характер и, как было доказано, вредна для киви и окружающей среды, а их интенсивное использование отвечает за отбор штаммов, устойчивых к меди [7].
Поэтому биоконтроль на основе бактериофагов следует изучать как устойчивую альтернативу. Разработка и применение биологического препарата на основе специфичных бактериофагов открывает перспективу контроля распространения фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae [8]. Наличие подобного препарата в арсенале аграриев позволит в перспективе разработать экологически безопасную стратегию защиты растений, основанную на использовании стимуляторов роста растений биологического происхождения и специфических бактериофагов для деконтаминации семенного материала, профилактики и блокирования инфекций бактериального происхождения [9]. Для рекомендации использования фаговых биопрепаратов в растениеводстве необходимо провести исследования генома и протеома каждого кандидатного бактериофага [10].
Материалы и методы исследований
Исследуемый кандидатный бактериофаг Ps.s-27 УлГАУ вирулентный (изолирован из пробы почвы) характеризовался следующими показателями: литическая активность - 1,0±0,1х109 БОЕ/
Рис. 1 - Круговая диаграмма ORF для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ
мл (установлено по методу Грацио), 10-8 (определено по методу Аппельмана); специфичен для Pseudomonas syringae, не вызывает лизиса бактериальных культур Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Рectobacterium carotovorum, Хanthomonas campestris, Yersinia enterocolitica, Klebsiella pneumoniae, Echerichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis [11].
Для получения полноразмерных нукле-отидных последовательностей генома Ps.s-7 УлГАУ применяли метод полупроводникового секвенирования на платформе IonTorrent (Thermo Fisher Scientific, США), используя набор реагентов Ion PI Sequencing 200 Kit v3 на чипе Ion PI ChipKit v2 секвенатора IonProton (ThermoFisherScientific, США) с учетом рекомендаций производителя. Оценку распределения длин фрагментов библиотек и их концентрацию проводили, используя Bioanalyzer 2100 и набор реагентов Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США) по протоколам производителей. Клональную амплификацию библиотек, предварительно эквимолярно пулированных, осуществляли с применением набора Ion PI Template OT2 200 Kit v3 (Thermo Fisher Scientific, США) по рекомендациям производителя. Сборка фагового генома denovo осуществлялась с применением ридов (качество прочтения ну-
ASTA definition line: Vedicted g.ení£
P^eudwwnas pJiage Pi-27 , cccpjete genoee
Gene Strand LeftEnd RightEnd
*
1 + 9 2вЭ 1«
1 + 215 Ml Л47
3 + Ю 2КЭ 1296
4 + Í2J7 лез 957
Î + ÎJW J549 2íl
6 + S57B Î93S 366
7 + 3932 4429 азв
S - 4826 5M2 267
* И92 S3«: 291
1Й + an 5615 3Ï7
11 + 5512 6115 504
12 + 6U2 6237 12«
13 + але 6SÎ2 295
14 + 6!3¡ ьш 4Î6
IS + 6933 7Î46 264
16 + 7243 7SS1 309
17 + 7792 9177 1336
IS * »7 mi ЭК
Ii + 9B19 104Î7 £в9
» + 16534 îeîifl 331
21 + 10927 11S2Î 603
22 115« UWl 4J3
23 + 12JM 13524 1125
24 + 13917 14117 201
2S - 14633 14797 165
2t + 1И73 15297 225
n + 1Й4Л 16244 2«1
2 S - 23335 23Я9 27«
Рис. 2 - Анализ соответствия сиквенсовых данных бактериофага Ps.s-27 УлГАУ аннотированным фаговым (вирусным) и бактериальным протеомам
клеотидов - не ниже Q20, длина - не менее 50 оснований).
Для сборки генома использовали программное обеспечение Newbler (Roche/454 GS-FLX). Анализ соответствия сиквенсовых данных аннотированным фаговым (вирусным) и бактериальным протеомам проводили, при-менняя программное обеспечение GeneMark Prokaryotic V 3.26. В исследовании использовалась информация, полученная из международных баз данных GeneBank, DDBJ, EMBL. Проте-омный анализ проводили, применяя ресурсы систем SnapGene Viewer v.4.1.7, ExPasy (https:// web.expasy.org), BASys (Bacterial Annotation System; https://www.basys.ca).
