CC BY
14© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
В.Н.Зорина, О.Н.Воробьева, Н.А.Зорин
АКТИВНОСТЬ ЛАКТОФЕРРИНА РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ОТНОШЕНИИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОККОВ И CANDIDA ALBICANS
Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей — филиал Российской медицинской академии непрерывного профессионального образования
Цель. Изучение влияния лактоферрина (ЛФ) коровы и человека на штаммы Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus, Candida albicans. Материалы и методы. Суточные агаровые культуры музейных и клинических штаммов микроорганизмов стандартизировали, разводили физиологическим раствором до 5000 микробных клеток/мл, вносили по 0.1 мл в ступенчатое разведение ЛФ (от 1000 мкг/мл), инкубировали 18 — 24 часов при 37°С. Количество ЛФ в образце с полной видимой задержкой роста микробов являлось минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) для штамма. Результаты. МИК ЛФ человека была в 4 — 8 раз меньше, чем ЛФ коровы. Самые малые дозы требовались для подавления C. аШ^гш (11,3+1,5 и 43,8+9,5 мкг/мл соответственно), самые большие при использовании человеческого ЛФ необходимы для подавления S. аureus (38,2+4,6), а коровьего — E. faecalis (206,3+51,1). Заключение. ЛФ человека значительно эффективнее в подавлении бактериальной инфекции, однако в процессе эволюции наблюдается рост резистентности штаммов S^ureus к ЛФ. Учитывая большую доступность коровьего ЛФ и отсутствие тенденции к повышению резистентности, целесообразно использовать коровий ЛФ в высоких дозах при лечении инфекций, вызванных резистентными формами бактерий и C. albicans.
Журн. микробиол., 2018, № 2, С. 54—58
Ключевые слова: лактоферрин, Staphylococcus аureus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, лекарственная устойчивость, минимальная ингибирующая концентрация
V.N.Zorina, O.N.Vorobeva, N.A.Zorin
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF THE HUMAN AND BOVINE LACTOFERRIN AGAINST GRAM-POSITIVE BACTERIA AND CANDIDA ALBICANS
Novokuznetsk State Institute for Further Training of Physicians — Branch of the Russian Medical Academy of Continuous Professional Education, Russia
Aim. A comparative study of the effect ofbovine and human lactoferrin (LF) on Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Candida albicans strains. Materials and methods. The daily agar cultures of museum and clinical strains of microorganisms were standardized, diluted with physiological solution up (from 5000 microbial cells/ ml to 0.1 ml) was added to the stepwise dilution of LF (from 1000 ^g /ml) and incubated 18 — 24 hours at 37°C. The amount of LF in the sample with the total apparent growth retardation of the microbes was the minimum inhibitory concentration (MIC) for the strain. Results. The MIC of human LF was 4 — 8 times less than MIC of bovine LF. The smallest dose was required for the suppression of C. albicans (11.3+1.5 and 43.8+9.5 ^g/ml respectively), the largest when using human LF was needed to suppress S. aureus (38,2+4,6), and in a case of bovine LF — E. faecalis (206,3+51,1). Conclusion. Human LF is much more effective in suppressing bacterial infection, but in the course of evolution, there is an increase in the resistance of S. aureus to LF. The higher availability of bovine LF and the lack of a tendency to increase resistance, it is advisable to use high-doses of bovine LF in the treatment of resistant forms of bacteria and C. albicans.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 2, P. 54—58
Key words: lactoferrin, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Enterococcus faecalis, drug resistance, minimal inhibitory concentration
ВВЕДЕНИ Е
Лактоферрин (ЛФ) является важнейшим компонентом мукозального иммунитета, осуществляющим эффективную первичную защиту от патогенной инвазии, а также обладающим выраженной иммуномодулирующей активностью [1]. Данный полифункциональный гликопротеин обнаружен у большинства млекопитающих, имеет сопоставимую структуру у человека и животных (80 кДа, 711 аминокислотных остатков у человека и из 689 у коровы) [5, 8]. Наибольшие концентрации ЛФ присутствуют в молозиве и молоке, меньшие — в слезной жидкости, слюне, семинальной плазме, крови и моче, в секретах — вагинальных, бронхов, желудочно-кишечного тракта [5, 8]. Синтезируется ЛФ эпителиальными клетками, а также нейтрофилами, причем в экзокринных секретах и генитальном тракте его синтез постоянен, а в ней-трофилах он синтезируется при клеточной