Научная статья на тему 'Сроки выведения остаточных количеств фенбендазо-ла из организма кабанов после применения вигисола'

Сроки выведения остаточных количеств фенбендазо-ла из организма кабанов после применения вигисола Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
135
39
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
кабаны / нематоды / жидкостная хроматография / фенбендазол / остаточные количества / wild-boars / nematodes / liquid chromatography / fenbendazole / the residual quantities

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Русаков С. В., Емельянова Н. Б., Архипов И. А.

Методом высокоэффективной жидкостной хро-матографии с ультрафиолетовым детектированием изучены сроки выведения фенбендазола и его мета-болита из организма кабанов после дегельминтиза-ции вигисолом. Максимальная концентрация фен-бендазола и его метаболита сульфоксида в органах и тканях кабанов находится в течение 3 сут после дачи вигисола. Фенбендазол полностью выводится из ор-ганизма кабанов через 7 сут после лечения.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The term of excreting of residual quantities of fenbendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol

The term of excreting of residual quantities of fenbendazole and it’s metabo-lite oxfendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol is investigated. The residual quantities of fenbendazole is definited by liquid chromatography a high pressure with UF-detection. Highest concentration of fenbendazole and oxfendazole in organs and tissues of wild-boar were during 3 days after treatment by vigisol. The drug excreted completely from the body of animals during 7 days after treatment.

Текст научной работы на тему «Сроки выведения остаточных количеств фенбендазо-ла из организма кабанов после применения вигисола»

Лечение и профилактика

УДК 619:616.995.1-085

СРОКИ ВЫВЕДЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЕНБЕНДАЗО-ЛА ИЗ ОРГАНИЗМА КАБАНОВ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВИГИСОЛА

С.В. РУСАКОВ кандидат биологических наук Н.Б. ЕМЕЛЬЯНОВА соискатель И.А. АРХИПОВ доктор ветеринарных наук

Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии

имени К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, тел./факс 8-499-124-56-55, e-mailrvigis@ncport.ru

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием изучены сроки выведения фенбендазола и его метаболита из организма кабанов после дегельминтизации вигисолом. Максимальная концентрация фенбендазола и его метаболита сульфоксида в органах и тканях кабанов находится в течение 3 сут после дачи вигисола. Фенбендазол полностью выводится из организма кабанов через 7 сут после лечения.

Ключевые слова: кабаны, нематоды, жидкостная хроматография, фенбендазол, остаточные количества.

В предыдущие годы была разработана лекарственная форма фенбендазола - вигисол для дегельминтизации кабанов при гельминтозах [1]. Препарат показал высокую эффективность при аскаридозе, метастронгилезе, эзофа-гостомозе и макраканторинхозе кабанов в условиях охотоведческих хозяйств. Однако для дальнейшего внедрения препарата в практику необходимы знания сроков выведения фенбендазола и его метаболита из организма кабанов с целью установления срока убоя и использования мяса после лечения кабанов. Для определения остаточных количеств фенбендазла и его метаболита -оксфендазола в органах и тканях животных используют в основном метод жидкостной хроматографии высокого давления с ультрафиолетовым детектированием [2-5].

Целью нашей работы явилось изучение сроков выведения остаточных количеств фенбендазола и его метаболита - оксфендазола из организма кабанов после обработки их вигисолом.

Материалы и методы

Изучение сроков выведения фенбендазола из организма кабанов провели на 12 головах в возрасте 9-13 мес. Вигисол - лекарственную форму фенбендазола задавали кабанам с кормом (овсом) однократно перорально в дозе 20 мг/кг по ДВ из расчета 100 г вигисола на 50 кг массы тела кабанов. Животных по 3 головы убивали через 1, 3, 5 и 7 сут после дачи препарата. Для исследований на содержание фенбендазола и его метаболита - оксфендазола после убоя кабанов брали кусочки печени, почек, мышечной и жировой ткани (околопочечной), легких, селезенки, сердца, а также кровь. До исследования пробы органов и тканей хранили в холодильнике при температуре - 20 оС.

104

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

Определение фенбендазола и его метаболита - оксфендазола в органах и тканях кабанов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. За основу взяли широко используемые методики экстракции и очистки проб [4, 5]. Параметры хроматографирования были подобраны в процессе работы с учетом особенностей имеющегося хроматографа, хроматографической колонки и реактивов.

Принцип метода основан на хроматографировании с использованием жидкостного хроматографа высокого давления с ультрафиолетовым детектором, обращеннофазовой колонки и программы «Мультихром» (версия 1.52) достаточного анализа количества экстрактов, полученных после экстракции этилацетатом проб сыворотки крови, печени, почек, сердца, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, очистки экстрактов в системе «ацетонитрил-гексан» и концентрирования очищенных экстрактов.

Для работы использовали необходимое оборудование, посуду и реактивы:

- стандарт фенбендазола с активностью 99,8 % («Jangsu Jabang Group»);

- стандарт оксфендазола с активностью 95,4 % («Jangsu Jabang Group»);

- жидкостной хроматограф высокого давления Hewlett Pacard 1090 A с УФ-детектором;

- хроматографическая обращеннофазовая колонка LUNA C18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм;

- весы лабораторные, ГОСТ 24104;

- рН-метр Hanna рН 213;

- вакуумный ротационный испаритель IKA RV 06 ML 1-B;

- центрифуга лабораторная ОПН-3;

- ультразвуковая ванна Branson B 8510 DTH;

- встряхиватель Elmi (Шейкер S-3.01);

- посуда мерная, лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770;

- углекислый аммоний двузамещенный А 9516 («Sigma»);

- Водный раствор аммиака 30 % 22,122-8 («Sigma-Aldrich»);

- Этилацетат х.ч., ГОСТ 22300-76 («Борис-Авогадро»);

- ацетонитрил, ч.д.а., ТУ 6-09-5497 («Криохром»);

- гексан, ч., ТУ 6-09-337578 («Мосреактив»).

Предварительно проводили подготовку оборудования к работе и готовили раствор элюента.

0,05 М раствор углекислого аммония (4,8045 г /100 мл воды) смешивали с ацетонитрилом в соотношении 65 : 35 и фильтровали через бумажный фильтр непосредственно перед использованием. Затем проводили подготовку хроматографа к анализу. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA C (250-4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм. После этого определяли хроматографические параметры стандартных образцов фенбендазола и оксфендазола и готовили растворы стандартных образцов фенбендазола и оксфендазола для построения калибровочного графика. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора доводили водой до метки. Полученная концентрация исходного раствора составила 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.

Затем определяли оптимальные хроматографические параметры, которые составили:

105

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

- обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм;

- элюент: ацетонитрил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношениях 35 : 65;

- скорость протекания элюента - 0,5 см3/мин;

- давление - 18,4 МПа;

- объем вводимой пробы - 50 мл;

- спектр УФ-волны - 290 нм.

В последующем готовили пробы к анализу. В образцы (сыворотки крови, печени, почек, сердце, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани) массой 1 г (сыворотки крови 1 мл) добавляли 10 см3 физиологического раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об./мин. Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар с льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали рН до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см3 этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1

ч. Для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об./мин. Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слой этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего выпаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 оС. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5-кратно порциями по 8 см3 гексана. Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50 оС. Сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром vs 1.52».

Для построения графика корреляции пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбендазола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3, приготовленных по схеме, приведенной выше.

Результаты и обсуждение

Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пи-ка/концентрация» представлены в таблице 1.

Таблица 1

Зависимость площади пика от концентрации

Площадь пика фенбендазола, mV х s Концентрация стандартного раствора фен-бендазола, мкг/см3 Площадь пика оксфендазола, mV х s Концентрация стандартного раствора оксфендазола, мкг/см3

902,011 10 827,903 10

415,208 5 388,412 5

224,653 2,5 203,146 2,5

89,785 1 78,235 1

106

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (R2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов, и следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов.

Содержание фенбендазола и оксфендазола (Y) в экстрактах рассчитывали по уравнению калибровки, полученному с помощью программы «Мультихром vs 1.52». Полученные значения корректировали с учетом уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола из сыворотки крови, печени, почек, сердца, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, а также коэффициента концентрирования проб.

Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола проводили на контрольных пробах. В сыворотку крови объемом см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой 5 г внесли по 1 см3 стандартного раствора фенбендазола и оксфендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешивали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3 (табл. 2, 3).

Таблица 2

Определение уровня извлечения фенбендазола

Концентрация фенбендазола, мкг/см3 Площадь пика стандарта фенбендазола, mV х s Проба Площадь пика фенбендазола в пробе, mV х s Уровень извлечения, Кэ

Сыворотка 325,184 0,78

Печень 377,035 0,91

Почки 348,004 0,84

Мышцы 306,481 0,74

5 415,208 Сердце 311,033 0,75

Легкие 385,216 0,93

Жировая 367,248 0,88

ткань

Селезенка 320,142 0,77

Таблица 2

Определение уровня извлечения оксфендазола

Концентрация оксфендазола, мкг/см3 Площадь пика стандарта оксфендазола, mV х s Проба Площадь пика оксфендазола в пробе, mV х s Уровень извлечения, Кэ

Сыворотка 304,277 0,78

Печень 346,144 0,89

Почки 341,820 0,88

Мышцы 326,158 0,84

5 388,412 Сердце 320,903 0,83

Легкие 340,652 0,88

Жировая 300,854 0,77

ткань

Селезенка 338,279 0,87

Пределы детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах определяли хроматографированием модельных проб с внесенными стандартными образцами различной концентрации. В результате получили следую-

107

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

щие значения пределов детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (табл. 4).

Таблица 4

Показатели пределов детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах тканей

Экстракт ткани Лимит детектирования, нг/г

фенбендазол оксфендазол

Сыворотка крови 10 нг/см3 15 нг/см3

Печень 10 10

Почки 10 10

Мышцы 10 10

Сердце 15 15

Легкие 15 15

Жир 10 10

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Селезенка 20 15

При помощи процедуры градуировки, выполненной в соответствующем разделе компьютерной программы «Мультихром vs 1.52», определили относительные коэффициенты отклика детектора для анализируемых экстрактов и получили следующие формулы расчета концентраций фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (табл. 5).

Таблица 5

Формулы расчета концентраций фенбендазола и оксфендазола в экстрактах тканей

Экстракт ткани Формула

фенбендазол оксфендазол

Сыворотка крови Y=0,0684573 х Х Y=0,0515566 х Х

Печень Y=0,0677122 х Х Y=0,0612401 х Х

Почки Y=0,0692222 х Х Y=0,0546498 х Х

Мышцы Y=0,0612250 х Х Y=0,0532932 х Х

Сердце Y=0,0579928 х Х Y=0,0621300 х Х

Легкие Y=0,0620158 х Х Y=0,0645628 х Х

Жир Y=0,0617087 х Х Y=0,0637852 х Х

Селезенка Y=0,0565277 х Х Y=0,0543179 х Х

Результаты, полученные при анализе экстрактов сыворотки крови, органов и тканей кабанов, представлены в таблицах 6 и 7.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее активный в антипаразитарном отношении метаболит фенбендазола - фенбендазол сульфоксид (оксфендазол) создает достаточно высокие концентрации в тканях печени и почек через 3 сут после окончания обработки.

Фенбендазол присутствует в органах и тканях, в основном, в начальные сроки (1-3 сут после обработки) в меньших количествах по сравнению с метаболитом.

Период полного выведения остаточных количеств фенбендазола, фен-бендазола сульфаксида из органов и тканей кабанов составляет 7 сут после окончания обработки.

108

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

Таблица 6

Содержание остаточных количеств оксфендазола в организме кабанов после обработки вигисолом

Орган, ткань Номер жи- Сроки отбора проб, сутки

нг/г вотного 1 3 5 7

Сыворотка 1 467,329 285,491 Но. Но.

