РАЗРАБОТКА МЕТОДА ФАГОИНДИКАЦИИ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS SYRINGAE В ОБЪЕКТАХ САНИТАРНОГО НАДЗОРА Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 632.35:579.64

DOI 10.18286/1816-4501-2020-3-148-157

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ФАГОИНДИКАЦИИ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS SYRINGAE В ОБЪЕКТАХ САНИТАРНОГО НАДЗОРА

Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Беккалиева Айдын Канатовна, соискатель кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Сульдина Екатерина Владимировна, ассистент кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ

432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru

Ключевые слова: Pseudomonas syringae, индикация, реакция нарастания титра фага, параметры, полифаговый биопрепарат, почва, речная вода, семена огурца

В статье представлены результаты исследований по разработке параметров практического применения фагового биопрепарата Pseudomonas syringae с целью индикации данных фитопатогенных бактерий в объектах санитарного надзора. Во введении статьи описан патоваров Pseudomonas syringae и растений, которые они поражают, что доказывает актуальность исследований, направленных на разработку ускоренных методов индикации и идентификации бактерий - возбудителей заболеваний, которые позволят специалистам в краткие сроки разработать меры борьбы с вышеназванными фитопатогенами. Было установлено, что культивирование системы «бактериофаг-исследуемый материал» при температуре 28 ± 10С в течение 3,5 часа позволяет выявить в пробах почвы, речной воде и семенах огурца бактерии Pseudomonas syringae методом РНФ в концентрации 103 м.к./мл., увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в монокультуре были использованы в экспериментах в концентрации 103 БОЕ/мл. При тестировании в РНФ полифагового биопрепарата, включающего в основе вышеназванные бактериофаги было установлено, что в исследованиях пробы воды речной получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробе семян огурца. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 103 м.к./мл. Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 102 БОЕ/мл позволило провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в пробе почвы в концентрации 103мк/г.

Исследования проводятся в соответствии с тематическим заданием научно-исследовательских работ,

выполняемых по заданию МСХ РФ в 2020 году.

Введение

По литературным данным бактерии Pseudomonas syringae поражают примерно 180 видов как культурных, так и дикорастущих растений. Симптопатология заболеваний различна: опухоли, некроз, хлороз листьев, загнивание, отмирание роста и отмирание частей растения без признаков гниения и т.д. [1-2].

Впервые штамм бактерий, получивший название Pseudomonas syringae, был идентифицирован Van-Hall в 1902 году из пробы сирени (Syringa vulgaris), что и послужило прецедентом при определении названия и в дальнейшем стало таксономическим обозначением гомологичных бактериальный культур. В последующие годы исследователями было идентифицировано множество штаммов бактерий, имеющих аналогичные биологические свой-

ства, которые были способны вызывать болезни первоначально растений других видов. Штаммы Pseudomonas syringae подразделяются на 56 патоваров, так как они могут контами-нировать различные растения [3]. Наибольшее значение в фитопатологии имеют следующие патовары: Pseudomonas syringae pv. aptata, вызывающие ожог листьев и гниль корнеплодов сахарной свёклы (Beta vulgaris L. subsp. vulgaris)

[4], Pseudomonas syringae pv. atrofaciens вызывающие базальный бактериоз пшеницы (Triticum)

[5], Pseudomonas syringae pv. japonica - являются патогенами для ячменя (Hordeum) [6]; Pseudomonas syringae pv. panici вызывают полосатый бактериоз или полосатую пятнистость проса обыкновенного (Panicum miliaceum L.) [7]; Pseudomonas syringae pv. pisi поражает горох посевной (Pisum sativum L.) [8]; Pseudomonas

syringae pv. syringae - это космополит, паразитирующий на многих культурных и декоративных растениях [9-10]; Pseudomonas syringae pv. maculicola поражает цветную капусту (Brassica oleracea) [11]; Pseudomonas syringae pv. helianthi - это возбудитель бурой угловатой пятнистости листьев подсолнечника (Helianthus annuus L.) [12]; Pseudomonas syringae pv. mellea вызывает мелкую некротическую пятнистость подсолнечника однолетнего (Helianthus annuus L.) [13]; Pseudomonas syringae pv. tomato поражает томаты (Solanum lycopersicum) [14]; Pseudomonas syringae pv. lachrimans является возбудителем угловатой пятнистости огурца обыкновенного (Cucumis sativus) [15]; Pseudomonas syringae pv. tabaci. - это возбудитель бактериальной рябухи табака обыкновенного (Nicotiana tabacum L.) [16], но на сое культурной (Glycine max) вызывает бактериальный ожог [17]. Представители вида Pseudomonas syringae pv. papulans поражают яблоню домашнюю (Malus domestica), Pseudomonas syringae pv. aceris - клён остролистный (Acer platanoides L.); Pseudomonas syringae pv. fraxini - ясень (Fraxinus); Pseudomonas syringae pv. oleae - оливу европейскую (Olea europaea) [18-20].