дифференциации, депонируется в гранулах и высвобождается лишь при активации клеток [1, 5]. Молекула белка пластична, состоит из N- и C-субъединиц, гомологичных по строению на 33 — 41% [5], но различающиеся по функциональной активности [7]. Различают нативную (апо-) и связанную с молекулами металлов (железо, медь, цинк, магний) холо-форму белка [5]. Антимикробная активность ЛФ реализуется сразу несколькими путями — он способен секвестрировать железо и дестабилизировать мембраны микроорганизмов, препятствует адгезии микробов, увеличивает фагоцитарную активность макрофагов, модулирует общий иммунный ответ, а также защищает от вирусных инфекций, подавляющих иммунный ответ [1, 8]. В частности, ЛФ напрямую взаимодействует с бактериальными ЛПС, предотвращая взаимодействие с CD14 и запуская сигнальный каскад, приводящий к высвобождению цитокинов и хемокинов, медиаторов липидов и активных форм кислорода [1, 8]. Кроме того, ЛФ обладает и выраженными антифунгицидными свойствами — индуцирует гибель клеток Candida albicans по апоптическому типу, провоцирует дисфунции их митохо-дрий, взаимосвязанные с накоплением ROS и высвобождением цитохрома С [2]. Защитными свойствами обладает не только целая молекула ЛФ, но и ее отдельные фрагменты: установлена эффективность применения пептида из 11 N-концевых остатков ЛФ человека (hLF1-11) против метициллинрезистент-ного стафилококка (MRSA) у мышей, а также при лекарственной устойчивости к Acinetobacter baumannii и инвазивной форме Candida albicans, устойчивой к флуконазолу [9]. Действие ЛФ избирательно: апо-форма ЛФ и его гидроли-зат ингибируют рост Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, однако не влияют на различных представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium [3]. Необходимо отметить значительную гомологию ЛФ у различных млекопитающих: при сравнении С-субъединицы молока коровы с соответствующей субъединицей свиньи, лошади, человека, верблюда, козы и буйвола идентичность последовательностей составляет от 72% до 96% [7, 8]. Однако существует и ряд межвидовых различий, влияющих на защитные свойства ЛФ [7]. Подобные различия обосновывают противоречивость результатов при сравнении эффективности ЛФ от разных видов и при разной патологии: по данным одних авторов против вируса гепатита (HIV) наиболее активен ЛФ верблюда, активность ЛФ человека и коровы сопоставимо меньше [4], по другим публикациям ЛФ коровы значительно превосходит человеческий при менингококковой инфекции у мышей [6].
Целью нашего исследования было сравнительное изучение влияния лак-тоферрина коровы и человека на гноеродные кокки и C. albicans in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Коровье и сливное человеческое молоко (3 — 5 сутки лактации) освобождали от жира центрифугированием. Казеин осаждали подкислением препарата до рН=4,0 и отделяли центрифугированием. Надосадок нейтрализовали диализом в течение ночи и вносили на колонку анионообменника MacroPrep High Q (Bio-Rad, США). ЛФ элюировали линейным градиентом NaCl. Остаточные примеси удаляли гель-хроматографией на колонке TSK-gel Toyopearl 55F (Toyo Soda, Япония).
Для сравнительного изучения антимикробных свойств лактоферрина молока человека и коровы использовали 28 штаммов грамположительных кокков (S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis) и 10 культур Candida albicans, из которых 4 были музейные с типичными свойствами, а 34 — клинические, полученные от больных с различными гнойно-воспалительными заболеваниями кожи, мягких тканей, дыхательной и мочевыделительной систем. Все они характеризовались множественной лекарственной устойчивостью к антибактериальным и антимикотическим препаратам и хлорсодержащим дезинфектантам.
Определение чувствительности микроорганизмов к ЛФ проводили стандартным методом двукратных серийных разведений в мясо-пептонном бульоне с концентрациями: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,8; 3,9; 1,95, 1,0; 0,5 мкг/мл. Суточные агаровые культуры исследуемых штаммов стандартизировали, разводили физиологическим раствором до 5000 микробных клеток в 1 мл (КОЕ/мл). В каждое разведение ЛФ и в контрольную пробирку с МПБ вносили по 0,1 мл микробной взвеси, перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 18 — 24 часов. Результат учитывали визуально по появлению признаков роста в контрольной и в опытных пробирках. Количество ЛФ в последней пробирке с полной видимой задержкой роста культуры расценивалось как минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для испытуемого штамма.
