CC BY
28
УДК 619:615:015.4
Ключевые слова: Тиамулокс-комби, поросята, плазма крови Key words: Tiamulox-Combi, pigs, blood plasma
Тухфатова Р. Ф., Енгашев С. В.
ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ТИАМУЛОКСА-КОМБИ В ОРГАНИЗМЕ ПОРОСЯТ
study of pharmacokinetics of tiamulox-combi in pigs
ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологий имени К. И. Скрябина» Адрес: 109472, г. Москва, ул. А. Скрябина, 23
K .I. skryabin Moscow state Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology Address: 109472, Russia, Moscow, A. scriabin str., 23
Тухфатова Регина Фановна, к. б. н., доцент каф. фармакологии и токсикологии
Tukhfatova Regina F., Ph.D. in Biological sciences, Associate Professor of the Pharmacology and Toxicology Dept. Енгашев Сергей Владимирович, д. в. н., проф. Yengashev sergey V., Doctor of Veterinary Medicine, Professor
Аннотация. Изучена фармакокинетика Тиамулокса-комби в организме поросят при пероральном введении. Установлено, что при однократном пероральном введении в дозе 100 мг / кг массы тела максимальная концентрация тиамулина в плазме крови была отмечена через 2 часа, окситетрациклина - через 1 час. Через 12 часов после введения препарата концентрация тиамулина снижалась до 0,61 мкг/см3, а окситетрациклина - до 0,41 мкг/см3. Summary. Studied the pharmacokinetics of Tiamulox-Combi in pigs in oral introduction. It is established that after a single oral administration at a dose of 100 mg / kg of body weight the maximum concentration of Tiamulin and oxytetracycline in the blood plasma was observed after 2 hours and 1 hour respectively. Within 12 hours after the introduction of the drug concentration of Tiamulin and oxytetracycline declined to 0.61 mcg/cm3 and 0.41 mcg/cm3 respectively.
Введение
Тиамулокс-комби - комплексный антибактериальный препарат, содержащий в своем составе окситетрациклина гидрохлорид (100 мг/ 1 г) и тиамулина гидрогенфумарат (33 мг / 1 г). Комбинация тиамиулина гидрогенфу-марата и окситетрациклина гидрохлорида, обладая синергидным действием, обеспечивает широкий спектр антибактериальной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
Тиамулин гидрофумарат - полусинтетический дериват дитерпенового антибиотика плевромутилина, продуцируемого Pleurotus mutulis. Обладает бактериостатической активностью, подавляя синтез белка на рибо-сомальном уровне грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в т. ч. Mycoplasma spp., Brahyspira hyodysenteriae, Brahyspira pilosicol, Haemophilus spp., staphylococcus spp., streptococcus spp., Clostridium perfringens, Leptospira spp., Listeria monocytogenes, Pasteurella spp., Corynebacterium pyogenes, Actinobacillus
pleuropneumoniae, Pasteurella multocida; не действует на бактерии семейства Enterobacteriaceae, в т. ч. salmonella spp. и Escherichia coli. Окситетрациклин гидрохлорид - антибиотик тетрациклиновой группы, продуцируемый streptomyces rimosus; активен в отношении большинства грамположи-тельных и грамотрицательных микроорганизмов, включая escherichia coli, salmonella spp., staphylococcus spp., streptococcus spp., а также риккетсий и некоторых видов ми-коплазм. Механизм его антибактериального действия основан на подавлении белкового синтеза микробной клетки (блокада функции рибосом) и блокаде синтеза РНК [1].
Цель и задача исследований - изучение фармакокинетики Тиамулокса-комби в крови поросят.
Материалы и методы исследований
Исследование фармакокинетики Тиаму-локса-комби проводили на 10 поросятах крупной белой породы массой 14-15 кг. Перед проведением эксперимента животные
были клинически обследованы. По результатам исследований патологии у животных выявлено не было.
Всем животным вводили Тиамулокс-ком-би однократно перорально в дозе 100 мг / кг массы тела. До введения, а затем через 1, 3, 6, 9 и 12 часов после введения препарата у животных из хвостовой вены брали кровь в пластиковые пробирки с гепарином.
За сутки до эксперимента и во время опыта животных поили вволю.
Определение тиамулина гидроген фума-рата в плазме крови проводили методом жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием и обработкой данных с помощью компьютерной программы Мультих-ром (версия 1.48) [2, 3].
