Научная статья на тему 'Изучение энтомопатогенного гриба М. Anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов'

Изучение энтомопатогенного гриба М. Anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
724
200
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Штерншис Маргарита Владимировна, Малярчук Анастасия Александровна, Гулий Владимир Васильевич

В качестве характеристики биологического ресурса коллекционных штаммов и морфоваров Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. изучена активность протеазы, липазы, хитиназы, амилазы и эстеразы наряду с устойчивостью к ультрафиолетовому облучению (УФО). Изолят гриба с наибольшей вирулентностью имеет самые высокие показатели ферментативной активности и устойчивости к УФО. Частичную защиту от УФО обеспечивает антиоксидант тирозол.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Study of entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as biological resource for biocontrol of phytophagous insects

The activity of protease, lipase, chitinase, amylase and esterase of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. strains and its morphotypes together with stability to ultraviolet radiation (UVR) was studied as a characteristics of M. anisopliae biological resource. Fungal isolate with the most value of virulence also appeared to have the highest indexes of enzyme activity and stability to UVR. Antioxidant Tyrosol provided the protection to UVR partly.

Текст научной работы на тему «Изучение энтомопатогенного гриба М. Anisopliae как биологического ресурса для биоконтроля насекомых-фитофагов»

М.В. Штерншис, А.А. Малярчук, В.В. Гулий

ИЗУЧЕНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА M. Anisopliae КАК БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕСУРСА ДЛЯ БИОКОНТРОЛЯ НАСЕКОМЫХ-ФИТОФАГОВ

В качестве характеристики биологического ресурса коллекционных штаммов и морфоваров Metarhizium anisopliae (Metsch.)

Sor. изучена активность протеазы, липазы, хитиназы, амилазы и эстеразы наряду с устойчивостью к ультрафиолетовому облучению (УФО). Изолят гриба с наибольшей вирулентностью имеет самые высокие показатели ферментативной активности и устойчивости к УФО. Частичную защиту от УФО обеспечивает антиоксидант тирозол.

Естественными регуляторами численности насекомых в природе являются энтомопатогенные микроорганизмы, в том числе грибы. Этот биологический ресурс обеспечивает использование природных энтомо-патогенов как основы биологических препаратов для защиты растений от фитофагов-насекомых. Энтомопа-тогенный гриб Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. был впервые выделен И.И. Мечниковым из погибших в природных условиях жуков рода Anisoplia и предложен им для размножения на питательных средах и дальнейшего использования биомассы гриба как экологически безопасного средства защиты растений. Этот факт признается во всем мире как начало микробиологического метода защиты растений [1]. Однако недостаток знаний не позволил длительное время производить и использовать препарат на основе этого гриба. В последние годы коллективом ученых нескольких стран разработан препарат на основе M. anisopliae var. ac-ridum, который успешно используется в ряде регионов мира для контроля численности саранчовых [2]. В России препараты на основе гриба M. anisopliae не зарегистрированы.

Для разработки биологического препарата, способного заменять синтетические химические инсектициды, необходимо детальное изучение биологического ресурса M. anisopliae в целях рационального использования его в биологическом контроле численности насекомых-фитофагов. Известно, что одним из возможных механизмов, обусловливающих изменение вирулентных свойств энтомопатогенных грибов, может быть спонтанная изменчивость [3-6]. Процессы спонтанной изменчивости периодически происходят в природных агроценозах, поэтому изучение этих процессов способно прояснить механизмы возникновения эпизоотий в популяциях насекомых, во время которых наиболее ярко проявляется биологический ресурс гриба, играющего важную роль в сохранении биоразнообразия экосистем.

Ранее было показано, что морфовары, полученные при спонтанной изменчивости двух коллекционных штаммов Р-72 и 85-69р гриба M. anisopliae, отличаются по структуре колоний и цвету воздушного мицелия [7]. Коллекционные штаммы при моноспоровых рассевах четко дифференцировались на 2 морфологических подтипа каждый. При этом выделенные варианты имели различную структуру, цвет колоний и интенсивность спороношения. С точки зрения рационального использования биологического ресурса важно, что морфовары с пушистой структурой колоний (Р-72-1 и 85-69р-1) обладали более высокой инсектицидной активностью, чем морфовары с порошистой структурой колоний (Р-72-2 и 85-69р-2). Для более полной оценки биологического ресурса выделенных морфоваров гриба пред-

ставляет интерес изучение и других их биологических особенностей, в частности ферментативной активности и восприимчивости к ультрафиолетовому облучению, что и явилось целью настоящей работы.