Статистическая обработка результатов проводилась при помощи компьютерной программы InStat-II (GraphPad, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно полученным данным, минимальная ингибирующая концентрация ЛФ, полученного из молока человека, была в 4 — 8 раз меньше, чем ЛФ коровы (табл.).
При этом активнее всего ЛФ, вне зависимости от происхождения, инги-бировал рост грибов рода Candida. Однако и в этом случае требовалось почти в 4 раза больше коровьего ЛФ для достижения эффекта, сходного с использованием человеческого.
В случае использования ЛФ коровьего молока в отношении двух изученных видов стафилококков эффективность его влияния была сопоставимой. Для подавления E. faecalis требовалось в среднем в 2 раза больше ЛФ, однако вследствие достаточно большой индивидуальной вариабельности результатов в данной подгруппе, статистически достоверных отличий не выявлено.
При изучении ЛФ из молока человека S. aureus значительно хуже поддавался воздействию, требовалась достоверно большая концентрация ЛФ — в среднем +30% к объему, необходимому для подавления S. epidermidis и E. faecalis.
Таким образом, эффективность ЛФ коровы значительно уступает ЛФ человека при противодействии бактериальной инвазии и грибам рода Candida,
ЛФ человека (а) ЛФ коровы (б)
Вид патогена (мкг/мл) (мкг/мл) р
M+m [95% ДИ] M+m [95% ДИ]
S. aureus(1)
38,2±4,6 (n=9)
[27,6—48,8] SD=13,780
S. epidermidis (2)
E. faecalis (3)
C. albicans (4)
27,8±2,3 (n=9)
[22,5—33,1] SD=6,890
26,6±2,4
(n=10)
[21,2—32,0]
SD=7,550
11,3±1,5
(n=10)
[8,0—14,7]
SD=4,679
104,2+20,8 (n=9)
[56,1—152,2] SD=62,500
118,1+26,4 (n=9)
[57,1—179,0]
SD=79,331
206,3+51,1
(n=10)
[90,7—321,8]
SD=161,51
43,8+9,5
(n=10)
[22,2—65,3]
SD=30,190
1а-1б) р=0,0070 1а-2а) р=0,0594пё8 1а-3а) р=0,0333 1а-4а) р=0,0001 1б-4б) р=0,0143 2а-2б) р=0,0036 2а-1а) р=0,0594пё8 2а-4а) р=0,0001 2б-4б) р=0,0135 3а-3б) р=0,0025 3а-1а) р=0,0333 3а-4а) р=0,0001 3б-4б) р=0,0058 4а-4б) р=0,0035 4а-1а) р=0,0001 4а-2а) р=0,0001 4а-3а) р=0,0001 4б-1б) р=0,0143 4б-2б) р=0,0135 4б-3б) р=0,0058
Примечание. SD — стандартное отклонение, [95% ДИ] — доверительный интервал, пёв — приближающиеся к достоверным, но недостаточно значимые различия.
самым устойчивым к воз- Сравнительная характеристика противомикробной активности ЛФ TT/TS ________ человека и ЛФ коровы по МИК
действию ЛФ человека р
оказался S.aureus, а к ЛФ коровы — E. faecalis.
В целом, ЛФ коровы и человека обладают антимикробными свойствами, бактериостатиче-ские эффекты которых были показаны в отношении антибиотикоре-зистентных стафилококков и энтерококков и дрожжеподобных грибов рода Candida, однако МИК у них значительно различается. Это может быть связано, с одной стороны, со структурными различиями белка у разных видов млекопитающих [7, 8], а с другой, с объектом приложения — в эксперименте использовались штаммы возбудителей, полученных от человека.
Кроме того, антимикробная активность ЛФ в значительной степени обусловлена его способностью связывать железо, лишая бактерию необходимого для роста и жизнедеятельности микроэлемента [1, 8]. Возможно, потенциальная связывающая способность ЛФ коровьего молока, содержащего в среднем в 4 раза больше железа, чем ЛФ женского молока, также оказала влияние на результаты исследования.
Обращает на себя внимание повышенная устойчивость S. aureus к ЛФ человека по сравнению с двумя другими видами бактерий и отсутствие сходной реакции на коровий ЛФ. Можно предположить, что за время эволюции S. aureus выработал способы защиты от ЛФ, либо, что более вероятно, злоупотребление антибиотикотерапией привело к формированию резистентных мутантных форм, не чувствительных не только к биогенным и абиогенным лекарственным препаратам, но и к ЛФ. Это предположение косвенно подтверждается тем, что использование ЛФ (перорально) с антибиотиками при лечении гнойно-воспалительных заболеваний повышает его эффективность [8] — механизмы воздействия частично перекрываются, усиливая друг друга и сходным образом ослабевая у устойчивых форм. В этом случае перспективным представляется использование в схемах лечения стафилококковых инфекций коровьего лактоферрина, отличающегося от человеческого по структуре — его требовалось в 2,7 раза больше, однако эффективность в отношении S. aureus была наибольшей, по сравнению с воздействием на другие бактерии.