Для анализа использовали жидкостный хроматограф высокого давления Hewlett Paccard 1090 A с УФ-детектором; хроматогра-фическую обращеннофазовую предколонку С 18, 4,0/3,0 ммс диаметром сорбента 5 мкм; хроматографическую обращеннофазовую колонку Lichrospher 100 RP-18 00F-0152-E0 (250/4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм; весы лабораторные; рН-метр Hanna pH 213; вакуумный ротационный испаритель IKA RV 06 ML 1-B; центрифугу лабораторную ОПН-3; ультразвуковую ванну Branson B 8510 DTH; встряхиватель Elmi (Шейкер
5-3.01); посуду мерную, лабораторную, стеклянную; фильтровальную установку "Milli-Q50"; одноразовые картриджи для твердофазной экстракции (SPE) Varian Bond Elut C , 3 см3/500 мг; вакуумный манифолд на 24 позиции для картриджей Varian Bond Elut ("Sigma Aldrich"); воду дистиллированную; аммония карбонат, А 9516 ("Sigma"); натрия карбонат, 99,5 % ("Sigma Aldrich"); винную кислоту, 99,0 % ("Sigma Aldrich"); метанол, LiChrosolv для жидкостной хроматографии ("Merck"); ацетонитрил, ч. д. а., ТУ
6-09-5497 («Криохром»); гексан, ч., ТУ 6-09337578 (АО «Мосреактив»).
Элюент готовили следующим образом: смешивали 80%-й водный раствор ацетони-трила и 1%-й водный раствор карбоната аммония в соотношении 90/10. Готовый элюент фильтровали с одновременным дегазированием через установку "Milli-Q50".
Для ввода системы в рабочий режим пред-колонку С 18 и колонку Lichrospher 100 ЯР-18 промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,4 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на Х=210 нм.
Приготовление стандартных растворов тиамулин гидроген фумарата («Novartis» с активностью 99,2 %) для построения калибровочного графика проводили методом последовательных разведений водой, готовя стандартные рабочие растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3.
Наиболее приемлемые результаты были достигнуты при следующих параметрах хро-матографирования:
- элюент: 80%-й раствор ацетонитрила / 1%-й раствор карбоната аммония в соотношении 90/10;
- скорость протекания элюента: 2 см3/ мин.;
- давление: 18,2 МПа;
- объем вводимой пробы: 50 мкл;
- УФ-волна анализа: 210 нм;
- время удержания пика: ~ 4,5-5,0 мин.
Пробоподготовку проводили следующим образом: в центрифужные пробирки объемом 15 см3 переносили по 2 см3 плазмы и добавляли 10 см3 ацетонитрила. Пробы встряхивали в шейкере в течение 5 минут и обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут, затем центрифугировали в течение 5 минут при скорости 2000 об./мин. Ацетони-рильно-водные экстракты переносили в кру-глодонные колбы. К осадкам в центрифужных пробирках повторно добавляли 10 см3 ацетонитрила, пробы повторно встряхивали на шейкере в течение 5 минут, обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут; а затем центрифугировали в течение 5 минут при скорости 2000 об./мин. Ацетонирильно-водные экстракты после первичной и вторичной экстракции объединяли в круглодонных колбах, упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре 45 °С. Сухие остатки смывали 5 см3 0,1%-го раствора винной кислоты, к экстрактам добавляли по 5 см3 гек-сана. Затем пробы встряхивали на шейкере в течение 5 минут. После расслоения фрак-
ций гексановые фракции также отбрасывали. К экстрактам добавляли по 5 см3 0,5%-го раствора натрия карбоната, пробы встряхивали в течение 1 минуты. Затем вторично добавляли гексан. После расслоения гексановые фракции объединяли в круглодонных колбах, упаривали досуха в ротационном испарителе при температуре 45 °С. Экстракты наносили на предварительно активированные картриджи. Полученные конечные экстракты анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [4, 5].
Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хромато-графических данных.
Для построения графика корелляции площади пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений тиамулина гидро-ген фумарата 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3, приготовленных по схеме, приведенной выше.
Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пика / концентрация», представлены в таблице 1.
Содержание тиамулина гидроген фумарата (У) в экстрактах рассчитывали по уровню калибровки. Полученные значения корректировали с учетом извлечения тиамулина из плазмы крови, а также коэффициента концентрирования.
Определение уровня извлечения тиаму-лина проводили на контрольных пробах. В плазму крови объемом 2 см3, полученную от животных контрольной группы, внесли по 1 см3 стандартного раствора тиамулина ги-дроген фумарата с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешивали. Пробоподго-товку проводили по отработанной методике.
Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 0,5 см3.
Предел детектирования тиамулина гидроген фумарата в экстрактах определяли хроматографированием проб плазмы крови с внесенными стандартными образцами.
В результате было установлено, что предел количественного определения в экстрактах плазмы крови составляет 80 нг/см3.
При помощи процедуры градуировки определили относительные коэффициенты отклика детектора для анализируемых экстрактов и получили формулу расчета концентраций тиамулина гидроген фумарата для плазмы крови:
Y = 0,0558974 * Х, где: Y - искомая концентрация тиамулина гидроген фумарата в плазме крови, мкг/мл; Х - площадь пика в пробе, мВ*сек.