Объекты и методы исследования

В работе использованы музейные штаммы Р-72 и 85-69р гриба Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sor. из коллекции Института систематики и экологии животных СО РАН. Морфовары Р-72-1, Р-72-2, 85-69р-1 и 85-69р-2 получены путем спонтанной изменчивости коллекционных штаммов [7]. Культуры грибов поддерживали методом периодических пересевов на среде Сабуро в пробирках на скошенном агаре. Пробирки с грибами хранили при +5±1°С, пересев на свежие питательные среды осуществляли через каждые 6 месяцев. Для наработки спорового материала, используемого в экспериментах, грибы выращивали на пшене, подготовленном согласно рекомендациям Е. А. Никольской [8].

Определение активности протеазы, липазы и амилазы проводили по методике, описанной В.В. Смирновым с соавт. [9]. Для измерения активности хитиназы использовали расщепление хитина до N-ацетил-глюкозамина [10]. Активность эстеразы измеряли по известной методике [11].

В экспериментах по УФО суспензии спор тонким слоем толщиной 0,1 мм разливали в стерильные чашки Петри диаметром 9 см. Затем чашки помещали на расстоянии 10 см от источника УФО и снимали крышки в момент включения секундомера. Облучение вели в стационарном состоянии в темном боксе. В качестве источника УФО использовали бактерицидную лампу низкого давления TUV-30W, ДБ-30 с длиной волны 253,7 нм. Через заданные промежутки времени чашки закрывали крышками и облученные конидии высевали методом последовательных разведений на поверхность среды Сабуро. Облучение проводили через промежутки времени: 1, 3, 5, 7 и 10 мин. Антиоксидант тирозол предоставлен Новосибирским институтом органической химии СО РАН.

Полученные данные обрабатывали методом однофакторного дисперсионного анализа с расчетом наименьшей существенной разности (НСР05).

Результаты и их обсуждение

Изучение ферментативной активности изоля-тов. Отличительная особенность энтомопатогенных грибов от энтомопатогенов вирусной или бактериальной природы состоит в способности проникать в организм насекомых через кутикулу. В составе кутикулы

содержатся белки, хитин и липиды, поэтому для преодоления этого барьера энтомопатогенные грибы должны обладать соответствующей ферментативной активностью. В ряде работ продемонстрирована корреляция ферментативной активности с культуральноморфологическими признаками и, что особенно важно, с вирулентностью грибов, в том числе M. anisopliae [12-15]. Отбор изолятов с повышенной продукцией гидролитических ферментов (протеазы, липазы, хити-

назы, эстеразы и др.) может оказаться более эффективным, чем отбор по культурально-морфологическим признакам. Этот биохимический критерий важен для оценки штаммов и морфоваров энтомопатогенного гриба как биологического ресурса.

Нами изучена ферментативная активность коллекционных штаммов и отобранных морфоваров энтомо-патогенного гриба M. anisopliae. Результаты представлены в таблице.

Ферментативная активность коллекционных штаммов и морфологических вариантов М. анморИав

Штамм Ферментативная активность

Протеазная* Эстеразная** Липазная* Амилазная* Хитиназная**

Р-72 5 0,38 3 17 61

Р-72-1 12 0,78 11 24 80

Р-72-2 4 0,11 3 8 23

85-69р 4 0,08 3 10 25

85-69р-1 7 0,08 6 12 20

85-69р-2 4 0,05 4 9 21

НСР05 2 0,05 2 2 2

Примечание. * - зона лизиса специфического субстрата, мм; ** - единицы активности в 1 мл культуральной жидкости.

