CC BY
37шей доступностью коровьего ЛФ представляются более перспективными,
особенно при лечении антибиотикорезистентных форм бактериальной и
кандида-инфекций.
Л ИТЕРАТУРА
1. Зорина В.Н., Зорин Н.А. Белковые компоненты врожденного иммунитета в защите от патогенной инвазии. Журн. микробиол. 2013, 3: 111-117.
2. Acosta-Zaldívar M., Andrés M.T., Rego A. et al. Human lactoferrin triggers a mitochondrial-and caspase-dependent regulated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Apoptosis. 2016, 21(2): 163-173. doi: 10.1007/s10495-015-1199-9.
3. Chen P.W., Jheng T.T., Shyu C.L., Mao F.C. Synergistic antibacterial efficacies ofthe combination of bovine lactoferrin or its hydrolysate with probiotic secretion in curbing the growth of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol. 2013, 62 (Pt 12): 1845-1851. doi: 10.1099/jmm.0.052639-0.
4. El-Fakharany E.M., Sánchez L., Al-Mehdar H.A., Redwan E.M. Effectiveness of human, camel, bovine and sheep lactoferrin on the hepatitis C virus cellular infectivity: comparison study. Virol. J. 2013, 10: 199. doi: 10.1186/1743-422X-10-199.
5. Giansanti F., Panella G., Leboffe L., Antonini G. Lactoferrin from milk: Nutraceutical and pharmacological properties. Pharmaceuticals (Basel). 2016, 9 (4). pii: E61.
6. Schryvers A.B., Gonzalez G.C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infect. Immun. 1989, 57 (8): 24252429.
7. Sharma S., Sinha M., Kaushik S. et al. C-lobe of lactoferrin: the whole story of the half-molecule. Biochem Res. Int. 2013; 2013: 271641. doi: 10.1155/2013/271641.
8. Siqueiros-Cendón T., Arévalo-Gallegos S., Iglesias-Figueroa B.F. et al. Immunomodulatory effects of lactoferrin. Acta Pharmacol Sin. 2014, 35 (5): 557-566. doi: 10.1038/aps.2013.200.
9. van der Does A.M., Bogaards S.J., Jonk L. et al. The human lactoferrin-derived peptide hLF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response. Biometals. 2010, 23 (3): 493-505. doi: 10.1007/s10534-010-9322-4.
Поступила 15.10.17
Контактная информация: Зорина Вероника Николаевна, д.б.н.,
654007, Новокузнецк, пр. Строителей, 5, р.т. (3843)45-84-18
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Е.В.Отрашевская1, В.Н.Винокурова1, Е.А.Шитиков2, Е.А.Сотникова2, Т.А.Перевышина1, С.А.Колченко2, Т.Б.Бутусова2, Е.С.Кострюкова2, Е.Н.Ильина2, Г.М.Игнатьев1'3
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СУБ-ШТАММА M. BOVIS BCG-1 (RUSSIA) В ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ БЦЖ
1НПО «Микроген», Москва; 2Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины, Москва; 3Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов
Цель. Изучение структуры генома и анализ стабильности генетических свойств субштамма M. bovis BCG-1 (Russia), применяемого для производства вакцин. Материалы и методы. Было проведено полногеномное секвенирование и последующий сравнительный анализ образцов суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) от рабочего банка до конечного пассажа производственного культивирования, а также производственных серий. Молекулярно-биологическими методами был проведен анализ числа тандемных повторов (VNTR) по 24 локусам и сполиготипирование. Результаты. Последовательность субштамма M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего посевного банка была полностью собрана, аннотирована и депонирована в базу GenBank. Анализ DU2- и RD-регионов подтвердил принадлежность суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) к группе DU2-I, BCG Russia.
Полногеномное выравнивание образцов суб-штамма производственных серий вакцины на геном M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего банка не выявило структурных отличий. Сполиготипирование и VNTR-профиль также продемонстрировали идентичность структур. Заключение. Результатом проведенного исследования явилось как подтверждение подлинности производственного суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia), так и демонстрация его генетической стабильности в процессе производства вакцины БЦЖ и БЦЖ-М. Стабильность генома суб-штамма опосредованно подтверждает стабильность производственных условий культивирования и качество производственного процесса.