Представленный выше перечень патова-ров Pseudomonas syringae и растений, которые они поражают, доказывает актуальность исследований, направленных на разработку ускоренных методов индикации и идентификации бактерий - возбудителей заболеваний, которые позволят специалистам в краткие сроки разработать меры борьбы с вышеназванными фито-патогенами.

В настоящее время в сельском хозяйстве интерес к бактериофагам связан с их применением для контроля популяций патогенов теплокровных животных, рыб и птицы, а также фито-патогенов, наносящих значительный экономический ущерб, в качестве недорогих лечебных и профилактических биопрепаратов, а также высокоспецифичных диагностикумов [21-23].

Цель исследований - разработка параметров практического применения фагового биопрепарата Pseudomonas syringae с целью индикации в пробах воды, почвы и в семенном материале в реакции нарастания титра фага.

Материалы и методы исследований

В экспериментах применяли штамм бактерий Pseudomonas syringae Ps.s № 3 (коллекция музея бактериальных штаммов и бактериофагов кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитар-

ной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ).

Характеристика бактериофага Ps.s-7 УлГАУ: выделен из пробы почвы (Республика Казахстан, Западно-Казахстанская область, г.Уральск), индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность - 10-8 (при определении по методу Аппель-мана) и 2,0±0,1х109 БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) (при определении по методу Грациа), специфичность - 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; в исследованиях установлена устойчивость к температуре до 600С в течение 30 минут и трихлорметану в соотношении 1:10 (временная экспозиция 35 минут).

Характеристика бактериофага Ps.s-27 УлГАУ: выделен из пробы почвы (Российская Федерация, Ульяновская область, Ульяновский район, р.п. Ишеевка), индикаторная культура Ps.s № 3, литическая активность - 10-8 (по методу Аппель-мана) и 1,0±0,1х109 БОЕ/мл (по методу Грациа), специфичность - 85,7 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; определено, что бактериофаг устойчив к воздействию температуры до 600С в течение 30 минут и трихлор-метана в соотношении 1:10 (время экспозиции составило 35 минут).

Полифаговый биопрепарат состоял из двух бактериофагов - Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ, которые культивировались на индикаторной культуре Pseudomonas syringae Ps.s № 3, диапазон литического действия составлял 100 % на 14 бактериальных штаммах Pseudomonas syringae; показатель литической активности 1,0±0,2х109 БОЕ/мл.

Рабочее разведение бактериофагов и фагового биопрепарата составляло 1:1000 и 1:100 в стерильном мясо-пептоном бульоне (МПБ).

Трихлорметан (хлороформ) использовался для очистки бактериофагов от бактериальных клеток в соотношении 1:10 при временной экспозиции 30 минут при встряхивании в шуттель-аппарате в течение 25 минут и отстаивании в течение 5 минут.

Реакция нарастания титра фага - это метод индикации, позволяющий выявить бактериальный агент в анализируемом материале, не выделяя чистую бактериальную культуру. В основу метода индикации положен тот факт, что если в анализируемой пробе присутствует искомый вид бактерий, то при введении специфичного бактериофага в определенном титре (концентрации) при адсорбции происходит увеличение его количества [24].

Реакцию нарастания титра фага ставили на пробах почвы (садоводческое общество

Рис. 1 - Схема индикации бактерий Pseudomonas syringae с методом реакции нарастания титра фага с использованием изучаемого бактериофагового биопрепарата

«Садовод УСХИ» п. Октябьский Чердаклинско-го района Ульяновской области), семенах огурца «Китайский змей» и речной воде (р.Свияга, г.Ульяновск) на базе кафедры (МВЭ и ВСЭ) микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ). Пробоподготовку осуществляли следующим образом: гомогенизация и последующее разведение анализируемого материала в стерильном физиологическом растворе, используя соотношение 1:10.