Результаты показали, что морфологически разные варианты отличаются и по ферментативной активности. Среди них есть варианты как с повышенной по отношению к родительским штаммам, так и с пониженной ферментативной активностью. Так, например, более высокие показатели по всем видам ферментативной активности оказались у варианта Р-72-1 по сравнению с Р-72: протеолитическая активность превышала аналогичную родительского штамма в 2,4 раза, эсте-разная активность - в 2,1, липазная - в 3,7, амилазная -в 1,4 и хитиназная - в 1,3 раза. Что касается штамма 85-69р и его морфоваров, то резкое увеличение активности наблюдали у 85-69р-1 по сравнению с исходным штаммом только в отношении протеаз (в 1,8 раза) и липаз (в 2 раза). Согласно данным, представленным в литературе [16, 17], для проявления инсектицидной активности большее значение имеет протеаза по сравнению с хитиназой, ей принадлежит главенствующая роль в ранней стадии проникновения гриба M. ani-sopliae через кутикулу насекомых. По результатам, приведенным в таблице, для морфоваров с пушистой структурой колоний повышение протеолитической активности преобладает над повышением хитинолити-ческой активности по сравнению с исходными штаммами. Обращает на себя внимание резкое увеличение липазной и эстеразной активности при переходе от штамма Р-72 к морфовару Р-72-1. Это означает, что данный морфовар может быть более активным для видов насекомых с высоким содержанием липидов в кутикуле. Более высокая эстеразная активность морфова-ра Р-72-1 с учетом его более высокой вирулентности [7] указывает на возможное ускорение патологического процесса при развитии микоза хозяина-мишени, инфицированного этим морфоваром. Разница в амилазной активности особенно четко проявляется у двух морфо-варов Р-72-1 и Р-72-2, имеющих пушистую и пороши-стую структуру колоний соответственно. Судя по всем абсолютным значениям ферментативной активности, наибольший интерес с точки зрения биологического ресурса в отношении регуляции численности фитофа-

гов представляет морфовар Р-72-1. Это объясняется, прежде всего, тем, что энтомопатогенные грибы должны преодолевать барьер в виде кутикулы насекомых, содержащей белок, липиды и хитин, что требует проявления грибом как минимум протеазной, липазной и хитиназной активности.

Восприимчивость М. anisopliae к ультрафиолетовому облучению. Энтомопатогенные грибы, являясь компонентом природных биоценозов, подвергаются как положительному, так и отрицательному влиянию различных абиотических факторов окружающей среды (температуры, влажности, солнечной радиации и др.) [18-20]. Для повышения биологического ресурса микроорганизмов, используемых в качестве регуляторов численности насекомых, необходимо защищать их от отрицательного влияния факторов окружающей среды. Признанным фактором отрицательного влияния на энтомо-патогенные грибы, являющимися как естественными, так и привнесенными компонентами биоценозов, считается солнечная радиация (УФО), действие которой приводит к снижению жизнеспособности и вирулентности спор [21-23]. Солнечная радиация, главным образом ультрафиолетовое излучение, - самый мощный фактор инактивации энтомопатогенных грибов при сохранении их во внешней среде. Показано, что под влиянием УФО лизис биополимеров, составляющих мембрану живой клетки, протекает через стадию образования свободных радикалов [24]. В связи с этим для защиты клеток, в том числе спор энтомопатогенных грибов, актуально использование антиоксидантов, ингибирующих или полностью предотвращающих образование свободных радикалов и таким образом защищающих споры от вредного воздействия солнечного света. При этом, соответственно, сохраняются более длительное время вирулентные свойства энтомопатогенов при внесении их в биоценозы. Поэтому нами проведены эксперименты по УФО коллекционных штаммов и их морфоваров, в том числе с добавлением антиоксиданта тирозола. Данные по УФО M. anisopliae представлены на рис. 1-4.

Рис. 3. ВлияниеУФО на титр жизнеспособных спор М. атйорИае штаммаР-72 и его морфоваров без добавления антиоксиданта

% жизнеспособных спор

I

<1

ы

е

о

° I

й "О

° ¡*2 р я

03 СО

й а

я> о аз 2 к я

я> о

к

■а

р

а

к

к

00

00

£

о

£

м

о

о\

X

о

X

^3

|-9-

% жизнеспособных спор

% жизнеспособных спор

а

й

к

эд

к

к

гь

к ^ 2 в о О 2 ЕС О

^3 н ►8- к о д и Ъ

■8 * О §

и Ш

0\ гь сь о м я й о о

р 2* ю я й Е

2 х

Я ^

ь л

р ^5

х &?