Журн. микробиол., 2018, № 2, С. 58—67
Ключевые слова: M. bovis BCG-1 (Russia) суб-штамм, подлинность, стабильность генома
E.V.Otrashevskaya1, V.N.Vinokurova1, Е.А.Shitikov2, Е.А.Sotnikova2, T.А.Perevyshina1, S.А.Kolchenko2, T.B.Butusova2, Е.S.Коstryukova2, Е.N.Шna2, G.М.Ignatev1•3
M. BOVIS BCG-1 (RUSSIA) SUB-STRAIN GENOME STABILITY INVESTIGATION WITHIN THE ENTIRE PRODUCTION PROCESS
Scientific and Production Association for Immunobiological Preparations «Microgen», Moscow; 2 Federal Scientific and Clinical Centre of Phusical-Chemical Medicine, Moscow; 3St. Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera and the Bacterial Preparations Factory, Russia
Aim. The aim of the current study was to analyze the genome structure of the M. bovis BCG-1 (Russia) sub-strain, used for the vaccine production, as well as its genome stability within the entire production process. Materials and methods. Whole genome sequencing and M. bovis BCG-1 (Russia) working seed lot and for the last production passage of the sub-strain cultivation from a number of the vaccine batches. Additionally, VNTR sequences of 24 locus analyses, RD patterns comparison, as well as spoligotyping were performed. Results. The whole genome sequence of the M. bovis BCG-1 (Russia) working seed lot was assembled, annotated and deposited to GenBank. On the basis of DU2- and RD-regions analyzes M. bovis BCG-1 (Russia) sub-strain was confirmed to be belonged to BCG Russia strains of DU2-I group. Whole genome sequencing followed by comparative analysis of RD patterns and SNPs confirmed the stability of the vaccine sub-strain genome from the working seed lot to a number of the vaccine batches obtained within the two-years period. VNTR profile and spoligopattern exactly matched the M. bovis BCG-1 (Russia). Conclusion. Thus the M. bovis BCG-1 (Russia) sub-strain genome identity and stability have been studied and demonstrated. The obtained result confirmed the vaccine production process consistency.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 2, P. 58—67
Key words: M. bovis BCG-1 (Russia) sub-strain, identity, genome stability
ВВЕДЕНИ Е
Вакцина БЦЖ (бациллы Кальметта-Герена) существует на протяжении почти 100 лет и является одной из наиболее используемых в настоящее время вакцин, охватывая более 90% новорожденных и детей грудного возраста в странах, где она является компонентом национальной программы иммунизации детей [23]. Все существующие вакцинные суб-штаммы имеют происхождение от первоначального изолята М. bovis, который Кальметт и Герен пассировали в течение 13 лет. В результате последующих пассажей штамма в различных условиях были получены разнообразные вакцинные суб-штаммы
BCG с фенотипическими и генотипическими различиями [23]. В плане эффективности ни один суб-штамм BCG не обладает явными преимуществами перед другими [22]. ВОЗ признала необходимость молекулярно-генетической характеристики всех вакцинных суб-штаммов М. bovis BCG в связи с их разнообразием [9, 24]. На данном этапе разработаны и полностью охарактеризованы четыре референсных штамма М. bovis BCG: Dannish 1331, Tokyo 172-1, Russian BCG-1 и Moreau RDJ [15, 22, 24].
Согласно Европейской Фармакопее VIII и Фармакопее РФ XIII подтверждение подлинности производственного суб-штамма М. bovis BCG должно проводиться не только традиционными методами, но и молекулярно-биологическими, в качестве дополнительных. На данном этапе ВОЗ предлагает использовать для подтверждения подлинности производственного субштамма М. bovis BCG мультиплексную ПЦР, которая позволяет анализировать шесть регионов генома [15, 22, 23]. Однако так как данный метод не позволяет выявлять возможные мутации в иных регионах генома, ВОЗ также рекомендует более тщательное изучение генетической стабильности производственных суб-штаммов М. bovis BCG иными молекулярно-биологическими методами [9]. Во избежание возникновения фенотипических изменений субштаммов М. bovis BCG ВОЗ также рекомендует всем производителям ограничить количество пассажей между главным и рабочим посевными банками и мониторировать генетическую стабильность суб-штамма в процессе производства от главного банка и до конечного продукта [24].