Результаты исследований
В результате проведенного секвениро-вания и последующего биоинформационного анализа нами были определены нуклеотидные последовательности бактериофага Ps.s-27 УлГАУ для последующего анализа in-silico. По данным секвенирования размер ДНК бактериофага Ps.s-
SeqID: Pseudomonas syringae phage Ps 27
Analysis Report:
CMSVH- CytoplasmicMembrane
CytoSVM- Unknown
ECSVM- Extracellular
ModHMM- Cy toplasmicMerrbrane
Motif- Unknown
OMPMotif- Unknown
OMSVM- OuterMembrane
PP5VM- Periplasmic
Prufile- Unknown
SCL-BIAST- Unknown
SCL-BLASTe- Unknown
Sigrial- Unknown
Localization Scores:
Extracellular 6.12
Per-ipl^smic 3.01
CytoplasmicMembrane 0.38
OuterMembrane 0.59
Cytoplasmic e.ee
Final Prediction
Unknown (This irotein may have multiple localization sites.)|
Рис. 3 - Анализ локализации исследуемых протеинов бактериофага Ps.s-27 УлГАУ
27 УлГАУ составила 24690 п.н., что также соответствует данным фореграммы (при относительной погрешности б= 0.0383). Определены аминокислотные последовательности аннотированных белков со стандартным генетическим кодом стартовых аминокислот ATG, GTG и TTG. Далее был проведен анализ соответствия сиквенсовых
Таблица 1
Характеристика протеинов бактериофага Pseudomonas syringae Ps.s-27 УлГАУ
условное название протеина кол-во аминокислот брутто-формула молекуляр ная масса, Da изоэлект рическая точка
gene_1|GeneMark.hmm|64_aa| + |9|203 64 C H N O S 302 506 84 92 1 6817.86 10.06
gene_2|GeneMark.hmm|148_aa| + |215|661 148 C H N O S 151 1190 212 225 5 17021.23 6.1
gene_3|GeneMark.hmm|401_aa| + |863|2068 401 C H N O S 1998 3195 603 561 9 45024.24 10.37
gene_4|GeneMark.hmm|318_aa| + |2227|3183 318 C H N O S 1566 2519 481 418 5 35953.65 10.08
gene_5|GeneMark.hmm|86_aa| + |3309|3569 86 C H N O S 430 684 122 121 5 9659.13 9.17
gene_6|GeneMark.hmm|121_aa| + |3570|3935 121 C H N O S 599 916 182 112 6 13671.71 10.53
gene_7|GeneMark.hmm|165_aa| + |3932|4429 165 C H N O S 822 1315 253 236 6 18710.25 9.96
gene_8|GeneMark.hmm|88_aa|-|4826|5092 88 C H N O S 454 686 132 130 1 10297.59 7.76
gene_9|GeneMark.hmm|96_aa| + |5092|5382 96 C H N O S 426 684 126 148 2 10002.91 4.25
gene_10|GeneMark.hmm|78_aa| + |5379|5615 78 C H N O S 312 600 108 120 4 8633.68 4.59
gene_11|GeneMark.hmm|167_aa| + |5612|6115 167 C H N O S 814 1299 231 238 1 18437.99 10.1
gene_12|GeneMark.hmm|41_aa| + |6112|6237 41 C H N O S 189 309 53 63 2 4395.94 5.32
gene_13|GeneMark.hmm|94_aa| + |6248|6532 94 C H N O S 424 618 126 131 9829.1 7.74
gene_14|GeneMark.hmm|151_aa| + |6535|6990 151 C H N O S 131 1134 214 211 6 16560.65 9.09
gene_15|GeneMark.hmm|87_aa| + |6983|7246 87 C H N O S 394 643 115 122 4 9071.31 9.76