При подборе оптимального времени экспозиции компонентов фагового биопрепарата (полифагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ) с исследуемой пробой эмпирически подбирали временной диапазон термостатирования с учетом температуры культивирования индикаторной бактериальной культуры. Эксперименты ставили на стерильном МПБ.

Параметры постановки эксперимента:

- исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, не применяя этап «предва-

рительного подращивания», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов;

- исследуемый субстрат вместе с введенным бактериофагом термостатировали при температуре 28±1 0С, включая этап «предварительное подращивание», в течение 3,5; 7,0; 15,0; 24,0 часов.

Схема исследования показана на рисунке 1. Результаты индикации бактерий в анализируемом субстрате методом реакции нарастания титра фага (РНФ) учитывались следующим образом: увеличение на чашке Петри количества негативных колоний фага (бляшкообразую-щих единиц) по сравнению с контролем в пять и более раз свидетельствует об наличии в опытной пробе искомых бактерий, на которых адсорбировался специфичный им бактериофаг и был зафиксирован цикл его развития [25]. Результаты исследований При подборе оптимального времени экспозиции бактериофагов Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 Ул-ГАУ с исследуемым материалом (в эксперименте использовался стерильный мясо-пептонный

Таблица 1

Результаты постановки реакции нарастарния титра фага с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в стерильном мясо-пептонном бульоне

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - мясо-пептонный бульон, (м.к./мл) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

Ps.s-7 УлГАУ

103 5±2 - 31±11 6

104 5±2 - 55±11 11

105 5±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 5±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 5±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Ps.s-27 УлГАУ

103 3±1 - 19±3 6

104 3±1 - 28±8 9

105 3±1 - полный лизис бактериальной культуры -

106 3±1 - полный лизис бактериальной культуры -

107 3±1 - полный лизис бактериальной культуры -

Таблица 2

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на семенах огурца

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - семян огурца, (м.к./г) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

Ps.s-7 УлГАУ

103 4±2 - 55±12 13

104 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

105 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Ps.s-27 УлГАУ

103 2±1 - 12±3 6

104 2±1 - 25±8 12

105 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

106 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

107 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

Таблица 3

Результаты экспериментов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе почвы

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - пробы почвы, (м.к./г) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

Ps.s-7 УлГАУ

103 3±1 - 15±2 5

104 3±1 - 24±3 8

105 3±1 - 48±8 16

106 3±1 - полный лизис бактериальной культуры -

107 3±1 - полный лизис бактериальной культуры -

Ps.s-27 УлГАУ

103 2±1 - 12±3 6

104 2±1 - 25±2 12

105 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

106 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

107 2±1 - полный лизис бактериальной культуры -

Таблица 4

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в пробе речной воды

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - речной воды, (м.к./мл) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

Ps.s-7 УлГАУ

103 6±2 - 32±12 6

104 6±2 - 48±12 8

105 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Ps.s-27 УлГАУ

103 4±2 - 24±2 6

104 4±2 - 36±7 9

105 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 4±2 - полный лизис бактериальной культуры -

бульон) было установлено, что этап «предварительное подращивание» применять в схеме постановки эксперимента нецелесообразно, так как определено, что культивирование системы

«бактериофаг - исследуемый материал» при температуре 28 ± 1 0С в течение 3,5 часов позволяет выявить бактерии Pseudomonas syringae при методом РНФ в концентрации 103 м.к./мл.

Таблица 5

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе семян огурца

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - семян огурца, (м.к./г) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

103 7±2 - 56±6 8

104 7±2 - полный лизис бактериальной культуры -

105 7±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 7±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 7±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Таблица 6

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - пробы почвы, (м.к./г) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

103 6±2 - 24±6 4

104 6±2 - 36±8 6

105 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 6±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 1.

Далее эксперименты были направлены на отработку параметров постановки РНФ на тест-объектах (семена огурца, проба почвы, речная вода), которые были контаминированы бактериями Pseudomonas syringae в концентрации 103 - 107 м.к./мл (г) в лабораторных условиях. Схема эксперимента отражена на рисунке 1. Полученные нами результаты экспериментов представлены в таблицах 2-4.