Целью настоящего исследования явилось изучение структуры генома и анализ стабильности генетических свойств M. bovis суб-штамм BCG-1 (Russia), применяемого для производства вакцин БЦЖ и БЦЖ-М НПО «Микроген». Для достижения поставленной цели было проведено полногеномное секвенирование и сравнительный геномный анализ образцов субштамма от рабочего посевного банка до конечного пассажа производственного культивирования, а также десяти последовательных производственных серий вакцины БЦЖ/БЦЖ-М.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В 2014 году были исследованы образцы суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего посевного банка и образцы последнего пассажа производственного культивирования одной производственной серии вакцины БЦЖ (филиал «Аллерген», Ставрополь). Рабочий посевной банк был наработан из вакцинного штамма M. bovis суб-штамм BCG-1 (Russia), полученного от НЦ ЭСМП (№ 70001, посевная серия 368 «щ», 2006 г.). Последним пассажем производственного культивирования суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) в соответствии с производственным регламентом являлся шестой пассаж.
В 2015 году для исследования были взяты образцы последнего шестого пассажа производственного культивирования суб-штамма BCG-1 (Russia) десяти последовательных производственных серий вакцины БЦЖ и БЦЖ-М (НПО «Микроген»). Данные серии вакцин были наработаны из исследованного в 2014 году рабочего посевного банка.
Сбор материала для исследования проводился путем отделения микробной массы от культуральной среды на фильтровальной бумаге, отмывания культуры 0,9% раствором натрия хлорида и дальнейшим сбором микробной массы в микроцентрифужные пробирки микробиологическими петлями. Собранный материал хранился при температуре < +4°С.
Выделение тотальной геномной ДНК из всех образцов производственной культуры M. bovis BCG-1 (Russia) было осуществлено с использованием набора «ПРОБА-НК» («ДНК-Технология», Москва) согласно инструкции производителя.
Определение полногеномной последовательности суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) из образцов рабочего посевного банка, а также образцов M. bovis BCG-1 (Russia) последнего пассажа одного производственного цикла 2014 г. было проведено методом секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенатора GS FLX + (Roche, США). Фрагментные библиотеки были получены в соответствии с протоколом производителя (Rapid Library Preparation Method Manual GS FLX+ Series — XL+, Roche, США) с использованием коммерческого набора GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit (Roche, США). Дополнительно для образцов было проведено секвенирование с использованием прибора Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Для этого были получены две библиотеки парных фрагментов (с размером библиотеки 2000—3000 п.о. и 5000—6000 п.о.) с помощью коммерческого набора 5500 SOLiD Mate-Paired Library Construction Kit (Life Technologies, США) в соответствии с протоколом Ion Mate-Paired Library Preparation (Life Technologies Demonstrated Protocol). Для сборки геномов de novo использовалась программа GS De Novo assembler version 2.9. Объединение полученных контигов в скаффолды осуществлялось с помощью программы SSPASE [5].
Полногеномную последовательность суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) из образцов десяти последовательных производственных серий вакцины БЦЖ/БЦЖ-М 2015 г. определяли с использованием секвенатора ionTorrent PGM (Life Technologies). Фрагментные библиотеки были получены с использованием коммерческого набора Ion Xpress™ Plus gDNA Fragment Library Preparation (Life Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Каждый из геномов был секвенирован в среднем с 14-кратным покрытием.
Для сравнительного анализа были использованы данные полногеномного секвенирования двух суб-штаммов BCG Russia, GenBank №ERR766224 [1] и BCG Russia, GenBank №SRR398629 [17]. Дополнительно были использованы геномные последовательности M. bovis BCG Tokyo 172, GenBank№ AP010918.1, и M. bovis BCG Moreau RDJ, GenBank №AM412059.2, относящиеся к группе DU2-1, а также M. bovis BCG Pasteur 1173P2, GenBank №AM408590.1, M. bovis AF2122/97, GenBank №NC_002945.4 и M. tuberculosis H37Rv, GenBank №NC_000962.3.