Определение тетрациклина проводили на жидкостном хроматографе высокого давления с использованием обращеннофазовой колонки экстрактов плазмы, полученных после экстракции хлортетрациклина при помощи смеси EDTA и McIlvaine буфера, очистки и концентрирования проб на картриджах твердофазной экстракции и обработки полученных данных с помощью компьютерных программ Eurochrome и DataBase Biostatistic 4.02 vs. За основу был взят метод для определения хлортетрациклина, окситетрациклина и тетрациклина в органах и тканях.
Для анализа использовали дополнительно к выше перечисленному оборудованию и реактивам жидкостный хроматограф высокого давления Waters с насосом Mod. 510 и с диодно-матричным УФ-детектором Pye Unicam Mod. PY 4020, управляемый при помощи 79994А ChemStation; хроматографиче-
Площадь пика, мВ*сек Концентрация стандартного раствора, мкг/см3
913,844 10
469,462 5
234,344 2,5
91,680 1
45,840 0,5
Таблица 1.
Зависимость площади пика от концентрации тиамулина гидроген фумарата
скую обращеннофазовую колонку Lichrosorb 10 RP 8 (250/4,0 мм) с диаметром сорбента 5 мкм; одноразовые картриджи для твердофазной экстракции (SPE) Varian Bond Elut C , 6 см3/500 мг; динатриевая соль этилен-диаминтетрауксусной кислоты (EDTA Na2), 99,0 % ("Sigma"); динатриевая соль фосфорной кислоты, 99,0 % ("Sigma"); лимонной кислоты моногидрат (ACS reagent), 100,0 % ("Sigma"); соляная кислота , х.ч., ГОСТ 311877 («Реахим»); гидроокись натрия, 98,0 % ("Fluka"); дигидрат щавелевой кислоты, 99,5 % ("Fluka").
Для приготовления раствора элюента использовали смесь 0,2 М водного раствора щавелевой кислоты с ацетонитрилом в соотношении 85/15.
Для приготовления McIlvaine буфера использовали смесь водных растворов моногидрата лимонной кислоты и динатриевой соли фосфорной кислоты. рН свежеприготовленного McIlvaine буфера должна быть 4,0±0,05.
Для ввода системы в рабочий режим предколонку С 18 и колонку Lichrosorb 10 RP 8 промывали элюентом в количестве 20 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,5 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на Х=350 нм.
Стандартные рабочие растворы хлорте-трациклина гидрохлорида готовили методом разведения метанолом до концентраций 10000; 5000; 2500; 1000 и 500 нг/см3. По данным концентрациям строится график зависимости «площадь пика - концентрация».
Наиболее приемлемые результаты были достигнуты при следующих параметрах хро-матографирования:
- элюент: 0,2 М водный раствор щавелевой кислоты / ацетонитрил в соотношении 85/15;
- скорость протекания элюента: 1,5 см3/ мин.;
- давление: 20,2 МПа;
- объем вводимой пробы: 50 мкл;
- УФ-волна анализа: 350 нм;
- время задержки выхода хлортетрацикли-на: ~7-8 мин.
- полное время анализа: ~10 мин.
Пробоподготовку проводили следующим
образом: в центрифужные пробирки объемом 15 см3 переносили по 2 см3 плазмы и добавляли по 20 см3 смеси EDTA и Марате буфера с рН 4,0. Пробы перемешивали на шейкере в течение 5 минут и обрабатывали ультразвуком в течение 3 минут. Пробы плазмы крови, смешанные с EDTA и Марате буфером, при помощи вакуумного манифол-да наносили на сорбенты предварительно активированных картриджей для твердофазной экстракции.
По результатам анализа стандартных концентраций хлортетрациклина гидрохлорида построили график зависимости площади пика от концентрации (табл. 2).
В результате было получено следующее уравнение, отражающее данную зависимость:
Y = 47,526 * Х
где: Y - искомая концентрация хлорте-трациклина гидрохлорида в плазме крови, нг/мл; Х - площадь пика в пробе, мВ*сек.
Для определения процента извлечения хлортетрациклина при пробоподготовке плазмы крови в образцы объемом 2 см3, отобранную от животных контрольной группы,
Площадь пика, мВ*сек Концентрация стандартного раствора, нг/см3
421,043 20000
198,804 10000
123,001 5000
53,454 2500
18,166 1000
12,872 500
Таблица 2.
Зависимость площади пика от концентрации хлортетрациклина гидрохлорида
искусственно внесли стандартные растворы хлортетрациклина гидрохлорида из расчета 2500 нг/см3. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3.
В результате было установлено, что предел количественного определения хлорте-трациклина в стандартном растворе равен 100 нг/см3.
