CC BY
104
УДК [579/22:57.063.8]:661.185.002.68
ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРОМЫШЛЕННЫХ ОТХОДОВ
© 2011 А.А. Утепешева, О.Б. Сопрунова
ФГУП «Астраханский государственный технический университет», г. Астрахань
Поступила 27.05.2011
Дана характеристика новым штаммам микроорганизмов, выделенных из промышленных отходов, обладающих полезными свойствами.
Ключевые слова: гетеротрофные микроорганизмы, свойства, деградация, поверхностно-активные вещест-
В настоящее время во всем мире, в том числе и в России, остро стоят проблемы загрязнения воздуха, почвы, воды различными поллютантами [2]. Такие соединения, как поверхностно-активные вещества (ПАВ), пестициды, различные органические соединения, содержащие нитрогруппу, галоидорга-нические соединения, фосфорорганические соединения, пластмассы, синтетические смолы и некоторые другие продукты промышленности органического синтеза разрушаются в природе медленно и отличаются высокой устойчивостью к действию микроорганизмов. Такие синтетические вещества кумулируются в водоемах и почве, загрязняют окружающую среду [7].
Целью исследований являлось выделение новых штаммов микроорганизмов из промышленных отходов и изучение их свойств. Задачи исследования: выделение микроорганизмов из сточных вод и почв прилегающей территории очистных сооружений; изучение культурально-морфологических и физиологе-биохимических свойств выделенных штаммов микроорганизмов; изучение способности микроорганизмов к деградации ПАВ (катионные и анионные).
Объектом исследований являются гетеротрофные микроорганизмы, выделенные из сточных вод и почв прилегающей территории завода «Стекловолокно».
Микроорганизмы выделяли методом Коха [1] с использованием поверхностного и глубинного культивирования на следующих питательных твердых средах: питательный агар и агаризованная среда М9 следующего состава (г/л): №2НР04 - 6,0; КН2Р04 - 3,0; №С1 - 0,5; ]ЧН4а - 1,0; рН 7,0-7,2.
Для выделения специфичной микрофлоры использовали ПА и М9, в которые вносили ПАА в количестве 1 г/л. Посевы со средой ПА инкубировали при комнатной температуре в течение недели; со средой М9 - в течение 3-4 недель.
В результате микробиологических исследований установлено, что в сточных водах и почвах
Утепешева Алия Алимгазиевна, e-mail: [email protected]; Сопрунова Ольга Борисовна, докт. биол. наук, проф., e-mail [email protected].
присутствует гетеротрофная (1,7 Т О6... 1,4 Т О7 КОЕ/мл; 6,0 1 04...1,4 1 05 КОЕ/г) и специфическая (3,0Т04... 1,7Т07 КОЕ/мл; 0,2-Ю2...0,4-Ю2 КОЕ/г) микрофлора.
Доминирующие формы микроорганизмов представлены в основном бактериями кокковидной формы, Г+ спорообразующими и неспорообразую-щими палочками.
В результате периодических пересевов в чистые культуры выделено 12 штаммов бактерий, изучены их культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства.
Для изучения физиолого-биохимических свойств исследовали особенности углеродного и азотного питания, амилолитические, протеолитиче-ские, эмульгирующие, фунгицидные свойства, а также способность выделенных штаммов усваивать поверхностно-активные вещества.
В качестве источников углерода использовали различные моно- и дисахариды, которые вносили (1%) в ПА [6]. Рост микроорганизмов оценивали визуально в баллах (шкала от 0 до 5) (рис. 1).
Для изучения способности использовать азот минеральных солей применяли среду следующего состава (г/л): глюкоза - 20,0; К2НР04 - 1,0; КН2Р04
- 1,0; MgS04-7H20 - 0,5; NaCl - 0,5; агар-агар -15,0; раствор микроэлементов - 1 мл (CuS04-5 Н20
- 0,64 г; FeS04-7H20 - 0,11 г; МпС12-4Н20 - 0,79 г; ZnS04 7H20 - 0,15 г; дистиллированная вода - 100 мл). Использование солей аммония определяли путем добавления к основной среде NH4C1 (1,0 г) и СаСОз (5,0 г), использование нитратов - KN03 (1,0 г). Среды стерилизовали при 0,5 атм.