Картирование чтений с прибора на геномы M. bovis BCG Pasteur и M. tuberculosis H37Rv осуществлялось с помощью инструмента bowtie2 [11]. Анализ данных выравнивания проводился в приложении samtools 0.1.19 [13]. Поиск однонуклеотидных полиморфизмов осуществлялся с помощью программы VarScan v 2.3.1 [10]. Выравнивание и поиск замен в образцах, представленных полногеномными последовательностями, осуществлялся с помощью программного пакета MUMMER 3 [8].
Для анализа делетированных последовательностей, так называемых регионов различия (Region of Difference; RD), проводилось сравнение покрытия анализируемого региона с покрытием фланкирующих участков. В соответствии с ранее опубликованным исследованием [2] был проведен сравнительный анализ основных RD-регионов, отличающихся как между представителями первой (DU2-I) группы, так и от штамма M. bovis BCG Pasteur. Дополнительно
были определены размеры отдельных RD-регионов согласно проведенному ранее исследованию [3].
Результаты сборки de novo с применением программы GS De Novo assembler version 2.9 использовались для определения количества и локализации повторяющегося элемента IS6110.
Анализ числа тандемных повторов в различных локусах генома (Variable Number of Tandem Repeats; VNTR) для суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») проводился по 24 локусам с использованием праймеров, описанных ранее [21]. Сполиготипирование исследуемых образцов производственного суб-штамма проводилось, как описано ранее [4]. Для геномов суб-штамма BCG Russia (GenBank №ERR766224 и №SRR398629), представленных в виде чтений с прибора, сполиготип определялся с использованием программы SpolPred [7].
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
1. Подтверждение подлинности вакцинного суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген). В ходе исследования было проведено полногеномное секвенирование суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») из образцов рабочего посевного банка. Суммарное количество контигов при сборке чтений фрагментной библиотеки составило 81, покрытие — 54. На следующем этапе обработки данных было проведено объединение контигов в скаффолды с использованием чтений с библиотек парных фрагментов. В результате проведенной работы для генома M. bovis BCG-1 (Russia) было получено 8 скаффолдов. Дальнейшее «закрытие» генома производственного суб-штамма было осуществлено с использованием секвенирования по Сэн-геру. Полногеномная последовательность суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») депонирована в базу GenBank под номером №CP013741.1.
1.1 Анализ структуры генома суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген»). Для M. bovis BCG-1 (Russia), так же как и для M. bovis BCG Tokyo 172 и BCG Moreau RDJ, была проанализирована дупликация DU2, которая лежит в основе классификации вакцинных штаммов BCG [6]. В геноме M. bovis BCG-1 (Russia) дуплицированный участок имеет протяженность 20704 п.н. и включает 20 генов (Rv3299c-Rv3317, аннотация по M. tuberculosis H37Rv). Такие границы также характерны для ранних штаммов BCG Tokyo 172 и BCG
Таблица 1. Сравнение RD-регионов суб-штамма M. bovis BCG-1 Russia (НПО «Микроген») и других субштаммов группы DU2-I относительно штамма BCG Pasteur 1173P2
Регион отличия Коорд. по H37Rv Суб-штаммы M. bovis
BCG-1 (Russia) (рабочий банк НПО «Микроген») BCG Russia (ERR766224) BCG Russia (SRR398629) Moreau RDJ Tokyo 172 Pasteur 1173P2
RD2 2221057-2231845 + + + + + —
RD14 1998225-2007297 + + + + + —
nRD18 1332920-1334466 + + + + + —
PhoP ins IS6110 852067-852068 + + + + + —
RD Japan 3825027-3825048 + + + + — +
RD16 3817365-3824973 + + + — + +
AfadD26-ppsA 3244503-3245478 — — — + — —
RD Moreau 4370517-4371645 — — — + — —
(ARv3887c)
RD Russia 4140085-4141688 — — — + + +
62
Moreau RDJ, образующих вместе с BCG Russia группу DU2-I. При этом в геноме BCG Russia и BCG Tokyo 172 дупликация DU2 состоит из трех копий, а в геноме Moreau RDJ из двух. В свою очередь, DU2 BCG Pasteur имеет длину 36163 п.н., относится к группе DU2-IV и образуется в результате дупликации более протяженного фрагмента, чем в случае DU2-I и двух последующих делеций [6].