Таким образом, человеческий ЛФ демонстрирует значительно большую антимикробную активность в отношении штаммов S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis и C. albicans, обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Однако приемлемая эффективность в сочетании со значительно боль-
шей доступностью коровьего ЛФ представляются более перспективными,
особенно при лечении антибиотикорезистентных форм бактериальной и
кандида-инфекций.
Л ИТЕРАТУРА
1. Зорина В.Н., Зорин Н.А. Белковые компоненты врожденного иммунитета в защите от патогенной инвазии. Журн. микробиол. 2013, 3: 111-117.
2. Acosta-Zaldívar M., Andrés M.T., Rego A. et al. Human lactoferrin triggers a mitochondrial-and caspase-dependent regulated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Apoptosis. 2016, 21(2): 163-173. doi: 10.1007/s10495-015-1199-9.
3. Chen P.W., Jheng T.T., Shyu C.L., Mao F.C. Synergistic antibacterial efficacies ofthe combination of bovine lactoferrin or its hydrolysate with probiotic secretion in curbing the growth of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol. 2013, 62 (Pt 12): 1845-1851. doi: 10.1099/jmm.0.052639-0.
4. El-Fakharany E.M., Sánchez L., Al-Mehdar H.A., Redwan E.M. Effectiveness of human, camel, bovine and sheep lactoferrin on the hepatitis C virus cellular infectivity: comparison study. Virol. J. 2013, 10: 199. doi: 10.1186/1743-422X-10-199.
5. Giansanti F., Panella G., Leboffe L., Antonini G. Lactoferrin from milk: Nutraceutical and pharmacological properties. Pharmaceuticals (Basel). 2016, 9 (4). pii: E61.
6. Schryvers A.B., Gonzalez G.C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infect. Immun. 1989, 57 (8): 24252429.
7. Sharma S., Sinha M., Kaushik S. et al. C-lobe of lactoferrin: the whole story of the half-molecule. Biochem Res. Int. 2013; 2013: 271641. doi: 10.1155/2013/271641.
8. Siqueiros-Cendón T., Arévalo-Gallegos S., Iglesias-Figueroa B.F. et al. Immunomodulatory effects of lactoferrin. Acta Pharmacol Sin. 2014, 35 (5): 557-566. doi: 10.1038/aps.2013.200.
9. van der Does A.M., Bogaards S.J., Jonk L. et al. The human lactoferrin-derived peptide hLF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response. Biometals. 2010, 23 (3): 493-505. doi: 10.1007/s10534-010-9322-4.
Поступила 15.10.17
Контактная информация: Зорина Вероника Николаевна, д.б.н.,
654007, Новокузнецк, пр. Строителей, 5, р.т. (3843)45-84-18
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Е.В.Отрашевская1, В.Н.Винокурова1, Е.А.Шитиков2, Е.А.Сотникова2, Т.А.Перевышина1, С.А.Колченко2, Т.Б.Бутусова2, Е.С.Кострюкова2, Е.Н.Ильина2, Г.М.Игнатьев1'3
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ СУБ-ШТАММА M. BOVIS BCG-1 (RUSSIA) В ПРОЦЕССЕ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ БЦЖ
1НПО «Микроген», Москва; 2Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины, Москва; 3Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов
Цель. Изучение структуры генома и анализ стабильности генетических свойств субштамма M. bovis BCG-1 (Russia), применяемого для производства вакцин. Материалы и методы. Было проведено полногеномное секвенирование и последующий сравнительный анализ образцов суб-штамма M. bovis BCG-1 (Russia) от рабочего банка до конечного пассажа производственного культивирования, а также производственных серий. Молекулярно-биологическими методами был проведен анализ числа тандемных повторов (VNTR) по 24 локусам и сполиготипирование. Результаты. Последовательность субштамма M. bovis BCG-1 (Russia) рабочего посевного банка была полностью собрана, аннотирована и депонирована в базу GenBank. Анализ DU2- и RD-регионов подтвердил принадлежность суб-штамма М. bovis BCG-1 (Russia) к группе DU2-I, BCG Russia.