gene_16|GeneMark.hmm|102_aa| + |7243|7551 102 C H N O S 531 805 141 152 6 11788.36 4.91
gene_17|GeneMark.hmm|461_aa| + |7792|9177 461 C H N O S 2164 3426 634 656 10 49141.07 6.26
gene_18|GeneMark.hmm|111_aa| + |9487|9822 111 C H N O S 519 838 162 159 11 12243.92 9.53
gene_19|GeneMark.hmm|202_aa| + |9819|10427 202 C H N O S 964 1549 291 284 10 22080.11 9.44
gene_20|GeneMark.hmm|126_aa| + |10534|10914 126 C H N O S 610 942 180 189 9 14109.71 5.14
gene_21|GeneMark.hmm|200_aa| + |10927|11529 200 C H N O S 940 1491 255 211 6 20898.97 10.16
gene_22|GeneMark.hmm|140_aa| + |11569|11991 140 C H N O S 622 1032 118 189 5 14188.3 9.89
gene_23|GeneMark.hmm|374_aa| + |12400|13524 374 C H N O S 1804 2886 510 554 11 40936.17 4.75
gene_24|GeneMark.hmm|66_aa| + |13917|14117 66 C H N O S 321 520 98 93 1 7272.27 10.41
gene_25|GeneMark.hmm|54_aa|-|14633|14797 54 C H N O S 304 506 91 90 4 7162.21 8.62
gene_26|GeneMark.hmm|74_aa| + |15073|15297 74 C H N O S 340 558 98 112 2 7874.82 4.19
gene_27|GeneMark.hmm|66_aa| + |16044|16244 66 C H N O S 325 543 95 94 3 7381.59 9.51
gene_28|GeneMark.hmm|91_aa|-|23335|23610 91 C455H118N124O141 10181.37 4.46
Таблица 2
Аминокислотные последовательности аннотированных белков со стандартным генетическим кодом для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ
условное название протеина стандартный генетический код
gene_1|GeneMark.hmm|64_ aa|+|9|203 MTETSVKLHFQALAKIASPEALVTDVAFSGVGVKATQELAEKVEQALEAPAKKTRKPRTPKAAQ
gene_2|GeneMark.hmm|148_ aa|+|215|661 MSKVESVILNTKPFRPTDYNEKAMQAVLDESYLQVDVKKDGVRLNLCVSGRAPLVNVEWLSREGKRFPALVQYLQGDERWSKFYNPHLGEALFNDEG FMLDAELILLDDHGNEKKCKNTSGDLRRKDEPVPLNRIRVYVFDSVSGHHL
gene_3|GeneMark.hmm|401_ aa|+|863|2068 VPLSDTTIRTAKPRDKLYRLTDANGLCLEVTPTGSKLWRYRYRFNGGAKMLALGAYPSVTLLKARQLRDGARQLLIEGTDPGEQKKTAKQAQKVDGLTF ETLAREWFAYNAPRWADSTTYKAKLYLENDLVPGIGSRPVKAITRPDLVELVRKVEARGTLNAAGKIRQWLHQIFRYGLAKGVVDANPATDLSWAAPP KAARHHPHVTFAELPEMLAKSEAANIHSLTRHAIRLLTLTAVRPGELRQAPWAEFDLERATWTIPAERMKARRPHVVPLPRQAVAILRQLQEITGRYELV FAGANPQRPMSENTVNKALRHMGYEGRQTGHGFRHLLSTELNGRGYNKDWIERQLAHGDTDEIRGTYNHAAYVEQRREMMQAWADSIDALCAG ANVVSIRRPA
gene_4|GeneMark.hmm|318_ aa|+|2227|3183 MLQPGEYIPLERAIVSLKRDHPEVLKAIAKAINSVDPHAEFNRETITGSKYGDSIPGFAITYGQLGSYLNTAVTRLVSVLIETEVGVIESSHVAVNREWLL KQREHAARQPEVVREIELRSYASHGATVTPIIQPLVDQDPKAARAELRKLNIRIERSLVIRPDDERDAEIERLRIQLEASTAREKSIAATVDASEKAIKMLT RENDQLRKERSSTQLPTASIATRKPDSKPRKLSNVEMRNEKARACQAQVKERATSLWRHADYAKHRTTDMVNVIRRLADSEPDWNLPKNDAALAR WISSSAPEFAKRPGRPRKEK
gene_5|GeneMark.hmm|86_ aa|+|3309|3569 MTAITHHIPTPAKQAVLAHGDNPPIRFIKRQAVEGITGLSCTEIYRRIAADNFPKQVMLGPKCVVWVEAEIYSWMNDRIAESREVA