На основании этой величины и с учетом процента извлечения был рассчитан предел количественного определения хлор-тетрациклина в плазме, который составил 140,351 нг/см3. С учетом вышеприведенного метода пробоподготовки предел количественного определения хлортетрациклина в плазме крови составляет 70,175 нг/см3.
В результате была установлена следующая формула расчета концентраций хлорте-трациклина:
Y = 33,351578 * Х
Результаты исследований и обсуждение
Определение тиамулина
Данные, полученные при анализе экстрактов плазмы крови поросят, отобранных через
1, 3, 6, 9 и 12 часов после окончания обработки, представлены в таблице 3.
Данные таблицы 3 свидетельствуют о том, что тиамулин, входящий в состав Тиамулок-са-комби, быстро всасывается в кровь и в значительных концентрациях обнаруживается в сыворотке крови в течение 12 часов.
Определение концентраций окситетра-циклина
Данные, полученные при анализе экстрактов плазмы крови поросят, отобранных через 1, 3, 6, 9 и 12 часов после однократной обработки Тиамулоксом-комби, представлены в таблице 4.
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что окситетрациклин, входящий в состав Ти-амулокса-комби, быстро всасывается в кровь и в значительных концентрациях обнаруживается в сыворотке крови в течение 12 часов.
Выводы
В результате проведенных исследований было отмечено, что при однократном перо-ральном введении препарата Тиамулокс-комби в дозе 100 мг/кг массы тела у поросят было отмечена максимальная концентрация
Таблица 3.
Содержание тиамулина в образцах плазмы крови поросят после применения Тиамулокса-комби
Сроки отбора проб, Кол-во Среднее значение
часы животных концентрации, мкг/см3 (М±т)
1 5 1,80±0,20
3 5 2,05±0,14
6 5 1,51±0,16
9 5 0,92±0,04
12 5 0,61±0,04
Таблица 4.
Содержание окситетрациклина в образцах плазмы крови поросят после применения Тиамулокса-комби
Сроки отбора проб, Кол-во Среднее значение
часы животных концентрации, мкг/см3 (М±т)
1 5 0,74±0,06
3 5 0,72±0,11
6 5 0,59±0,03
9 5 0,50±0,04
12 5 0,41±0,02
тиамулина в плазме крови через 2 часа, ок-ситетрациклина - через 1 час. Через 12 часов после введения препарата концентрация тиа-мулина снижалась до 0,61 мкг/см3, что ниже максимального уровня в 3 раза, а окситетра-циклина - до 0,41 мкг/см3, что ниже максимального уровня в 2 раза.
Список литературы
1. Данилевская, Н. В. Использование метода селективной деконтаминации при отъеме поросят / Н. В. Данилевская, Р. Ф. Тухфатова // Аграрный вестник Урала. - 2012. - № 5. - С. 36-39.
2. Каркищенко, Н. Н. Фармакокинетика / Н. Н. Кар-кищенко, В. В. Хоронько, Л. А. Сергеева, В. Н. Каркищенко. - Ростов-на-Дону : Феникс, 2001. - 383 с.
3. Соловьев, В. Н. Фармакокинетика / В. Н. Соловьев, А. А. Фирсов, В. А. Филов. - М. : Медицина, 1980. - 223 с.
4. Хабриев, Р. У Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р. У Хабриев. - М. : Медицина, 2005. - 832 с.
5. Duquesnay, C. Comparative clinical pharmacokinetics of single doses of sumatriptan following subcutaneous, oral, rectal and intranasal administration / C. Duquesnay, J. P. Mamet, D. Summer, E. Fuseau // Eur. J. Pharm. Sci. - 1998. - 6 (2). - P. 99-104.
TO 2 го
с
ф
11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111N M/^
1 как оформить подписку на журнал? 1
А. Через подписные каталоги
Каталог подписное агентство Индекс
Пресса России Агентство «Книга-Сервис» 29447
Газеты. Журналы Агентство «Роспечать» 33184
= Б. Через редакцию журнала =
= Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету =
= для юридических лиц: |
| НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии» =
\ ИНН 7802196720 КПП 781301001 |
| Р/с 40703810400000000022 в ЗАО АКБ «Горбанк», г. Санкт-Петербург |
| К/с 30101810200000000814 БИК 044030814 |
= В поле «Назначение платежа» указать: =
| «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы =
| ветеринарной биологии» на 2014 г. согласно инф. письму б/н |
= от 20.12.13 г. НДС не облагается. Адрес доставки: ...» |
| Стоимость редакционной подписки на 2014 год (четыре номера): 1600 рублей. |
= учредитель и издатель: НОУ ДО «Институт Ветеринарной Биологии». =
Ё Адрес: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. |
| Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru |
