УДК 615.9-057-092.259:612.112.3
ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ РЕАКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ
О. Г. Алексеева, А. П. Волкова
Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, Москва
Токсикологи нередко изучают фагоцитарную функцию нейтрофилов крови как один из показателей реакции организма на хроническое воздействие промышленных ядов (А. Т. Алданазаров; И. К. Атякина; Е. Н. Буркацкая; А. П. Волкова, 1959; Н. А. Жилова; А. И. Пахомы-чев; А. Ф. Стояновскв# и Т. В. Рассказова, М. М. Трошина). Используемые разными авторами методики, различные в деталях, в частности по объему фагоцитоза, в принципе однотипны: характеризуя интенсивность поглощения микробов фагоцитами, они не дают представления о фазе переваривания. Между тем завершенность фагоцитоза, т. е. переваривание поглощенных микробов, во многом определяет эффективность этой защитной реакции организма. Следует отметить, что после опубликования метода В. М. Бермана и Е. М. Славской стали с успехом изучать переваривающую функцию фагоцитов в области частной инфекционной, радиационной и космической иммунологии. Мы с аспирантом В. И. Терновым1 использовали этот метод при исследовании токсикологии радиоактивных веществ (А. П. Волкова, 1965).
Каждый, кто занимался изучением фагоцитарной реакции нейтрофилов крови в эксперименте, знает, как трудно подобрать фагоцитируемый штамм, ибо in vitro нейтрофилы мелких лабораторных животных почти совершенно не способны к фагоцитозу живых микробов. В поисках наиболее легко фагоцитируемого микроба ряд авторов обратился к исследованию фагоцитоза абсолютного сапрофита (И. К. Атякина; А. П. Волкова, 1959; Н. А. Жилова; А. И. Пахомычев) и даже вакцины (М. М. Трошина). Однако фагоцитирование абсолютно непатогенных тест-объектов полностью не характеризует защитную эффективность клеточного фактора иммунитета, так как интенсивность фагоцитоза зависит и от биологической активности самого микроба. При определении общей, в том числе и антиинфекционной, резистентности организма более логично применять живые культуры патогенных или условно патогенных микробов.
Для этого токсикологам нужен метод, при котором живая культура любого интересующего их вида микроба независимо от штамма могла бы быть использована в опытах на разных видах лабораторных животных, причем необходимо иметь возможность исследовать не только поглощение микроба, но и установить завершенность фагоцитоза. Последнее может быть достигнуто при использовании метода В. М. Бермана и Е. М. Славской. Однако этот метод не удовлетворяет первому требованию и, кроме того, не учитывает влияния на процесс фагоцитоза изменения резерва фагоцитов в организме, нередко наступающего при действии промышленного яда. Поэтому при модификации метода следует отказаться от коррекции числа фагоцитов в крови.
Тщательно анализируя метод В. М. Бермана и Е. М. Славской, мы заключили, что, внеся еще одно изменение, можно создать модификацию, более полно удовлетворяющую запросы токсикологов. Напомним, что по методу В. М. Бермана и Е. М. Славской поглотительная функция изучается так, как это принято вообще, и только для определения завершенности фагоцитоза применяют повторную двухчасовую инкубацию смеси на агаре.
1 Канд. дисс. М., 1964.
В ходе инкубации переваривание микробов не заканичвается еще лизисом и микроб сохраняет свою морфологию. Живые бактерии, готовясь к делению, образуют гигантские формы (см. рисунок). Авторы метода считают, что при инкубации на агаре идет лишь «проявление» жизнеспособности микробов, фагоцитированных при первичной инкубации в пробирке, и нового захвата бактерий фагоцитами на агаре не происходит.
На самом же деле нейтрофилы крови при инкубации на агаре сохраняют способность к миграции и захвату бактерий. Более того, поглощение микробов в культуре ней-трофилов на агаре идет значительно интенсивнее, чем в пробирке. На агаре фагоцитируются и те штаммы, которые при обычной методике практически не захватываются нейтро-филами мелких лабораторных животных (см. таблицу).
Из таблицы видно, что культуры всех 9 микробов на агаре активно фагоцитируются микрофагами всех видов животных. Следует указать, что при изучении фагоцитоза не на агаре, а в пробирке получены совершенно другие данные: в фагоцитозе участвовало не более 9—13% ней-трофилов и в среднем на каждый подсчитанный нейтрофил приходилось не более 0,2—0,3 микробов.
Отпечаток с агара при изучении фагоцитарной реакции нейтрофилов крови интактной крысы № 55 по отношению к кишечной палочке № 675.