Е

й

2

2

00

и>

I

С\

43

00

и>

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

I

00 и>

1

о\

43

ГО

43

л

о

о\

X

о

я

100

а

о

С

о

§

Л

К

ю

о

о

о

с

о

к

ет

S

й

80 --

60 --

40 --

20 -

0

I I I I I Г

1 3 5 7 10

Время облучения, мин

□ Р-72 □ Р-72-1 □ Р-72-2

Рис. 4. Влияние УФО на титр жизнеспособных спор М. атзорНав штамма Р-72 и его морфоваров с добавлением тирозола в концентрации 0,15%

Результаты опытов показали, что при жестком модельном УФО жизнеспособность конидий коллекционных штаммов и их морфоваров резко снижается. Так, через 1 мин после УФО осталось около 60% для штамма 85-69р и его морфоваров (рис. 1) и около 80% от первоначального количества конидий штамма Р-72 и его морфоваров (рис. 3). Через 3 мин в первом случае произошло снижение жизнеспособности спор не менее, чем в 5 раз, а во втором - не менее чем в 2,5 раза. Почти не осталось жизнеспособных спор через 5 и 7 мин соответственно для двух штаммов. Это означает, что восприимчивость к УФО более высока для коллекционного штамма 85-69р и его морфоваров по сравнению с Р-72 с соответствующими морфоварами. С другой стороны, выявились и некоторые различия в устойчивости исходных штаммов и мор-фоваров с разной структурой колоний. Так, через 1 мин после УФО осталось 80% жизнеспособных конидий мор-фовара Р-72-1 с пушистой структурой и лишь 63% мор-фовара Р-72-2 с порошистой структурой. Однако в случае морфоваров штамма 85-69р эти различия несущественны. При добавлении антиоксиданта наблюдали частичный защитный эффект от УФО (рис. 2, 4). Например, для Р-72 без антиоксиданта через 7 мин после УФО практически не оставалось жизнеспособных конидий, а с добавлением антиоксиданта сохранялось около 10%. Аналогичная ситуация наблюдалась для морфовара 85-69р. Через 5 мин облучения без антиоксиданта происходило полное разрушение конидий, а с его добавлением - сохранялось 16-

20%. Это свидетельствует о необходимости скрининга более разнообразного спектра антиоксидантов с использованием их разных концентраций как протекторов от УФО. В то же время следует отметить, что изучаемый антиоксидант оказался более эффективным для защиты штамма гриба, который более восприимчив к УФО (в данном случае 85-69р).

Результаты, полученные в данной работе, показали, что разные величины вирулентности штаммов и мор-фоваров энтомопатогенного гриба М. апг^орНав, продемонстрированные ранее [7], зависят не только от культурально-морфологических признаков, но связаны также с ферментативной активностью, в первую очередь с протеазной, липазной и хитиназной. Наиболее высокая ферментативная активность по всем показателям наблюдалась у изолята Р-72-1, обладающего самой высокой инсектицидной активностью.

Этот же изолят М. апг^орНав показал наибольшую, по сравнению с остальными, устойчивость к ультрафиолетовому облучению, что важно для сохранности энтомопатогенных грибов в окружающей среде.

Полученные результаты дополнили знания по характеристике энтомопатогенного гриба М. апг^орНав как биологического ресурса, используемого в биологической регуляции численности насекомых-фитофагов. Эти данные следует учитывать при разработке биопрепаратов на основе энтомопатогенного гриба, а также при мониторинге естественных эпизоотий насекомых.

ЛИТЕРАТУРА

1. Lord J.C. From Metchnikoff to Monsanto and beyond: The path of microbial control / J.C. Lord // J. Invertebr. Pathol. - 2005. Vol. 89. - P. 19-29.

2. Lomer C.J. Biological control of locusts and grasshoppers / C.J. Lomer, R.P. Bateman, D.L. Johnson, J. Langewald, M. Thomas // Annu. Rev, Ento-

mol. - 2001. - Vol. 46. - P. 667-702.

3. Алешина О.А. Основные критерии для отбора гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. для производственных целей / О.А. Алешина,

С.Н. Ильичева, Э.В. Кононова, Н.А. Коляда // Микология и фитопатология. - 1972. - Т. 8. - С. 341-344.

4. Огарков Б.Н. Энтомопатогенные грибы Восточной Сибири / Б.Н. Огарков, Г.Р. Огаркова. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 2000. - 134 с.

5. ГештовтН.Ю. Энтомопатогенные грибы (биотехнологические аспекты) / Н.Ю. Гештовт. - Алматы, 2002. - 288 с.

6. Митина Г.В. Влияние биохимических и морфолого-культуральных особенностей природных изолятов Verticillium lecanii (Zimn.) Viegas на

вирулентность в отношении личинок оранжерейной белокрылки / Г.В. Митина, Г.Е. Сергеев, В.А. Павлюшин // Микология и фитопатология. - 1997. - Т. 31. - С. 57-64.