Изучение роста бактерий на среде с различными источниками углерода показало, что наилучший рост всех штаммов наблюдается на среде с добавлением мальтозы и галактозы. На среде с добавление сахарозы штамм № 4 выделял пигмент красного цвета. Штаммы № 1, 3 и 5 растут на среде с добавлением NH4C1, штаммы № 4 и 5 - с добавлением KN03.
При изучении амилолитических свойств обнаружено, что выделенные штаммы микроорганизмов данной способностью не обладают.
Изучение протеолитических свойств показало, что этой способностью обладают штаммы № 4, 5,
10. Причем штамм № 4 при этом выделял пигмент цвета [6]. розового цвета, штамм № 10 - пигмент черного
контроль глюкоза галактоза сахароза мальтоза крахмал
□ 1 Ш 2 ИЗ О 4 а 5 Н6 0 7 □ 8 0 9 010 □ 11 ■ 12
Рис. 1. Рост бактериальных штаммов на среде с различными источниками углерода.
Для определения эмульгирующей активности культуры выращивали в течение 5 сут на скошенной агаризованной среде. Клетки смывали средой следующего состава (г/л): К2НР04 - 7,0; КН2Р04 -3,0; СаСЬ (1%, мл) - 1,0; Мё804 -7Н20 - 0,1; (>Ш4)2804 - 1,0; РеБСи 7Н20 - 0,5; 2п804 7Н20 -0,5; Мп804 ЗН20 - 0,5; Н2804 (0,1н, мл) - 10,0. Суспензию клеток оставляли на сутки, далее 4 мл суспензии центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Эмульгирующую активность определяли путем добавления к 4 мл исследуемого образца 4 мл бензина и дизельного топлива (ДТ) с
последующим встряхиванием в течение 10 мин. Полученную эмульсию оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Эмульгирующую активность определяли как отношение высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в измерительной пробирке и выражали в % [8].
При изучении эмульгирующей активности наблюдалась высокая активность эмульгирования с использованием бензина у штаммов № 1 (40%), 3 (60%), 8 и 11 (53%); с использованием ДТ эмульгирующая активность значительно ниже (0-7%) (рис. 2).
Рис. 2. Эмульгирующая активность бактериальных штаммов (%).
Изучение фунгицидной активности проводили в (КГА), содержащем картофельный экстракт - 230 чашках Петри на картофельно-декстрозном агаре мл, глюкозу - 20,0, водопроводную воду - 770 мл,
и глюкозо-пептонном агаре следующего состава (г/л): глюкоза - 5,0; пептон - 5,0; К2НРО4 - 4,0; КН2Р04 - 2,0; агар-агар - 15,0. Суспензию спор тест-гриба высевали на агаризованную среду, а исследуемую культуру вносили, делая посев уколом поверх газона гриба. Чашки инкубировали в термостате в течение 5-7 сут при температуре 25°С. Антагонистов выявляли по наличию вокруг колонии бактерий зоны подавления роста тест-гриба [3].
В качестве тест-объектов для определения фун-гицидной активности штаммов служили следующие мицелиальные грибы: Alternaría tennuissima, Fusarium ciilmoriim, F. graminearum, Phytophtora iiltiim.
Изучение фунгицидной активности показало, что данным свойством обладают штаммы № 2, 6, 10, проявляя фунгицидную активность к ¡'ияатил grammearum, Р. сгйтогнт, РЬу(орЫога нЫнт.
Для определения способности штаммов микроорганизмов усваивать поверхностно-активные вещества (ПАВ) использовали ПА с добавлением ка-тионных и анионных ПАВ. Микроорганизмы высевали радиальными штрихами. Контролем служили чашки с посевом без добавления ПАВ. Чашки помещали в термостат. Интенсивность развития культур бактерий по штриху оценивали в баллах визуально (шкала от 0 до 5) (рис. 3).
Рис. 3. Активность бактериальных культур по отношению к катионным и анионным ПАВ.
При изучении способности использовать КПАВ наблюдался рост всех штаммов микроорганизмов. На ПА с добавлением АПАВ активный рост наблюдался практически для всех культур, за исключением штаммов № 3, 4, 5.
Способность микроорганизмов деградировать ПАВ изучали флуориметрическим методом, который основан на экстракции хлороформом ионных пар АПАВ с красителем акридиновый желтый [5], деградации КПАВ - на экстракции хлороформом ионных пар КПАВ с красителем эозин [4] и измерении концентрации ПАВ в полученном экстракте с помощью анализатора жидкости «Флюорат-02».