Принимая во внимание полученные нами положительные результаты экспериментов по индикации бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 103 м.к./г (мл) бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ на пробах семян огурца, почвы и речной воды, было принято решение провести исследования на тех же тест-объектах с применением фагового биопрепарата, состоящего из вышеназванных бактериофа-

гов. Применение бактериофагов в составе полифагового биопрепарата позволило бы сократить затраты расходных материалов и трудозатраты на исследования. Таким образом, продолжительность постановки РНФ с бактериофагами Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ составляет 23 часа, включающие этап подготовки реакции 30 минут + 3,5 часа - время термостатирования посевов + этап очистки субстрата трихлорметаном - 30 минут + высев субстрата методом агаровых слоев - 30 минут + 18 часов - время термостатирования посевов = 23 часа. В расчет времени не был включен этап предварительной подготовки бактериофага до концентрации 103 БОЕ/мл.

Следующий этап исследований - это отработка схемы постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом (два бактериофага - Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ - культивировались в одном флаконе) в вышеназванных тест-объектах. Результаты экспериментов отражены в таблицах 5-7.

Таблица 7

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе почвы (титр фага 102 БОЕ/мл)

Концентрация бактерий Pseudomonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - пробы почвы, (м.к./г) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

103 9±2 - 54±3 6

104 9±2 - полный лизис бактериальной культуры -

105 9±2 - полный лизис бактериальной культуры -

106 9±2 - полный лизис бактериальной культуры -

107 9±2 - полный лизис бактериальной культуры -

Таблица 8

Результаты экспериметов постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae полифаговым биопрепаратом в пробе речной воды

Концентрация бактерий Pseudornonas syringae, используемая для контаминации тест объекта - речной воды, (м.к./мл) Контроль индикаторного бактериофага (М±т) Контроль свободного бактериофага (М±т) Опыт (М±т) Примерное увеличение количества БОЕ (раз)

Количество БОЕ/мл

103 8±1 - 43±8 5

104 8±1 - 65±8 8

105 8±1 - полный лизис бактериальной культуры -

106 8±1 - полный лизис бактериальной культуры -

107 8±1 - полный лизис бактериальной культуры -

Результаты постановки РНФ на тест объекте - семенах огурца -показали, что выявленная при помощи фагового биопрепарата концентрация бактерий Pseudomonas syringae составила 103 м.к./мл, то есть визуально нами было подсчитано, что количество бляшкообразующих единиц бактериофагов на опытных чашках Петри в сравнении с контрольными увеличилось примерно в 8 раз.

Из материалов таблицы 6 следует, что эффективность РНФ в пробе почвы показала, что обнаруживаемая в пробе почвы концентрация бактерий Pseudomonas syringae - это 104 м.к./г. Согласно вышезаявленным критериям оценки результатов постановки РНФ полученные результаты не являются положительными. Было зафиксировано снижение «чувствительности» реакции, что, по нашему мнению, связано с адаптацией искусственно вносимой бактериальной культуры на тест - объекте и его структурой, которые, возможно, усложняют адсорбцию бактериофагов на индикаторной культуре. С це-

лью повышения эффективности РНФ мы решили снизить исходную концентрацию изучаемого фагового биопрепарата с 103 БОЕ/мл до 102 БОЕ/ мл. Далее мы поставили реакцию по ранее описанному алгоритму. Результаты отражены в таблице 7.

Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 102 БОЕ/ мл позволило провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в концентрации 103 мк/г почвы.

Результаты постановки РНФ с целью индикации бактерий Pseudomonas syringae фаговым биопрепаратом в пробе речной воды представлены в таблице 8. В исследованиях пробы воды речной были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробе семян огурца. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 103 м.к./мл.

Свободный бактериофаг не обнаружен ни в одном из экспериментов.

Обсуждение

Таким образом, все проведенные исследования и полученные в ходе них данные принципиально не расходятся с данными аналогичных исследований на иных бактериальных агентах [24, 26] и позволяют рекомендовать данный алгоримт в качестве метода индикации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae в пробах почвы, семенном материале и воде. Длительность исследования составляет 23 часа, простота постановки РНФ не требует высокой квалификации исследователя и сложнотехниче-ского оснащения лаборатории.