Результаты исследования основных RD-регио-
Таблица 2. Сравнительный анализ размеров RD-регионов субштамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») относительно других суб-штаммов группы DU2-I
Регион отличия* (п.о.)
Суб-штамм M. bovis RD1 RD2 RD8 RD14 RD16 senX3-regX3
BCG-1 (Russia) (рабочий банк НПО «Микроген») BCG Russia (GenBank №ERR766224) BCG Russia (GenBank №SRR398629) BCG Tokyo 172 BCG Moreau RDJ
193
193
193
193 193
315
315
315
315 315
472
472
472
472 472
252
252
252
252 252
401
401
401
379
276
276
276
353 276
Примечание. *Как описано ранее [2].
нов суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia), а также сравнительный анализ их наличия/отсутствия в суб-штаммах M. bovis BCG первой (DU2-I) группы представлены в табл. 1. Полученные в результате проведенных исследований данные суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia) совпали с ранее опубликованными данными для M. bovis BCG Russia [2, 12].
Результаты определения размеров отдельных RD-регионов представлены в табл. 2. Как видно из табл., суб-штамм M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген»), как и другие представители BCG Russia, может быть дифференцирован от суб-штаммов M. bovis BCG Tokyo 172 и M. bovis BCG Moreau RDJ по локусам RD16 и senX3-regX3.
Полученные результаты подтверждают принадлежность суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») к группе DU2-I, в целом, и к подгруппе M. bovis BCG Russia, в частности, и позволяют проводить дифференцирование суб-штаммов M. bovis BCG Russia, в целом, внутри группы DU2-I с достаточной степенью точности.
1.2 Анализ количества тандемных повторов (VNTR) в различных локусах генома M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») и сполиготипирование. В ходе исследования была установлена структура DR (direct repeat, прямые повторы) региона для исследуемого суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia). Сполигопаттерн штаммов содержал спейсеры 1, 2, 4—8, 10 — 15, 17 — 31, 25 и 32 — 38 (SIT 482 по международной базе данных SITVIT WEB) (http://www.pasteur-guadeloupe. fr:8081/SITVIT_0NLINE). Между 24 и 25 спейсерами была расположена последовательность IS6110 элемента.
Для определения VNTR-профиля M. bovis BCG-1 (Russia) в дополнение к результатам полногеномного секвенирования была использована 24-локусная система типирования M. tuberculosis. Результаты исследования суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia), а также сравнительный анализ с другими образцами M. bovis BCG представлены в табл. 3. Как видно из табл. 3, локус 2461 субштамма M. bovis BCG-1 (Russia) и суб-штамма M. bovis BCG Tokyo 172 содержат по 5 копий повтора, тогда как у суб-штамма M. bovis BCG Moreau RDJ — 3 копии. В свою очередь, локус 4052 штаммов M. bovis BCG Russia и M. bovis BCG Moreau RDJ содержит 5 копий повтора, в отличие от штамма M. bovis BCG Tokyo 172, содержащего 4 копии повтора, что согласуется с ранее опубликованными данными [18]. По локусу VNTR 580 суб-штаммы M. bovis
BCG-1 (Russia) и M. bovis BCG Moreau RDJ содержат равное количество копий повтора (два), что отличает их от суб-штамма M. bovis BCG Tokyo 172, содержавшего 3 копии. Полученные по локусу VNTR 580 результаты согласуются с ранее опубликованными данными [14]. Полученный VNTR профиль M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») подтверждает принадлежность суб-штамма к группе DU2-I.