крови, нг/см3 2 395,580 220,316 Но. Но.

3 492,645 247,085 Но. Но.

1 130,205 493,451 51,006 Но.

Печень 2 178,293 550,264 38,245 Но.

3 154,387 576,123 43,201 Но.

1 189,566 348,557 36,614 Но.

Почки 2 103,712 420,384 28,517 Но.

3 190,175 343,565 40,623 Но.

1 55,490 86,004 Но. Но.

Мышцы 2 46,752 83,278 18,329 Но.

3 53,051 78,602 Но. Но.

1 51,613 96,827 25,453 Но.

Сердце 2 48,247 85,481 32,005 Но.

3 54,802 99,022 Но. Но.

1 70,460 96,801 Но. Но.

Легкие 2 57,349 74,928 18,045 Но.

3 64,008 78,559 21,342 Но.

1 Н.о.* 67,635 21,425 Но.

Жир 2 Но. 48,824 26,068 Но.

3 Но. 52,116 25,504 Но.

1 38,412 135,279 26,391 Но.

Селезенка 2 30,499 127,530 31,465 Но.

3 33,534 131,469 22,176 Но.

* Н.о. - не обнаружено (концентрация ниже предела детектирования LOD).

Таблица 7

Содержание остаточных количеств фенбендазола в организме кабанов после обработки вигисолом

Орган, ткань, Номер жи- Сроки отбора проб, сутки

нг/г вотного 1 3 5 7

Сыворотка 1 265,015 56,382 Но. Но.

крови, нг/см3 2 238,416 54,361 Но. Но.

3 270,527 43,211 Но. Но.

1 480,419 172,036 Но. Но.

Печень 2 453,600 153,520 Но. Но.

3 491,730 160,275 Но. Но.

1 415,160 129,483 Но. Но.

Почки 2 393,424 116,231 Но. Но.

3 380,534 123,045 Но. Но.

1 38,037 46,544 Но. Но.

Мышцы 2 29,562 59,813 Но. Но.

3 34,011 65,747 Но. Но.

1 45,389 63,970 Но. Но.

Сердце 2 51,307 57,206 Но. Но.

3 48,628 69,013 Н.о. Н.о.

109

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

1 20,592 44,732 Но. Но.

Легкие 2 27,823 39,530 Но. Но.

3 34,258 35,258 Но. Но.

1 Но* 25,089 Но. Но.

Жир 2 Но. 31,425 Но. Но.

3 Но. 28,047 Но. Но.

1 48,625 34,825 Но. Но.

Селезенка 2 52,396 27,068 Но. Но.

3 42,000 21,260 Но. Но.

* Н.О. - не обнаружено (концентрация ниже предела детектирования LOD).

Литература

1. Архипов И.А., Архипова А.И., Кошеваров Н.И. // Рос. паразитол. журнал. - 2008. - № 1. - С. 82-92.

2. Ожигина С.Ф., Новик Т.С. // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1991. -Вып. 55. - С. 116-117.

3. Русаков С.В., Диденко П.П., Зуев Д.В. // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2006.- Т. 42. - С. 280-285.

4. DelatourP. // Vet. Res. Commun. - 1983. - V. 7, № 1. - P. 125-131.

5. Marriner S., Bogan J. // Vet. Parasitol. - 1980. - V. 108, № 1. - P. 177179.

The term of excreting of residual quantities of fenbendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol

S.V. Rusakov, N.B. Emeljanova, I.A. Arkhipov

The term of excreting of residual quantities of fenbendazole and it’s metabolite oxfendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol is investigated. The residual quantities of fenbendazole is definited by liquid chromatography a high pressure with UF-detection. Highest concentration of fenbendazole and oxfendazole in organs and tissues of wild-boar were during 3 days after treatment by vigisol. The drug excreted completely from the body of animals during 7 days after treatment.

Keywords: wild-boars, nematodes, liquid chromatography, fenbendazole, the residual quantities.

110

Российский паразитологический журнал, 2009, № 3

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.