Для эксперимента использовали растворы КПАВ с концентрацией 1, 5, 10 мг/л, растворы АПАВ - 1, 2, 10, 20 мг/л. В данные растворы вносили бактериальные штаммы, титр клеток, при вне-
сении в растворы КПАВ
2,5-10"
составляет
КОЕ/мл, в растворы АПАВ - 1,47-106 КОЕ/мл. Убыль ПАВ и титр клеток в ходе эксперимента отмечали через каждые 24 ч в течение 4 сут.
Установлено, что все исследуемые штаммы осуществляют деградацию КПАВ и АПАВ. Максимальной способностью деградировать ПАВ обладает штамм № 11. Деградация КПАВ с концен-
трацией 1 мг/л в течение 96 ч достигла 60%, 5 мг/л - 65%, 10 мг/л - 62% (рис. 4). Деградация АПАВ в течение 96 ч достигла 100% во всех модельных растворах (рис. 5).
Убыль КПАВ с концентрацией 1 и 5 мг/л происходит постепенно в течение 96 ч. При этом численность микроорганизмов возрастает и убывает постепенно. В первом случае численность микроорганизмов имеет два пика: 24 ч и 72 ч, после чего резко уменьшается. При концентрации 5 мг/л титр клеток в первые 24 ч увеличивается, затем постепенно снижается в течение эксперимента. Деструкция КПАВ с концентрацией 10 мг/л происходит незначительно в первые 24 ч, затем никаких изменений не наблюдается. При этом численность микроорганизмов резко уменьшается также в течение 24 ч культивирования. Исходя из этого, можно предположить, что концентрация КПАВ 10 мг/л, является летальной для данного штамма.
Во всех модельных растворах происходит резкое снижение концентрации АПАВ в первые 24 ч, в последствии к 72 ч происходит полная деградация АПАВ. При этом титр клеток увеличивается (до 107) в течение 48 ч, затем постепенно снижается (до 104).
Таким образом, в ходе исследований выделены новые штаммы микроорганизмов, способные использовать поверхностно-активные вещества в качестве источников питания, что позволяют сделать вывод о возможности применения бактериальных культур доя разработки способов очистки от ПАВ.
Рис. 5. Деградационная способность штамма № 11 по отношению к АПАВ: а) концентрация 2 мг/л; б) концентрация 10 мг/л; в) концентрация 20 мг/л.
Рис. 4. Деградационная способность штамма № 11 по отношению к КЛАВ: а) концентрация 1 мг/л; б) концентрация 5 мг/л; в) концентрация 10 мг/л.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова II.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. М., 2004. 144 с.
2. Егорова Т.А., Клоунова С.AI, Жпвухпна Е.А. Основы биотехнологии. М.: Академия, 2005. 208 с.
3. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии. М.: Наука, 2005. 166 с.
4. ПНД Ф 14.1:2:4.39-95. Методика выполнения измерений массовой концентрации катионных поверхностно-активных веществ (КЛАВ) в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02»: Утв. 1995-06-23. М., 1995.21 с.
5. ПНД Ф 14.1:2:4.158-2000 Методика выполнения измерений массовой концентрации анионных поверхностно-активных веществ (АПАВ) в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на
анализаторе жидкости «Флюорат-02»: Утв. 2000-03-15. М., 2000. 21 с.
6. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др. М.: Академия, 2005. 608 с.
7. Ротмистров М.Н., Гвоздяк П.И., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. Киев: Наукова думка, 1978. 268 с.
8. Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов : Дис. ... докг. биол. наук. Саратов, 2000. 360 с.
THE STUDYING OF FIZIOLOGO-BIOCHEMICAL PROPERTIES OF NEW STRAINS OF MICROORGANISMS ALLOCATED FROM INDUSTRIAL WASTES
© 2011 A.A. Utepesheva, O.B. Soprunova
Astrakhan State Technical University, Astrakhan
In this article is given the characteristic new штаммам the microorganisms allocated from industrial wastes, possessing useful properties.
Key words: heterotrophic microorganisms, properties, degradation, surface-active substances.
Utepesheva Aliya Alimgazievna, e-mail: [email protected]; Soprunova Olga Borisovna, Doctor of Biology, Professor, email [email protected].