1.3 Анализ однонуклеотидных полиморфизмов M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген»). В ходе сравнительного анализа производственного суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) и других представителей группы DU2-I относительно генома M. bovis BCG Pasteur1173Р2 было обнаружено 23 полиморфизма, которые также характерны для других суб-штаммов M. bovis BCG Russia (GenBank№ERR766224 и №SRR398629). Из них 4 SNPs находились в межгенных областях генома: C204726T, C207243T, G1165130A и C2645769T. Из мутаций, найденных в кодирующей области генома M. bovis BCG Russia, всего одна была синонимичной, а 18 приводили к несинонимичным заменам. При этом два полиморфизма относились к нонсенс-мутациям и вели к образованию стоп-кодона — BCG_0237 (S123*) и BCG_0908 (Q64*). Результаты проведенного сравнительного исследования подтверждают принадлежность суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) к группе M. bovis BCG Russia.
При сравнительном анализе суб-штаммов M. bovis BCG Russia в каждом были найдены штаммо-специфические полиморфизмы. Для суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») была обнаружена синонимичная замена в гене glnD. Для суб-штамма M. bovis BCG Russia (GenBank №SRR398629) была идентифицирована синонимичная замена в гене Rv0383c, а для суб-штамма M. bovis BCG Russia (GenBank № ERR766224) мутации были обнаружены в гене phoR двухкомпонентной системы PhoP-PhoR и в гене PE_PGRS27.
2. Подтверждение стабильности субштамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») в процессе производственного культивирования. Для исследования стабильности генома M. bovis BCG-1 (Russia) было проведено полногеномное секвенирование образцов субштамма последнего пассажа производствен-
2 U D
б суб
О П
G C B
s
I
b
о р
п
i н
ав р
С
а ц
и л б а Т
Су
О О О О
m mm
C-n C-n C-n C-n
mm m
m m m m
CI CI CI CI
vol m m m
О О О О
C-n C-n C-n C-n
CI CI CI CI
m m m m
tT TT TT TT
CI CI CI CI
o\ o\ o\ o\
P
P
7o 17 Mo
Ч «з * «
Ü So t? о Д
U^ U-^ UQ
n
и Ю О g
о К
а ft
о §
о
и
=
О
х
а
и ft С
wo ^ М ^ О. PQ Е-5 fflPi мЗ
ной серии вакцины БЦЖ 2014 г. по схеме, аналогичной для образцов рабочего посевного банка M. bovis BCG-1 (Russia) (Материалы и методы). Суммарно геном M. bovis BCG-1 (Russia) был прочитан со 115-кратным покрытием. В ходе обработки данных было получено 6 скаффолдов. Полногеномное выравнивание исследуемых образцов последнего производственного пассажа на геном суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего банка не выявило структурных изменений как на уровне RD-регионов, так и на уровне однонуклеотидных полиморфизмов. Результаты сравнительного анализа DR региона (сполиготипирвание) и VNTR профиля суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) на разном уровне производственного культивирования также продемонстрировали идентичность суб-штамму M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего посевного банка, депонированному ранее в базу данных NCBI (GenBank №СЗ013741.1). Таким образом, в ходе сравнительного анализа было определено полное совпадение геномов производственного суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») от рабочего банка до последнего пассажа производственного культивирования (до этапа лиофилизации).
Полногеномное выравнивание образцов производственного суб-штамма десяти последовательных производственных серий вакцины БЦЖ и БЦЖ-М (НПО «Микроген») 2015 г. на геном M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего банка также не выявило структурных изменений как на уровне RD-регионов, так и на уровне однонуклеотидных полиморфизмов. Сполиготипирование и VNTR-профиль суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) десяти производственных серий 2015 г. также продемонстрировали идентичность относительно друг друга и относительно суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего посевного банка. Результаты сравнительного анализа полногеномных последовательностей образцов десяти производственных серий суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) депонированы в базу GenBank под номером №PRJNA3862621.
ОБСУЖДЕНИ Е
В настоящее время все большее значение в паспортизации вакцинных штаммов вирусов и бактерий и соответственно в аттестации производственных банков вакцинных штаммов придается молекулярно-биологическим методам. Наибольшее развитие среди них получили амплификационные технологии, позволяющие достаточно быстро провести идентификацию (подтверждение подлинности) исследуемого штамма. При этом стоит отметить, что данные методы позволяют анализировать лишь небольшую часть генома. Полногеномное секвенирование дает исчерпывающую информацию о последовательности и структуре всего генома исследуемого штамма и может быть использовано как для подтверждения подлинности, так и для оценки стабильности исследуемого штамма.