В нейтрофиле и межклеточных пространствах видны гигантские живые бактерии и более мелкие и тонкие (обычный размер) убитые.
Характеристика поглотительной функции нейтрофилов крови мелких лабораторных животных при изучении фагоцитоза на сухом рыбном агаре производства Дагестанского института эпидемиологии и микробиологии (каждая цифра -среднее число из 3 опытов)
-- Нейтрофилы Кишечная палочка № 675 Брюшнотифозная палочка Ту, № 4446 Микрококк Т-5 Стафилококки Стрептококки
Лепин № 209 Лё 6204 № 5957 № 2432 № 2400
Кролика 70 62 60 78 88 56 92 54 40
1,32 2,12 1,74 10,0 5,76 2,58 8,42 2,92 1,8
Морской свинки 78 70 64 58 70 64 72 62 72
1,6 1,02 1,46 1,64 1,58 1,6 3,84 2,09 3,14
Мыши 77 68 94 84 76 53 82 80 62
1,49 1,32 5,04 6,96 3,88 1,48 7,46 7,36 3,64
Крысы 42 52 60 60 61 31 83 41 64
0,66 1,8 1,64 4,12 1,5 1,13 7,1 2,83 З73б
Примечание. Числитель—процент фагоцитирующих клеток, знаменатель—среднее число фагоцитированных микробов на 1 подсчитанный нейтрофил (фагоцитарный индекс).
Это наблюдение позволило отказаться от обычного мазка и учет поглотительной функции нейтрофилов крови проводить по отпечатку с агара. Однако первичную инкубацию в пробирке при исследовании фагоцитоза палочковидных бактерий мы оставили, с тем чтобы сохранить возможность одновременного изучения переваривающей функции плазмы, которая оценивается по проценту убитых в плазме микробов (подсчет в отпечатке 100—200 палочек в межклеточном пространстве и вычисление процента убитых из их числа).
Для фагоцитоза палочковидных бактерий рекомендуется следующая методика: 0,03 мл 5% раствора цитрата натрия смешивают в видалевской пробирке с 0,06 мл крови и 0,03 мл суспензии суточной агаровой культуры микроба на физиологическом растворе. Густота суспензии составляет 10 ед. (1 млрд. микробных тел в 1 мл). Смесь инкубируют в термостате при 37° в течение 10—15 мин., после чего делают мазок на питательный агар с рН 7,4, разлитый в чашки Петри, предварительно подсушенные в термостате в течение 30—40 мин. Мазки делают несколько толще, чем на стекле. Во избежание повреждения поверхности агара удобно передвигать шлифованное предметное стекло с каплей смеси в сторону приподнятого края стекла, т. е. обратно тому, как это делают, готовя мазок на стекле.
После инкубации с мазка делают отпечаток на хорошо обезжиренное предметное стекло. Для этого стекло осторожно накладывают на мазок, слегка прижимают пальцем для полного слипания с поверхностью агара, затем одну сторону стекла фиксируют большим пальцем, а вторую резко отрывают указательным пальцем той же руки. В этом случае отпечаток точно повторяет мазок и по внешнему виду похож на обычный мазок крови на стекле, клетки располагаются на нем в один слой и не деформированы. Фиксация и окраска отпечатков могут быть проведены любым способом, принятым в лаборатории при анализе формулы крови.
Методика изучения фагоцитоза кокковых форм микробов: объемные соотношения ингредиентов те же, густота суспензии культуры 20 ед. мутности (2 млрд. микробных тел в 1 мл). Инкубацию в пробирке можно не делать и смесь сразу же после добавления культуры переносить на агар. Инкубация на агаре продолжается 30 мин.
Большое значение для правильной трактовки и сопоставимости результатов имеет выбор критериев оценки изучаемой реакции. Между тем в разных работах по фагоцитозу можно найти самые различные показатели: фагоцитарное число, фагоцитарный показатель, фагоцитарный индекс, процент фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, активность фагоцитоза, микробная смесь, абсолютный показатель фагоцитоза и др. Причем один и тот же показатель нередко обозначают разными терминами: так, процент фагоцитирующих клеток называют фагоцитарным числом, процентом фагоцитоза и активностью фагоцитоза (Е. Н. Буркацкая; А. П. Волкова, 1965; А. И. Пахомычев; А. Ф. Стоянов-ский и Т. В. Рассказова; М. М. Трошина). А нередко авторы вообще не указывают, что именно подразумевают они под тем или иным показателем.