Заключение

При проведении исследований по разработке параметров практического применения фагового биопрепарата Pseudomonas syringae с целью индикации в пробах воды, почвы и в семенном материале в реакции нарастания титра фага было определено, что культивирование системы: бактериофаг - исследуемый материал при температуре 28 ± 1 0С в течение 3,5 часов позволяет выявить в вышеназванных тест - объектах бактерии Pseudomonas syringae при методом РНФ в концентрации 103 м.к./мл. Увеличение экспозиционного времени не повышает качества реакции. Бактериофаги Ps.s-7 УлГАУ и Ps.s-27 УлГАУ в монокультуре были использованы в экспериментах в концентрации 103 БОЕ/ мл. При тестировании в РНФ полифагового биопрепарата на основе вышеназванных бактериофагов было установлено, что в исследованиях пробы воды речной были получены результаты, сходные с данными эксперимента на пробе семян огурца. Концентрация выявленных бактерий Pseudomonas syringae составила 103 м.к./мл. Экспериментально было установлено, что снижение исходного титра полифагового биопрепарата до концентрации 102 БОЕ/мл позволило провести индикацию бактерий Pseudomonas syringae в пробе почы в концентрации 103 мк/г.

Полученные данные позволят в перспективе использовать реакцию нарастания титра фага в качестве ускоренного и методически простого метода тестирования семенного материала, почвы и воды на наличие фитопатогенного бактериального агента Pseudomonas syringae. В случае положительного результата разработать систему мероприятий по их санации специфичным и экологически чистым фаговым биопрепаратом.

Библиографический список

1. Кругова, Е. Д. Специфические страте-

гии клубеньковых и фитопатогенных бактерий при инфицировании растений / Е. Д. Кругова // Физиология и биохимия культурных растений. -2009. - Т. 41, № 1. - С. 3-15.

2. Буров, В. Н. Использование индукторов иммунитета в защите растений / В. Н. Буров, В. И. Долженко // Защита и карантин растений. - 2008. - № 8. - URL: https://cyberleninka. ru/article/n/ispolzovanie-induktorov-immuniteta-v-zaschite-rasteniy (дата обращения: 25.05.2020).

3. The relationship of host range, physiology, and genotype to virulence on cantaloupe in Pseudomonas syringae from cantaloupe blight epidemics in France / C. E. Morris [and oth.] // Phytopathology. - 2000. - Vol. 90. - P. 636-646.

4. Панычева, Ю. С. Селекция растений сахарной свеклы на устойчивость к бактериозам: проблемы и пути решения / Ю. С. Панычева // Успехи современной науки. - 2017. - Т. 1, № 10. - С. 90-93.

5. Patyka, V. P. Phytopathogenic bacteria in contemporary agriculture / V. P. Patyka // Мтробюлопчний журнал. - 2016. - № 78 (6). - P. 71-83.

6. Котляров, В. В. Изучение бактериальных болезней зерновых колосовых культур и разработка способов защиты посевов от них / В. В. Котляров, А. А. Дьяченко, Ю. П. Федулов // Труды КубГАУ. Краснодар, 2005. Вып. 2. С. 197 206.

7. Шпанев, A. M. Угроза посевам проса /

A. M. Шпанев / Защита и карантин растений. -2003. - № 6. - С. 40.

8. Ареал и зоны вредоносности бактериального ожога гороха (научно-аналитический обзор) / А. М. Лазарев, В. А. Коробов, И. Н. Надточий, Е. Н. Мысник // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. - 2015. - № 15(212). -URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ areal-i-zony-vredonosnosti-bakterialnogo-ozhoga-goroha-nauchno-analiticheskiy-obzor (дата обращения: 25.05.2020).

9. Игнатов, А. Н. Распространение бактериальных и фитоплазменных болезней растений в России / А. Н. Игнатов, М. С. Егорова, М.

B. Ходыкина // Защита и карантин растений. -2015. - № 5. - С. 6-10

10. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ rasprostranenie-bakterialnyh-i-fitoplazmennyh-bolezney-rasteniy-v-rossii (дата обращения: 25.05.2020).

11. Xin, X. F. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen / X. F. Xin, В. Kvitko, S. Y. He // Nature Reviews Microbiology. - 2018. - Vol. 16, № 5. - P. 316.

12. Бактериальные болезни капусты и меры борьбы с ними : методические рекомендации / под редакцией В. А. Павлюшина. -Санкт-Петербург, 2004. - 56 с.

13. Бактериальные болезни подсолнечника / С. Г. Бородин, И. А. Котлярова, Г. А. Терещенко, Н. В. Пашаян // Масличные культуры. - 2012. -№ 1(150). -URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ bakterialnye-bolezni-podsolnechnika (дата обращения: 05.05.2020).

14. Игнатов, А. Н. Распространение возбудителей опасных бактериозов растений в Российской Федерации / А. Н. Игнатов // Защита картофеля. - 2014. - № 2. - С. 53-57.

15. Tomato wall-associated kinase SlWak1 depends on Fls2/Fls3 to promote apoplastic immune responses to Pseudomonas syringae / N. Zhang, M. A. Pombo, H. G. Rosli, G. B. Martin // Plant physiology. - 2020. - Vol. 183, № 4. - P. 18691882.

16. Косова, В. Н. Защита огурца от угловатой и оливковой пятнистостей в условиях Курганской области / В. Н. Косова // Вестник Курганской ГСХА. - 2018. - № 3 (27). - С. 29-35.

17. Red light delays programmed cell death in non-host interaction between Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 and tobacco plants / L. Moyano, M. P. Lopéz-Fernández, A. Carrau [et al.] // Plant Science. - 2020. - Vol. 291. - P. 110361.

18. Krzysztof, К. Kosakoniacowanii as the New Bacterial Pathogen Affecting Soybean (Glycine max Willd.) / К. Krzysztof, B. F. Natasza // European Journal of Plant Pathology. - 2020. - Т. 157, № 1. -С. 173-183.

19. Genome-wide identification and expression analysis of calmodulin and calmodulin-like genes in apple (Malusx domestica) / C. Li, D. Meng, J. Zhang, L. Cheng // Plant Physiology and Biochemistry. - 2019. - Vol. 139. - P. 600-612.

20. Фадеев, И. А. Искусственные лесные насаждения Волгоградской области и их состояние / И. А. Фадеев, С. В. Колмукиди // Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика. - 2015. - Т. 3, № 4-2.

- С. 129-132.

21. Кульбанська, I. М. Еколого-лiсiвничi чин-ники та |'хжй вплив на поширення туберкульозу ясена звичайного в захщному Подiллi Укра'ни / I. М. Кульбанська // Науковий вкник НЛТУ Укра'ни.

- 2015. - № 6. - URL: https://cyberleninka.ru/ article/n/ekologo-lisivnichi-chinniki-ta-yihniy-vpliv-na-poshirennya-tuberkulozu-yasena-zvichaynogo-v-zahidnomu-podilli-ukrayini (дата обращения: 25.05.2020).

22. Выделение и характеристика бактериофагов фитопатогенных бактерий / Н. И. Гири-лович, П. И. Орловская, Т. А. Пилипчук [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. - 2019. - С. 71-81.

23. Экологические особенности фагов фитопатогенных бактерий Pseudomonas на посевах сахарной свеклы / Е. Н. Андрийчук, Л. И. Семчук, С. А. Ромашев, Т. А. Игнатенко // Актуальн про-блеми ботаыки, екологи та бютехнологи (27-30 вересня, 2006 р., м. Ки1'в). - Ки'в : Фггосоцюцентр, 2006. - С. 129.

24. Герасимович, А. Д. Характеристика бактериофагов фитопатогенных бактерий / А. Д. Герасимович, Г. И. Новик, Э. И. Коломиец // Микробные технологии: фундаментальные и прикладные аспекты. - 2012. - Т. 4. - С. 140-153.

25. Садртдинова, Г. Р. Биоиндикация бактерий вида Klebsiella oxytoca в объектах ветери-нарно-санитарного надзора / Г. Р. Садртдинова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии.

- 2017. - № 4(36). -URL: https://cyberleninka.ru/ article/n/bioindikatsiya-bakteriy-vida-klebsiella-oxytoca-v-obektah-veterinarno-sanitarnogo-nadzora (дата обращения: 25.05.2020).

26. Чугунова, Е. О. Применение бактериофагов для детекции бактерий (обзор литературы) / Е. О. Чугунова, Н. А. Татарникова // Пермский аграрный вестник. - 2016. - № 4 (16). - С. 121-126.

27. Пименов, Н. В. Фагоиндикация Staphylococcus aureus в образцах молока / Н. В. Пименов, Е. А. Глазунов, Е. Е. Новикова // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2019. -№ 8. - С. 31-39.

DEVELOPMENT OF PHAGOINDICATION METHOD FOR PSEUDOMONAS SYRINGAE BACTERIA IN SANITARY

CONTROL OBJECTS Feoktistova N.A., Bekkalieva A.K., Vasilyev D.A., Suldina E.V. FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017, Ulyanovsk, Novy Venetz boulevard, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru

Key words: Pseudomonas syringae, indication, phage titer increase reaction, parameters, polyphage biopreparation, soil, river water, cucumber seeds The article presents the results of research on the development of parameters for practical application of phage biopreparation Pseudomonas syringae

in order to indicate the data of phytopathogenic bacteria in sanitary control objects. The introduction of the article describes pathogens of Pseudomonas syringae and plants that they affect, which proves research actuality aimed at developing speed-up methods of indication and identification of bacteria-pathogens, which will allow specialists to develop measures to combat above-mentioned phytopathogens in a short time. It was established that cultivation of the "bacteriophage-test material"system at a temperature of 28 ± 10C during 3.5 hours allows detecting Pseudomonas syringae bacteria in soil samples, river water, and cucumber seeds by the RSF method at a concentration of 103 MK/ml., increase in the exposure time does not improve the quality of the reaction. The bacteriophages Ps. s-7 UlGAU and Ps. s-27 UlGAU in monoculture were used in experiments at a concentration of 103 BFU/ml. When testing a polyphage biological product in RSF, including all the above-mentioned bacteriophages, it was found that the results obtained in the studies of the river water sample were similar to the experimental data on cucumber seed sample. Concentration of detected Pseudomonas syringae bacteria was 103 m.k./ml. It was experimentally established that reducing the initial titer of polyphage biopreparation to a concentration of 102 BFU / ml allowed for the indication of Pseudomonas syringae bacteria in a soil sample at a concentration of 103 mk/g.

Bibliograpy

1. Krugova, E. D. Specific strategies of nodule and phytopathogenic bacteria in plant infection / E. D. Krugova // Physiology and biochemistry of cultivated plants. - 2009. - V 41, № 1. - P. 3-15.

2. Burov, V. N. Use of immune inducers in plant protection / V. N. Burov, V. I. Dolzhenko // Plant protection and quarantine. - 2008. - № 8. - URL: https:// cyberleninka.ru/article/n/ispolzovanie-induktorov-immuniteta-v-zaschite-rasteniy (reference data: 25.05.2020).

3. The relationship of host range, physiology, and genotype to virulence on cantaloupe in Pseudomonas syringae from cantaloupe blight epidemics in France / C. E. Morris [and oth.]//Phytopathology. - 2000. - Vol. 90. - P. 636-646.

4. Panycheva, Yu. S. Selection of sugar beet plants for resistance to bacteriosis: problems and solutions / Yu. S. Panycheva // Progress of modern science. - 2017. - 1, № 10. - P. 90-93.

5. Patyka, V. P. Phytopathogenic bacteria in contemporary agriculture / V. P. Patyka // Microbiological journal. - 2016. - № 78 (6). - P. 71-83.

6. Kotlyarov, V. V. Study of bacterial diseases of grain crops and development of ways to protect crops from them / V. V. Kotlyarov, A. A. Dyachenko, Yu. P. Fedulov //Works of KubSAU. Krasnodar, 2005. Pub. 2. P. 197 206.

7. Shpanev, A. M. The threat millet crops / A. M. Shpanev / Plant protection and quarantine. - 2003. - № 6. - P. 40.

8. Area and zones of harmfulness of bacterial burn of peas (scientific and analytical review)/ A. M. Lazarev, V. A. Korobov, I. N. Nadtochy, E. N. Mysnik // Scientific reports BelSU. Series: Natural sciences. - 2015. - № 15(212). -URL: https://cyberleninka.ru/article/n/areal-i-zony-vredonosnosti-bakterialnogo-ozhoga-goroha-nauchno-analiticheskiy-obzor (Reference data: 25.05.2020).

9. Ignatov, A. N. Spread of bacterial and phytoplasmic plant diseases in Russia / A. N. Ignatov, M. S. Egorova, M. V. Khodykina // Plant protection and quarantine. - 2015. - № 5. - P. 6-10

10. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/rasprostranenie-bakterialnyh-i-fitoplazmennyh-bolezney-rasteniy-v-rossii (reference data: 25.05.2020).

11. Xin, X. F. Pseudomonas syringae: what it takes to be a pathogen /X. F. Xin, B. Kvitko, S. Y. He // Nature Reviews Microbiology. - 2018. - Vol. 16, № 5. - P. 316.

12. Bacterial diseases of cabbage and measures to control them: guidelines / edited by V. A. Pavlyushin. - Saint-Petersburg, 2004. - 56 p.