Для подтверждения подлинности вакцинного суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») методами сравнительной геномики был проведен анализ геномной организации штамма, а также однонуклеотидных полиморфизмов относительно представителей группы DU2-I, а также рефе-ренсных геномов M. bovis BCG Pasteur и M. tuberculosis H37Rv. Исходя из анализа DU2- и RD-регионов было подтверждено, что суб-штамм М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») относится к «ранним» вакцинным субштаммам группы DU2-I, M.bovis BCG Russia. Суб-штамм M.bovis BCG-1 (Russia) имел, как и другие представители M. bovis BCG Russia [2, 17], включая M. bovis BCG Sofia SL222 [20], характерную делецию RDRussia. Данная деле-ция, впервые описанная Mostowy S. et al. [16], имеет протяженность 1603 п.н.
и затрагивает гены Rv3697c, Rv3697A, Rv3698 (согласно аннотации M. tuberculosis H37Rv).
Для более детального анализа суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») были дополнительно определены размеры шести отдельных локусов, как было опубликовано ранее [3]. Данный подход также позволяет дифференцировать суб-штаммы внутри группы DU2-I и удовлетворяет критериям точности, надежности и воспроизводимости, рекомендованным ВОЗ.
В результате проведенного исследования были получены данные, полностью согласующиеся с ранее опубликованными [2, 3, 15, 17, 20], что подтверждает принадлежность суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») к группе DU2-I, в целом, и к подгруппе M. bovis BCG Russia, в частности.
Для оценки возможных микроэволюционных изменений суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») был проведен поиск однонуклео-тидных полиморфизмов как в самом образце, так и в других представителях группы M. bovis BCG Russia (GenBank №ERR766224, №SRR398629) относительно штамма M. bovis BCG Pasteur. Большинство полиморфизмов (N=23), общих для проанализированных в данном исследовании штаммов M. bovis BCG Russia, было найдено и в исследованных образцах суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia). При этом была выявлена всего одна синонимичная мутация в гене glnD, отличающая М. bovis BCG-1 (Russia) от других представителей M. bovis BCG Russia [2, 17].
Генетическая стабильность суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia) была изучена на разных уровнях в соответствии с рекомендациями ВОЗ [9, 23]. Рекомендуемое ВОЗ сравнительное исследование VNTR-профилей и RD-регионов, а также элемента IS6110 [9] выявило полную идентичность всех производственных образцов суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia). Сравнительный анализ однонуклеотидных полиморфизмов также не выявил различий. При этом специфическая для М. bovis BCG-1 (Russia) (НПО «Микроген») мутация в гене glnD сохранялась на всех пассажах культивирования суб-штамма в течение всего двухлетнего периода мониторирования стабильности генома. Таким образом, в результате проведенного исследования продемонстрирована генетическая стабильность суб-штамма M .bovis BCG-1 (Russia) в процессе одного производственного цикла, а также в процессе производства десяти последовательных серий вакцины БЦЖ и БЦЖ-М. Стабильность генома вакцинного суб-штамма опосредованно подтверждает стабильность производственных условий культивирования и качество производственного процесса.
Результаты исследования генетической стабильности генома вакцинного суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) как ранее опубликованные [1, 19], так и представленные в данном исследовании позволяют вносить в паспорта посевных серий суб-штамма информацию о генетических маркерах, что позволит производителям вакцины БЦЖ и БЦЖ-М осуществлять контроль подлинности, а также мониторировать стабильность генома вакцинного суб-штамма M.bovis BCG-1 (Russia) молекулярно-биологическими методами.
Л ИТЕРАТУРА
1. Леви Д.Т., Обухов Ю.И., Александрова Н.В., Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Альварес Фигероа М.В., Прокопенко А.В., Луданный Р.И.Оценка подлинности и стабильности вакцины БЦЖ методом мультиплексной ПЦР. Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2016, 16 (1): 49-53.
2. Abdallah A.M., Hill-Cawthorne G.A., Otto T.D. et al. Genomic expression catalogue of a global collection of BCG vaccine strains show evidence for highly diverged metabolic and cellwall adaptations. Sci. Rep. 2015, 5: 15443 (online).