Анализ опыта других исследователей, в том числе микробиологов и патофизиологов, изучавших биологическую сущность фагоцитарной функции организма, а также собственный многолетний опыт работы в этой области позволяют нам рекомендовать некоторые критерии оценки фагоцитоза.
1. Поглотительная функция йейтрофилов крови в основном оценивается по интегральному показателю — фагоцитарному индексу, т. е. по среднему числу фагоцитированных микробов (М) на 1 подсчитанный нейтрофил (Ф):
фагоцитарный индекс = ~ .
Для понимания механизма изменения этого показателя можно вычислять 2 первичных показателя: процент фагоцитоза (процент клеток с фагоцитозом из общего числа подсчитанных нейтрофилов) и фагоцитарное число, т. е. среднее число фагоцитированных микробов (М) на 1 активный нейтрофил (Фа):
фагоцитарное число = ^ .
Поясним указанное примером.
По нашим данным, после однократной 4-часовой ингаляции ССЦ в концентрации 2 мг/л у крыс фагоцитарный индекс по отношению к кишечной палочке № 675 был равен 0,52±0,03, а при концентрации 0,2 мг/л он составил 0,66+0,04. За- счет чего же при большей дозе вещества была снижена поглотительная функция нейтрофилов крови? Подсчет показал, что фагоцитарное число при обеих концентрациях составляло 1,4, процент фагоцитоза при концентрации 2 мг/л был равен 37±2,9, а при концентрации 0,2 мг/л он составил 46±2,5. Следовательно, в угнетении поглощения повинно уменьшение числа активных клеток. При увеличении же концентрации вещества до 20 мг/л снижение фагоцитарного индекса до 0,37±0,02 обусловлено уменьшением процента фагоцитоза (27±1,3) и фагоцитарного числа (1,3±0,07).
2. Для оценки переваривающей способности нейтрофилов вычисляют процент переваривания, т. е. отношение числа убитых бактерий (М уб.) к общему числу фагоцитированных микробов (М)":
М уб. X 100
процент переваривания = —-.
Однако интенсивность переваривания тесно связана с поглотительной функцией: при одинаковом проценте переваривания абсолютное количество переваренных в фагоцитах микробов может быть различным в зависимости от напряженности фазы захвата. Для оценки этого явления вычисляют индекс переваривания, т. е. среднее число убитых микробов (М уб.) на 1 подсчитанный нейтрофил (Ф):
М уб.
индекс переваривания = —~—. Поясним сказанное примерами.
В упоминавшихся опытах с ССЦ при действии вещества в концентрации 0,2 и 0.02 мг/л процент переваривания был равен 18 (соответственно 18±4 и 18±1,5). Но неодинаковая выраженность фазы поглощения (фагоцитарный индекс 0,66±0,04 и 0,88±0,04) способствовала тому, что индекс переваривания, т. е. фактическая интенсивность защитной реакции при действии яда в большей концентрации, был ниже на 25% (0,12±0,02 и 0,16±0,01).
Крысы в течение 5 месяцев ежедневно подвергались 4-часовой ингаляции фура-ном в концентрации 0,02—0,05 мг/л. Процент переваривания к концу воздействия составил у них 26±4,2, а у контрольных крыс — только 19±2. Активаюпо переваривающей способности следует считать компенсаторной, ибо.'- ¡тоглотительная функция нейтрофилов была угнетена и составляла только 75% контрольной (фагоцитарный индекс 1,12±0,1 при 1,49±0,15 в контроле). Компенсаторная реакция достигла цели и индекс переваривания остался в норме (0,28±0,01 при 0,29±0,04 в контроле).
3. При действии ряда промышленных ядов изменяется число нейтрофилов в периферической крови, т. е. резерв фагоцитов. В этих случаях полезно вычислять абсолютные показатели фагоцитоза, т. е. абсолютное число фагоцитированных _ или переваренных микробов в 1 мм3 крови. Для этого необходимо в дополнение к фагоцитарным показателям знать абсолютное число нейтрофилов в 1 мм3 крови (Н), ибо абсолютный показатель поглощения равен НХфагоцитарный индекс, абсолютный показатель* переваривания равен НХ индекс переваривания.