13. Bacterial diseases of sunflower / S. G. Borodin, I. A. Kotlyarova, G. A. Tereshenko, N. V. Pashayan // Oil cultures. - 2012. - № 1(150). -URL: https:// cyberleninka.ru/article/n/bakterialnye-bolezni-podsolnechnika (reference data: 05.05.2020).

14. Ignatov, A. N. Spread of causative agents of dangerous bacterial diseases of plants in the Russian Federation / A. N. Ignatov // Potato protection. -2014. - № 2. - P. 53-57.

15. Tomato wall-associated kinase SlWak1 depends on Fls2/Fls3 to promote apoplastic immune responses to Pseudomonas syringae / N. Zhang, M. A. Pombo, H. G. Rosli, G. B. Martin // Plant physiology. - 2020. - Vol. 183, № 4. - P. 1869-1882.

16. Kosova, V. N. Protection of cucumber from angular and olive spots in the Kurgan region / V. N. Kosova // Vestnik of Kurgan SAA. - 2018. - № 3 (27). - P. 29-35.

17. Red light delays programmed cell death in non-host interaction between Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 and tobacco plants / L. Moyano, M. P. Lopez-Fernandez, A. Carrau [et al.] // Plant Science. - 2020. - Vol. 291. - P. 110361.

18. Krzysztof, K. Kosakoniacowanii as the New Bacterial Pathogen Affecting Soybean (Glycine max Willd.) /K. Krzysztof, B. F. Natasza // European Journal of Plant Pathology. - 2020. - V. 157, № 1. - P. 173-183.

19. Genome-wide identification and expression analysis of calmodulin and calmodulin-like genes in apple (Malusx domestica) / C. Li, D. Meng, J. Zhang, L. Cheng //Plant Physiology and Biochemistry. - 2019. - Vol. 139. - P. 600-612.

20. Fadeev, I. A. Artificial forest stands of the Volgograd region and their condition / I. A. Fadeev, S. V. Kolmukidy // Current directions of scientific research in the XXI century: theory and practice. - 2015. - V. 3, № 4-2. - P. 129-132.

21. Kulbanska, I. M. Ecological and forestry factors and their influence on the spread of tuberculosis of common ash in the Western Podillya of Ukraine /1. M. Kulbanskaya //Scientific bulletin of NFTU of Ukraine. - 2015. - № 6. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/ekologo-lisivnichi-chinniki-ta-yihniy-vpliv-na-poshirennya-tuberkulozu-yasena-zvichaynogo-v-zahidnomu-podilli-ukrayini (reference data: 25.05.2020).

22. Isolation and characterization of bacteriophages of phytopathogenic bacteria / N. I. Girilovich, P. I. Orlovskaya, T. A. Pilipchuk [et al.] // Microbial biotechnologies: fundamental and applied aspects. - 2019. - P. 71-81.

23. Ecological features of phages of phytopathogenic bacteria Pseudomonas on sugar beet crops / E. N. Andriychuk, L. I. Semchuk, S. A. Romashev, T. A. Ignatenko // Current problems of botany, ecology and biotechnology (27-30 September, 2006, m. Kiev). - Kiev: Phytosoccenter, 2006. - P. 129.

24. Gerasimovich, A. D. Characteristics of bacteriophages of phytopathogenic bacteria / A. D. Gerasimovich, G. I. Novik, E. I. Kolomiets // Microbial technologies: fundamental and applied aspects. - 2012. - V 4. - P. 140-153.

25. Sadrtdinova, G. R. Bioindication of Klebsiella oxytoca bacteria in objects of veterinary and sanitary control / G. R. Satrdinova // Current issues of veterinary biology. - 2017. - № 4(36). -URL: https://cyberleninka.ru/article/n/bioindikatsiya-bakteriy-vida-klebsiella-oxytoca-v-obektah-veterinarno-sanitarnogo-nadzora (reference data: 25.05.2020).

26. Chugunova, E. O. Application of bacteriophages for detection of bacteria (literature review)/ E. O. Chugunova, N. A. Tatarnikova // Perm agrarian vestnik. - 2016. - № 4 (16). - P. 121-126.

27. Pimenov, N. V. Phage indication of Staphylococcus aureus in milk samples / N. V. Pimenov, E. A. Glazunov, E. E. Novikova // Veterinary, zootechnics and biology. - 2019. - № 8. - P. 31-39.