7. Serebrov V. Spontaneous variability of Metarhizium anisopliae strains as an approach for enhancement of insect activity / V. Serebrov, A. Maljarchuk,

M.V. Shternshis // Plant Sci. (Sofia). - 2007. - Vol. 44. - P. 244-247.

8. Никольская Е.А. Культивирование микроскопических грибов / Е.А. Никольская // Методы экспериментальной микологии. - Киев: Наукова

думка, 1982. - С. 106-137.

9. Смирнов В.В. Спороообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И. А. Ва-

силевская. - Киев: Наукова думка, 1982. - 280 с.

10. St. Leger R.G. Entomopathogenic isolates of Metarhizium anisopliae and Aspergillus flavus produce multiple extracellular chitinase isosymes / R.G. St. Leger, R.C. Staples, D.W. Roberts // J. Invertebr. Pathol. - 1993. - Vol. 61. - P. 81-84.

11. Staeudinger M. Esterase. VIII. Histochemische elerophoretishe und quantitative Untersuchungen zum einfluss von phenobarbital auf die / M. Staeudinger, O. Diemling, C. Grossarth, T. Wienker // Histochemie. - 1973. - Hbd. 37. - S. 107-116.

12. Павлюшин В.А. Ферментативная активность и вирулентность энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. / В.А. Павлюшин // Микология и фитопатология. - 1977. - Т. 11. - С. 283-289.

13. Xia Y. Tregalose hydrolyzing enzymes of Metarhizium anisopliae and their role in pathogenesis of the tobacco hornworm / Y. Xia, J.M. Clarkson,

A.K. Charnley // J. Invertebr. Pathol. - 2002. - Vol. 80. - P. 139-147.

14. Charnley A.K. Fungal pathogens of insects: cuticle degrading enzymes and toxins / A.K. Charnley // Adv. Botan. Res. - 2003. - Vol. 40. - P. 241321.

15. Jarrold S.L. The contribution of surface waxes to pre-penetration growth of an entomopathogenic fungus on host cuticle / S.L. Jarrold, D. Moore, U. Potter, A.K. Charnley // Mycol. Res. - 2007. - Vol. 111. - P. 240-249.

16. Kang S.C. Purification and characterization of a novel chitinase from entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae / S.C. Kang, S. Park,

D.G. Lee // J. Invertebr. Pathol. - 1999. - Vol. 73. - P. 276-281.

17. St. Leger R.G. Ambient p His a major determinant in the expression of cuticle-degrading enzymes and hydrophobin by Metarhizium anisopliae

/ R.G. St. Leger, L. Joshi, D. Roberts // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 709-713.

18. Громовых Т.И. Энтомопатогенные грибы в защите леса / Т.И. Громовых. - Новосибирск: Наука, 1982. - 80 с.

19. Shah P.F. Natural levels of fungal infections in grasshoppers in Nothern Benin / P.F. Shah, I. Godonou, C. Gbongboui, C.J. Lomer // Biocontrol Sci

Technol. - 1994. - Vol. 4. - P. 331-341.

20. Vanninen I. Persistence of augmented Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in Finnish agricultural soils / I. Vanninen, J. Tyni-Juslin, H. Hokkanen // Bio Control. - 2000. - Vol. 45. - P. 201-222.

21. Hunt T.R. Effect of sunscreen, irradiance and resting period on the germination of Metarhizium flavoviride conidia / T.R. Hunt, D. Moore, P.M. Higgins, P.M. Prior // Entomophaga. - 1994. - Vol. 39. - P. 313-322.

22. Inglis G.D. Influence of ultraviolet light protectants on persistence of the entomopathogenic fungi / G.D. Inglis, M.S. Goettel, D. Johnson // Biological Control. - 1995. - Vol. 5. - P. 581-590.

23. Moore D. Ultra-violet radiation damage to Metarhizium flavoviride conidia / D. Moore, P.D. Bridge, P.M. Higgins, R.P. Bateman, C. Prior // Annals

Appl. Biol. - 1993. - Vol. 122. - P. 605-616.

24. Фут Ф. Фотосенсибилизированное окисление и синглетный кислород / Ф. Фут // Свободные радикалы в биологии. - М.: Мир, 1979. -Т. 2. - С. 96-150.

Статья представлена научной редакцией «Биология» 19 мая 2008 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.