3. Bedwell J., Kairo S.K., Behr M.A., Bygraves J.A. Identification of substrains of BCG vaccine using multiplex PCR. Vaccine. 2001, 19: 2146-2151.
4. Bespyatykh J.A., Zimenkov D.V., Shitikov E.A. et al. Spoligotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates using hydrogel oligonucleotide microarrays. Infection, Genetics, Evolution, 2014, doi:http://dx.doi.org/l0.1016/j.meegid.2014.04.024.
5. Boetzer M., Henkel C.V., Jansen H.J. et al. Scaffolding pre-assembled contigs using SSPACE. Bioinformatics. 2001, 4: 578-579.
6. Brosch R., Gordon S.V., Garnier T. et al. Genome plasticity of BCG and impact on vaccine efficacy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2007, 13: 5596-5601.
7. Coll F., Mallard K., Preston M.D. et al. SpolPred: rapid and accurate prediction of Mycobacterium tuberculosis spoligotypes from short genomic sequences. Bioinformatics. 2012, 22: 29912993.
8. Delcher A.L., Phillippy A., Carlton J., Salzberg S.L. Fast algorithms for large-scale genome alignment and comparison. Nucleic Acids Res. 2002, 11: 2478-2483.
9. Knezevic I., Corbel M.J. WHO discussion on the improvement of the quality control of BCG vaccines. Pasteur Institute, Paris, France, 7 June 2005. Vaccine, 2006, 24: 3874-3877.
10. Koboldt D.C., Zhang Q., Larson D.E. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 2012, 3: 568-576.
11. Langmead B., Salzberg S.L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 2012, 4: 357-359.
12. Leung A.S., Tran V., Wu Z. et al. Novel genome polymorphisms in BCG vaccine strains and impact on efficacy. BMC Genomics. 2008, 9: 413.
13. Li H., Handsaker B., Wysoker A. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 2009, 16: 2078-2079.
14. Magdalena J., Supply P., Locht C. Specific differentiation between Mycobacterium bovis BCG and virulent strains of the Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol. 1998, 9: 2471-2476.
15. Markey K., Ho M.M., Choudhury B. et al. Report of an international collaborative study to evaluate the suitability of multiplex PCR as an identity assay for different sub-strains of BCG vaccine. Vaccine. 2010, 28: 6964-6969.
16. Mostowy S., Tsolaki A.G., Small P.M. et al. The in vitro evolution of BCG vaccines. Vaccine. 2003, 21: 4270-4274.
17. Pan Y, Yang X., Duan J. et al. Whole-Genome sequences of four Mycobacterium bovis BCG vaccine strains. J. Bacteriol. 2011, 12: 3152-3153.
18. Pym A.S., Brosch R. Tools for the population genomics of the tubercle bacilli. Genome Res. 2000,12: 1837-1839.
19. Sotnikova E.A., Shitikov E.A., Malakhova M.V. et al. Complete genome sequence of Mycobacterium bovis strain BCG-1 (Russia). Genome Announcements. 2016, 4: 1-2.
20. Stefanova T. Quality control and safety assessment of BCG vaccines in the post-genomic era. Biotechnology Biotechnological Equipment. 2014, 28: 387-391.
21. Supply Р., Allix C., Lesjean S. et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat typing of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2006, 12: 4498-4510.
22. WHO. Informal Consultation on Standardization and Evaluation of BCG Vaccines, 22-23 September 2009, WHO, Geneva, Switzerland. p.1-25
23. WHO. Information Sheet observed rate of vaccine reactions Bacille Calmette —Guérin (BCG) vaccine. Global Vaccine Safety, Immunization, Vaccines and Biologicals. Geneva. April 2012. p. 1-5.
24. WHO. Report WHO Consultation on the characterisation of BCG vaccines. Geneva, Switzerland, 8-9 December, 2004. p. 1-8.
Поступила 30.10.17
Контактная информация: Отрашевская Елена Викторовна,
115088, Москва, 1-я Дубровская ул., 15, р.т. (495)790-77-73