gene_6|GeneMark.hmm|121_ aa|+|3570|3935 MKKSQPLYQQTSPSQGDITTPAPASKAPSKIARVLEHMLYDGSLIRFEAERLGDHCLHSTISSLANGYGLKFQRQLERVPNHWGEPCTVTRYTLPASERR RARNVLLMLCKPLKQRQKVAA
gene_7|GeneMark.hmm|165_ aa|+|3932|4429 MNAIVLIRSKGEARADSRVLAEQLGVKAKNTLGLIERYIGKFERFGVVPFETEKPGAGTAGGRPERFALLNEDQCYFLLSLSRNTDRVVELKADLIMAFRE ARYGHACQTLEARKMEASNSGRRLAHWRYDKPGVYAHVAHLREQLKLPLGMEDARHDGYAHDRR
gene_8|GeneMark.hmm|88_aa|-|4826|5092 LRTTKQYCAQFDLGPQRVNAAGEWMARRLHQWNNFMDQDAFQLDGKTYQVAKQLFTAGADFWLDQISGRIHCVPPTDSRERAMVMWCE
gene_9|GeneMark.hmm|96_ aa|+|5092|5382 MNNPVRTIQEIAHDALEDLGSAQVVLGKLESLPYAALADNGTSQHVRNLVDIAWNLAADGANTASGDFEAIGKALSGCASQNAQSENVARDSEVKP
gene_10|GeneMark.hmm|78_ aa|+|5379|5615 MTRSRELYNNIDAHLRVIRGLAVILMDNDCFKTEATGHAPAQLDAENEMSIHEAVHLLSDQAQHELIELVDLLGGTPA
gene_11|GeneMark.hmm|167_ aa|+|5612|6115 MKTSIPKSRRPLPKSKQIGLRSKPEGKWAWDRLPFVGKDHGRQSFWDVPMLGGHFGGIDAGRAMALVYLKYVRDHRSDEIHNASGILSSILVAMDAK KPSTEDEAASLQGQRTGFMNEICSWIKAAAERLGSTLDAIPERSFVQQANEGLVRTDAAFMASIESKVKP
gene_12|GeneMark.hmm|41_ aa|+|6112|6237 MTIAKFQDGGALMSEQGIVHLDIDEPETTAKSPKHRTGALT
gene_13|GeneMark.hmm|94_ aa|+|6248|6532 MKIQNGASASTGSACLKKAAELFYVTHPKVPKALLGPFLTEADAECGRVVMRSADAQVTACLVEAIDDITHWHGVNNGQVCRAFAGADRQGGGQ
gene_14|GeneMark.hmm|151_ aa|+|6535|6990 MVHHYTTEHHHLPLILTSGSLRPNNAGAEHEPPLVWFSKAQRWEGTATKMVMGADGPRLLTFAEQLAEFGCARFSLPADDARLMSWVDACKYAGIT STTRRKLESVGRKRGASPINWFAIAGDVPLADVRLQRFDGAAWVGYSSAEGVTHG
gene_15|GeneMark.hmm|87_ aa|+|6983|7246 MGNVTPIKPKGSGGPPTAGAHIDSASYVLLVETLVGFLELRISEGDQGRHCDESGTKRPAVSTSSGSVVGCVVWTVARFMSARLTLR
gene_16|GeneMark.hmm|102_ aa|+|7243|7551 LNFLLQSAGAIICKKWVVEVERILMEEHGLYHGWYKDDGTPGDFCYMAWVHDELQIAARTPEIAEIVAKVAQQAIREVGESFQFRCQLDTDYKIGATW RECH
gene_17|GeneMark.hmm|461_ aa|+|7792|9177 MEYLLDQHPAEVFATTSRPGWHESGAFVLPGRTIGSANVRYQASNKAQVLFSRRGELTLWQSEVAAKCAGNPVLTLAIGCSLAGPLLSLVGVLGGGVHL VGDSSSGKSLAQLIGSSVWGDPGVFAASWDMTKGGLEIEASSRNDTILPLDEIKRADPKRVQEMAYSLANGQGKGTMTREREGRAKLSWRLLTLSSGE RSLSEHAAISGNAAHAGAELRMVDVNAGTRTHRAFDELHGLEGADFHRQLTVAVGAHHGHLGPAFVERLVAADDKPGLLSDFDGIRAQFVEDNAQA GRVADRFAVIALAGEMAIAYGLLPWEPGTALSDCRLLYGEWLSRVGGGNAEDRQILAGIIDFIDKHGSSRFSDVDAAEVDAKVFNRAGYWELVAGKRLY LFNKSALIEAAHGFGLTRVVKALEVGGALAKRDTDRDSRKTKKYRIPAGGSARLYVIDPEAMDSEGGGA
gene_18|GeneMark.hmm|111_ aa|+|9487|9822 MEQSGRGNAMSLLSGLLDHMPPAIASTDTPKMDSRPRPRLVLANPVERTPRLLTSPHASAATATPEWRQTRDQYLTHIMVCRSCYAPTGRHCMVGA DLRACYDATPMEAHQ
gene_19|GeneMark.hmm|202_ aa|+|9819|10427 MTPSLITRLCNIGMKPGISAATQLITTRRICRAIADQLDVIRGERRALRRQAGKLKAFLPFTRQTIAELEERAQEHQEATRSGAWSALAGFGQSLMFDRE GLAQALGFDQMCDLLSVNPVHRHRAIADGDTSLRGVAYLSQLEDSADRKGDEWGAGGPLYRACHAAMIRFIRECPEDQLPDPFAPGAPFGPKLPPA LSIVGN
gene_20|GeneMark.hmm|126_ aa|+|10534|10914 MTDQDSNTTGQAPTYRERFAEACKIMDFAVAPNMNGGYLVWEVQHVRDGQKVTIDGPFFTEDEGGISADLLRGTFRGARAYQAIHCWAWNPDPR REKAIRDDAMASRMMLAMQIGAEVPTHATNDK