В наших опытах крысы получали ежедневно энтералыю марганец-54 по 11,5 мкк/кг. Через месяц от начала опыта фагоцитарный индекс был равен 0,92±0,08, а индекс переваривания — 0,07±0,005, у контрольных животных соответствующие показатели составляли 1,28±0,01 и 0,19±0,002. Таким образом, у подопытных животных наблюдалось умеренное угнетение поглотительной и выраженное снижение переваривающей 4>УН1<ЧИИ нейтрофилов крови. Однако напряженность клеточного фактора иммунитета была в пределах нормы: абсолютный показатель поглощения составлял 165% контроля (4195±750), а абсолютный показатель переваривания был снижен только на 32% (300±60). Это явление было обусловлено компенсаторным нейтрофи-лезом: у опытных крыс было 4460 нейтрофилов в 1 мм3 крови при 2045 нейтрофилов у у контрольных животных.
Следовательно, вычисление ряда показателей фагоцитарной реакции позволяет установить функциональную полноценность гранулоцитов и состояние резистентности организма, а вместе с тем одновременно выявить резервы компенсации.
Выводы
1. Модификация метода В. М. Бермана и Е. М. Славской позволяет определять поглотительную и переваривающую функцию крови различных видов лабораторных животных по отношению к живой культуре любого микроба.
2. Рекомендуемые показатели фагоцитарной реакции дают возможность оценивать не только функцию нейтрофилов, но и эффективность клеточного фактора иммунитета, выявляя при этом компенсаторные способности организма.
ЛИТЕРАТУРА
А л да Назаров А. Т. Труды Ин-та краевой патологии АН Казахск. ССР, 1956, т. 4, с. 42. — А т я к и н а И. К. Гиг. и сан., 1959, № 10, с. 26. — Б е р м а н В. М., Слав-екая Е. М. Ж. микробиол., 1958, № 3, с. 8. — Берман В. М. В кн.: Современные проблемы иммунологии. Л., 1959, с. 9. — Буркацкая Е. Н. Тезисы докл. научной сессии, посвящ. вопросам медицинского обслуживания рабочих химической промышленности. Горький, 1959, с. 83. — Волкова А. П. Гиг. и сан., 1959, № 1, с. 80.— Волкова А. П. В кн.: Материалы по токсикологии радиоактивных веществ. М., 1965, в. 5, с. 96. — Жи лова Н. А. Гиг. и сан., 1959, № 12, с. 18. — П а х о м ы ч е в А. И. Гиг. и сан., 1960, № 11, с. 77. — С т о я н о в с к и й А. Ф., Рассказов а Т. В. Там же, 1961, № 10, с. 70.
Поступила 19/1V 1965 г.
УДК в14.87в-07|.»1.074
РЕГИСТРАЦИЯ у-ИЗЛУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНОЙ ЭНЕРГИИ АППАРАТУРОЙ, ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В САНИТАРНОЙ ПРАКТИКЕ
И. П. Коренков Радиологическая лаборатория Московской городской санэпидстанции
Многие предприятия и учреждения Москвы используют в своей работе различные у-источники. При санитарно-дозиметрическом обследовании таких предприятий и учреждений необходимо использовать эффективную радио- и дозиметрическую аппаратуру и знать ошибки измерения, допускаемые .ею во время регистрации у-излучения различной энергии. Ошибки эти могут быть весьма значительны, так как вся аппаратура, используемая в санитарной практике, градуируется, как правило, по у-излучению Со60.
Нами в данной работе определены ошибки измерения мощности дозы у-излучения с энергией от 0,145 до 1,25 Мэв следующими приборами: ДКЗ-2М с ионизационными камерами из плексигласа и капро-лактама, РК-0,1 с газоразрядными счетчиками и «Кристалл» (со сцин-тилляционным кристаллом). Некоторые приборы уже не выпускаются промышленностью, однако ими еще оснащены все санэпидстанции и они наиболее часто используются в повседневной работе. Поэтому мы произвели оценку правильности показания этих приборов при регистрации мощности дозы у-излучения различной энергии. В качестве источников такого излучения использовали Се141 (Е = 0,145 Мэв), ^203 (Е = 0,279 Мэв), Сэ137 (Е = 0,661 Мэв), 2т95 (Е = 0,754 Мэв) и Со60 (Е = 1,25 Мэв) Для каждого прибора строили кривую «хода с жестко-
1 Градуировку производили на одном из московских предприятий. Ввиду того что источники у-излучения Се141 и ^203 промышленностью серийно не выпускаются, их приготовляли из растворов, а дозиметрические характеристики этих источников определяли с помощью поверочной аппаратуры (КД-1 и РП-1). ,
. Юниэационнь/и том
и
¿.О
¿5
<1отн ед)
4*-
0,6 1,0 1,и
Знергил / *6анто$ ( 3
Кривые «хода с жесткостью» дозиметров ДКЗ-2М. / — с капролактамовой камерой: // — с плексигласовой камерой.