gene_21|GeneMark.hmm|200_ aa|+|10927|11529 MAASVIEYTPVINFKLRGALRQFGKSYPLAVRTPAEAVKALCVQIPGFERYLSNAKSRGLEFAVFRDKRNIGESELNFSGTGDITIAPVITGSKRGGSLQTIIG SVLIAAAFVLSFTPFAAASPFLYQVGAAMAIGGIIQMLSPQAGGLKTSAAPENTPGYAFGSARNTTASGNPVPLCYGKRRVGGAIISAAIYAEDQM
gene_22|GeneMark.hmm|140_ aa|+|11569|11991 MRRIATTALFAALLAGCATSPVPIKNAVAVPPERVLAYQKDAPGTGTLSVTRDSGHTGSLCSVGLFVDGKVAALLKPGERVALHVPAGSVVVGAAYQGG GICGMGAERQERETIVTGGKVKSYRISTSGDGVLDILPTTL
gene_23|GeneMark.hmm|374_ aa|+|12400|13524 MRLPDFILENLEPILQAWEDFARTIETPGADLDSEALRDHAEQMLLAIVSDLRTKQTKREQAAKSQGQAPLDDEETAAEIHAMTRLMAGFTIDQMVSE YRALRTSVVSQWMRQVKDGTPINVDDMTRFHEAIDQALAESVASYSRAVEASRNVFLGILGHDLRTPLGAILLGADVLRRLEGTGARATKVANQIYTSV RRASQIVGDLLDLTRCQMGPGIPVKPANIDLSPLCERVVEEIRAFHPEARILFEAKAPVNGQFDGARVEQVFSNIISNAVHHGNNQLPIKVELETFEGCAI FTVLNDGEPIPEDVLPFIFNPLGRFSQRAAIDHGPTEGLGLGLFIASEIVASHNGSIDVSSNADQGTVFVVKLPIA
gene_24|GeneMark.hmm|66_ aa|+|13917|14117 MKTLRSPSEAKTWLRAHGISVQEFARQHDLDPATTYQVLSGAKKGYRGKAHRAAIALGIKAEPDLQ
gene_25|GeneMark.hmm|54_aa|-|14633|14797 LDLTKPDRESTEVKRANGGFDVVIHGVFREGGQVASGNHCKTLETTVETSAWQP
gene_26|GeneMark.hmm|74_ aa|+|15073|15297 MTDTKLIASLFDRLNQNQLALGAAVEGLSCWVEQRGSADIANNVRGALETLDENLVFIRQGIAELTVAGSLGQS
gene_27|GeneMark.hmm|66_ aa|+|16044|16244 VSVIDCDYLPADKVVFPPELALLIVRKASAMAAAFEEQALDQLTKDARRALSRGAEPRRVIREMRL
gene_28|GeneMark.hmm|91_aa|-|23335|23610 VGVAWSGEEEPDFRFEPVTELADLHEPTYRDSAVALLDIEVVAFVERGGEIEREKGRRVSAKRVRLTQSLPEDWVAVFSQLLVPKLEGTGT
данных аннотированным фаговым (вирусным) и бактериальным протеомам. Полученные результаты для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ представлены на рис. 1. Системой было выявлено 28 открытых рамок считывания при использовании стандартного генетического кода.
Далее нами был проведен анализ локализации исследуемых протеинов бактериофага Ps.s-27 УлГАУ (рис. 3)
В результате проведенных исследований было определено, что для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ капсидные белки составляют 61,2%. Были проведены исследования по анализусиквенсовой последовательности бактериофага Ps.s-27 УлГАУ с аннотированными в системе NCBI данными. В системе Swiss-Model данные белки были смоделированы для целей определения димерных и полимерных структур, которые могут составлять капсид бактериофага.
В таблице 1 представлены данные, характеризующие количество аминокислот, молекулярную массу с учетом естественного содержания изотопов, изоэлектрическую точку и брутто-формулу, 28 протеинов бактериофага Pseudomonas syringae Ps.s-27 УлГАУ.
В таблице 2 представлены аминокислотные последовательности аннотированных белков со стандартным генетическим кодом для бактериофага Ps.s-27 УлГАУ.
В системе Swiss-Model протеины, описанные в таблицах 1и 2, были смоделированы для целей определения димерных и полимерных структур, которые могут составлять капсид бактериофага Ps.s-27 УлГАУ.
По данным проведенного анализа, протеины gene_3, gene_17 и gene_23 являются ди-мерами, что может свидетельствовать об их потенциальной роли в структуре капсида бактериофага Ps.s-27 УлГАУ. Их молекулярная масса 45,0, 49,1 и 40,9 kDa, что также соответствует литературным данным [12-13].
Обсуждение
По данным некоторых исследователей, капсид, например, бактериофага Т4 содержит
Рис. 4 - 3D модель протеина бактериофага Pseudomonas syringae Ps.s-27 УлГАУ (Swiss-Model^) gene_1; Б) gene_2; В) gene_3; Г) gene_4; Д) gene_5; Е) gene_6; Ж) gene_17; З) gene_23; И) gene_28
около 580 копий каркасного белка 75 кДа, а портальные субъединицы фагов ф29 и P22 имеют молекулярную массу 36 и 83 кДа соответственно. Кроме того, капсид Т4 содержит более 1000 молекул 3 небольших внутренних белков (8-20 кДа) [13-15]. По данным Мирошникова К.А. [16], структурные белки Pßl-подобных фагов имеют молекулярную массу - 14-20 кДа. Размер основных белковых последовательностей фага ф!ВВ-PF7A (Pseudomonas fluorescens) находится в пределах 16-140 кДа. В состав капсида бактериофага ФЕа2809 (f. amylovora) входит довольно большое количество белков - около 10 (масса колеблется в пределах 17-120 кДа) [17]. Таким образом, белки, которые могут являться потенциальными структурными компонентами капсида бактериофага, имеют молекулярную массу от 8 до 140 кДа.
Заключение
По данным проведенного секвенирова-ния бактериофага Ps.s-27 УлГАУ размер ДНК составил 24690 п.н., что соответствует данным электрофореза (при относительной погрешности 6=0.0383). Определены аминокислотные последовательности аннотированных белков
со стандартным генетическим кодом стартовых аминокислот ATG, GTG и TTG. В системе Swiss-Model данные белки были смоделированы для целей определения димерных и полимерных структур, которые могут составлять капсиды бактериофагов. Для Ps.s-27 УлГАУ выявлены три димера - gene_3, gene_17 и gene_23 с молекулярной массой 45, 49,1 и 40,9 kDa.
Полученные данные позволяют продолжить составление паспорта биологических свойств производственно-перспективного бактериофага Ps.s-27 УлГАУ, который входит в состав биопрепарата, направленного действия, активного в отношении фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae.
Библиографический список
1. Potential of Berry Extracts to Control Foodborne Pathogens / Q. Das, M. R. Islam, M. F. Marcone, K. Warriner, M. S. Diarra // Food Control.
- 2017. - V. 73. - P. 650-662.
2. Ferrante, P. Identification of Pseudomonas syringae pv. actinidiae as causal agent of bacterial canker of yellow kiwifruit (Actinidia chinensis Planchon) in central Italy / P. Ferrante, М. Scortichini // Journal of Phytopathology. - 2009. - V. 157. - P. 768-770.
3. An in vitro Actinidia bioassay to evaluate the resistance to Pseudomonas syringae pv. actinid-iae / F. Wang, J. Li, K.Ye, P. Liu, H. Gong, Q. Jiang, B. Qi, Q. Mo // The Plant Pathology Journal. - 2019. -V. 35. - P. 372.
4. Outbreak of bacterial canker on Hort16A (Actinidia chinensis Planchon) caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea / Y. Koh, G. Kim, J. Jung, Y. Lee, J. N. Hur // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. - 2010. - V. 38.
- P. 275-282.
5. New insights on the bacterial canker of kiwifruit (Pseudomonas syringae pv. actinidiae) / I. Donati, G. Buriani, A. Cellini, S. Mauri, G. Costa, F. Spinelli // Journal of Berry Research. - 2014. - № 4. - Р. 53-67.
6. Young, J. Pseudomonas syringae pv. actinidiae in New Zealand / J. Young // The Plant Pathology Journal. - 2012. - V. 94. - P. 5-10.
7. Characterization of Novel Bacteriophages for Biocontrol of Bacterial Blight in Leek Caused by Pseudomonas syringae pv. porri / S. Rombouts, A. Volckaert, S. Venneman, B. Declercq, D. Vanden-heuvel, C. N. Allonsius, C. Van Malderghem, H. B. Jang, Y. Briers, J. P. Noben // Frontiers in Microbiology. - 2016. - V. 7. - Р. 279.
8. Pseudomonas syringae pv. actinidiae: Ecology, infection dynamics and disease epidemiology / I. Donati, A. Cellini, D. Sangiorgio, J. L.Vanneste, M. Scortichini, G. M. Balestra, F. Spinelli // Microbial Ecology. - 2020. - V. 80. - P. 81-102.
9. Isolation and characterisation of phages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae / Y. Yin, P. E. Ni, B. Deng, S. Wang, W. Xu, D. Wang // Acta Agriculturae Scandinavica, Section B-Soil & Plant Science. - 2019. - № 3 (69). - Р. 199-208.
10. Xin, X. F. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen / X. F. Xin, В. Kvitko, S.Y. He // Nature Reviews Microbiology. - 2018. - № 5 (16).
- Р. 316.
11. Конструирование бактериофагового препарата для биоконтроля Pseudomonas syringae в растениеводстве / Д. А. Васильев, А. К. Беккалиева, Н. А. Феоктистова, Е. В. Сульдина // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2020. - № 2 (50). - С. 130-137.
12. Летаров, А. В. Современные концепции биологии бактериофагов / А. В. Летаров.
- Москва : ДеЛи, 2020. - 384 с. - ISBN 978-5604271-24-7.
13. Identification of bacteriophages for bio-control of the kiwifruit canker phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae / R. A. Framp-ton, C. Taylor, A. V. H. Moreno, S. B. Visnovsky, N. K. Petty, A. R. Pitman, P. C. Fineran // Applied and Environmental Microbiology. - 2014. - V. 80(7). - P. 2216-2228.
14. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications / E. Kutter, А. Sulakvelidze. - Boca Raton, FL : CRC Press, 2005. - 510p.
15. Genome, proteome and structure of a T7-like bacteriophage of the kiwifruit canker phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae / R. Frampton, E. Acedo, V. Young, D. Chen, B. Tong,
C. Taylo, P. Fineran // Viruses. - 2015. - V. 7. - Р. 3361-3379.
16. Molecular biological and genetic principles of selection of therapeutic bacteriophages of bacteria of the genera Pseudomonas and Staphylococcus / K. A. Miroshnikov, E. E. Kulikov, O. S. Darbeeva, K. A. Lysko, G. M. Ignatiev // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2014. - № 50 (3). - Р. 338.
17. Gerasimovich, А. D. Characteristics of bacteriophages of phytopathogenic bacteria / А.
D. Gerasimovich, G. I. Novik, E. I. Kolomiets // Microbial technologies: fundamental and applied aspects. - 2012. - № 4. - Р. 140-153.
BACTERIOPHAGE GENOME AND PROTEOME STUDY OF PHYTOPATHOGENIC PSEUDOMONAS SYRINGAE BACTERIA
Feoktistova N.A., Suldina E.V., Bogdanov I.I., Abdurakhmanov I.M.
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Ulyanovsk State Agrarian University 432017, Ulyanovsk, Novyi Venets boulevard, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Keywords: Pseudomonas syringae, bacteriophage, capsid proteins, molecular weight, amino acids, proteome, DNA
The article describes results of the study of genomic and proteomic characteristics of the production-promising Ps.s-27 bacteriophage of the Ural State Agrarian University, specific for phytopathogenic Pseudomonas syringae bacteria. The sequencing results allowed to determine the DNA size of the studied bacteriophage, which amounted to 24690 bp. These data correspond to the results obtained during electrophoresis (relative error S= S= 0.0383). Analysis of correspondence of sequence data to annotated proteomes in GeneMark Prokaryotic V 3.26. identified 28 open reading frames. The localization analysis of the studied proteins was carried out and it was determined that capsid proteins accounted for 61.2% for Ps.s-27 of UlGAU bacteriophage. Data which characterize 28 proteins of the studied bacteriophage were systematized, these data generalize information on the number of amino acids, molecular weight, isoelectric point and gross formula. When performing analysis for Ps.s-27 UlGAU, three dimers were revealed (gene_3, gene_17, and gene_23) with molecular weights of 45.0,49.1, and 40.9 kDa, which may indicate their potential role in the capsid structure of the studied phage. The obtained data allow us to continue compiling a passport of biological properties of the production-promising Ps.s-27 UlGAU bacteriophage, which is a part of a biopreparation with direct effect.
Bibliography:
1. Potential of Berry Extracts to Control Foodborne Pathogens / Q. Das, M. R. Islam, M. F. Marcone, K. Warriner, M. S. Diarra // Food Control. - 2017. - V. 73. - P. 650-662.
2. Ferrante, P. Identification of Pseudomonas syringae pv. actinidiae as causal agent of bacterial canker of yellow kiwifruit (Actinidia chinensis Planchon) in central Italy / P. Ferrante, M. Scortichini //Journal of Phytopathology. - 2009. - V. 157. - P. 768-770.
3. An in vitro Actinidia bioassay to evaluate the resistance to Pseudomonas syringae pv. actinidiae /F. Wang, J. Li, K.Ye, P. Liu, H. Gong, Q. Jiang, B. Qi, Q. Mo // The Plant Pathology Journal. - 2019. -V. 35. - P. 372.
4. Outbreak of bacterial canker on Hort16A (Actinidia chinensis Planchon) caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea / Y. Koh, G. Kim, J. Jung, Y. Lee, J. N. Hur // New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. - 2010. - V. 38. - P. 275-282.
5. New insights on the bacterial canker of kiwifruit (Pseudomonas syringae pv. actinidiae) / I. Donati, G. Buriani, A. Cellini, S. Mauri, G. Costa, F. Spinelli // Journal of Berry Research. - 2014. - № 4. - P. 53-67.
6. Young, J. Pseudomonas syringae pv. actinidiae in New Zealand /J. Young // The Plant Pathology Journal. - 2012. - V. 94. - P. 5-10.
7. Characterization of Novel Bacteriophages for Biocontrol of Bacterial Blight in Leek Caused by Pseudomonas syringae pv. porri / S. Rombouts, A. Volckaert, S. Venneman, B. Declercq, D. Vandenheuvel, C. N. Allonsius, C. Van Malderghem, H. B. Jang, Y. Briers, J. P. Noben //Frontiers in Microbiology. - 2016. - 7. - P. 279.
8. Pseudomonas syringae pv. actinidiae: Ecology, infection dynamics and disease epidemiology / I. Donati, A. Cellini, D. Sangiorgio, J. L.Vanneste, M. Scortichini, G. M. Balestra, F. Spinelli//Microbial Ecology. - 2020. - V. 80. - P. 81-102.
9. Isolation and characterisation of phages against Pseudomonas syringae pv. actinidiae / Y. Yin, P. E. Ni, B. Deng, S. Wang, W. Xu, D. Wang // Acta Agriculturae Scandinavica, Section B-Soil & Plant Science. - 2019. - № 3 (69). - P. 199-208.
10. Xin, X. F. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen / X. F. Xin, B. Kvitko, S.Y. He // Nature Reviews Microbiology. - 2018. - № 5 (16). - P. 316.
11. Design of a bacteriophage preparation for biocontrol of Pseudomonas syringae in crop production / D. A. Vasiliev, A. K. Bekkalieva, N. A. Feoktistova, E. V. Suldina // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2020. - № 2 (50). - P. 130-137.
12. Letarov, A. V. Modern concepts of bacteriophage biology / A. V. Letarov. - Moscow: DeLi, 2020. - 384 p. - ISBN 978-5-604271-24-7.
13. Identification of bacteriophages for biocontrol of the kiwifruit canker phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae / R. A. Frampton, C. Taylor, A. V. H. Moreno, S. B. Visnovsky, N. K. Petty, A. R. Pitman, P. C. Fineran //Applied and Environmental Microbiology. - 2014. - V. 80(7). - P. 2216-2228.
14. Kutter, E. Bacteriophages: biology and applications / E. Kutter, A. Sulakvelidze. - Boca Raton, FL: CRC Press, 2005. - 510p.
15. Genome, proteome and structure of a T7-like bacteriophage of the kiwifruit canker phytopathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae / R. Frampton, E. Acedo, V. Young, D. Chen, B. Tong, C. Taylo, P. Fineran // Viruses. - 2015. - V. 7. - P. 3361-3379.
16. Molecular biological and genetic principles of selection of therapeutic bacteriophages of bacteria of the genera Pseudomonas and Staphylococcus / K. A. Miroshnikov, E. E. Kulikov, O. S. Darbeeva, K. A. Lysko, G. M. Ignatiev//Applied Biochemistry and Microbiology. - 2014. - № 50 (3). - P. 338.
17. Gerasimovich, A. D. Characteristics of bacteriophages of phytopathogenic bacteria / A. D. Gerasimovich, G. I. Novik, E. I. Kolomiets // Microbial technologies: fundamental and applied aspects. - 2012. - № 4. - P. 140-153.
