Изучение экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) в плоскоклеточном раке гортани Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Изучение экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММП-2 И ММП-9) в плоскоклеточном раке гортани

Р. Н. Кулагин3, С. В. Петров'■2

Место работы: 'ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздрав России, Казань, Россия; 2Приволжский филиал РОНЦ им. Н. Н. Блохина, Казань, Россия; 3ГАУЗ «ГКБ№7», Казань, Россия. e-mail: rnkulagin@yandex.ru

Цель. Исследовать экспрессию матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) в плоскоклеточном раке гортани и изучить ее связь с некоторыми клинико-морфологическими показателями и прогнозом заболевания. Материалы и методы. Использовались парафиновые блоки архивного материала, полученного от 201-го больного за период с 2000 по 2009 г., с дальнейшим изготовлением восьми ТМА-мультиблоков (технология tissue microarray) и оцифровкой микропрепаратов на сканере Mirax MIDI (Carl Ziess). Для иммуногистохимического исследования использовалось антитела против ММП-2 (MMP-2, 72kDa Collagenase IV, разведение 1:50, Clone VB3, LabVision Corp.) и ММР-9 (MMP-9, 92kDa Collagenase IV, разведение 1:35, LabVision Corp.).

Для визуализации применяли систему детекции UltraVision с DAB Plus хромогеном (LabVision Corp.). Результаты. Распределение по клиническим стадиям следующее: I-я — 7 случаев, II — 56, III — 95, IV — 43. Больных с опухолями, имеющими степень дифференцировки G1, было 60, G2-54, G3-83. Метастазы в регионарные лимфатические узлы отмечены в 45 случаях (22,4%). Цитоплазматическая экспрессия ММР-2 обнаружена в 47,2%, а ММР-9 — в 35% (в 95-ти и 70-ти случаях, соответственно). Пятилетняя выживаемость в исследуемой группе составила 46,7% (94 случая), а рецидивы обнаружены в 7,9% (16 случаев). В низкодиф-ференцированных опухолях (G3) наблюдается достоверное снижение экспрессии исследуемых маркеров по сравнению с высокодифференцированными (G1) (р<0,002). Нами обнаружено, что в группе больных (III IV) клинических стадий статистически увеличивается экспрессия ММР-2 по сравнению с начальными клиническими стадиями (I—II) (р<0,001). При увеличении размера опухоли (T-стадия) наблюдалось увеличение экспрессии маркера без статистических различий, однако, у пациентов групп Т3 Т4 экспрессия ММР-2 статистически выше, чем у больных Т1 Т2 (р<0,05). У больных с метастазами и рецидивами экспрессия ММР-2 была выше, а ММР-9 — ниже, но без статистических различий (р>0,05). Мы не выявили связи между 5-летней выживаемостью, локализацией опухоли в гортани и возрастом больных и экспрессией изучаемых маркеров.

Заключение. Таким образом, при прогрессии плоскоклеточного рака гортани наблюдается увеличение уровня экспрессии ММР-2, а уровень ММР-9 — снижается.

Взаимодействие клеток асцитной карциномы Эрлиха с анионными липосомами

О. М. Алексеева', Ю. А. Ким2

Место работы: 'Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН. Москва. Россия; 2Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская обл., Россия e-mail: olgavek@yandex.ru

Исследовали взаимодействие клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) с анионными липосомами как вероятными транспортерами лекарственных веществ в клетки карциномы.

Цель. Подбор условий для слияния отрицательно заряженных липосом с отрицательно заряженной мембраной клеток АКЭ и определение вида распределения липосомальных фос-фолипидов на мембране и внутри клетки. Материалы и методы. Флуорофоры N-NBD-PE (N- (7-нитро-бенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) фофсфатидилэтаноламин) и N-Rh-PE (N- (лиссамин родамин В сульфонил) фосфати-дилэтаноламин) «Avanti»; NaCl, HEPES «Sigma»; ПЭГ-300 «The British Drug Hourses Ltd». Клетки АКЭ получали из инъецированных АКЭ мышей через 7—8 дней. Отмывали двукратным осаждением в среде Хенкса с 20мМ HEPES (рН 7,4). Большие однослойные липосомы 1000 Ä, сформированные из пальмитоилолеоилфосфатидилхолина, пальмитоилолео-илфосфатидилсерина и холестерина (2:2:1), получали методом упаривания обратной фазы в среде 100 мМ NaCl и 10 мМ HEPES (рН 7,4). Эфирно-водно липидную фазу интенсивным встряхиванием на вибрационном смесителе 30гц 30 мин до образования однородной эмульсии. Затем упаривали воду под вакуумом, освобождали от эфира, и пропускали через поликарбонатную мембрану-фильтр с порами диаметром 0,1—0,2 мкм для экструзии.

Флуоресцентные фосфолипидные метки N-NBD-PE (N- (7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил) фофсфатидилэ-таноламин) и N-Rh-PE (N- (лиссамин родамин В сульфонил) фосфатидилэтаноламин) вносили тонкой струей шприцом «Hamilton» в первоначальную смесь в концентрации 1 моль%. Липидные дисперсии пропускали через колонки с сефадек-сами G 15, G 25 и сефарозой B 2. Конечная концентрация липидов в дисперсиях 10 мМ. Флуоресцентномеченые липо-сомы содержали по 400—500 молекул флуорофора. Хранились при 50 C.

Флуоресценцию и кинетики слияния регистрировали на спектрофлуориметре «Perkin-Elmer — MPF 44B» при 370 С и постоянном перемешивании. Длины волн возбуждения и излучения соответственно для N-NBD-флуоро-фора 470нм и 530 нм и для родамин В-флуорофора 470 нм и 577 нм. Фузию и эндоцитоз липосом отслеживали с помощью конфокального лазерного микроскопа «LSM 510 NLO» (Carl Zeiss) с аргоновым и гелий-неоновым лазерами с длинами волн возбуждения 488 нм и 543 нм соответственно. Регистрировали в трех каналах

Результаты. Было показано, что в определенных условиях происходит спонтанное слияние мембран липосом с мембранами клеток АКЭ. Полиэтиленгликоль ПЭГ 300 (15%) действует, как фузоген, а низкое значение pH среды инкубации (5,65) снижает заряженность липосом и клеток, что инициирует слияние мембран липосом из анионных липидов с мембранами клеток асцитной карциномы Эрлиха. Для исследования слияния липосом с клетками АКЭ применили флуоресцентный метод регистрации кинетики слияния. С помощью метода резонансного переноса энергии между меченым (N-NBD) фосфолипидом-донором и меченым (родамин В) фосфолипидом-акцептором обнаружили, что флуоресценция донора не тушится в липосомах в присутствии клеток АКЭ, т. е. перенос энергии снижается. Это происходит из-за встраивания меченных фосфолипидов в мембрану клеток и, соответственно, из-за разбавления концентрации флуорофоров, ведущее к увеличению дистанции между донором и акцептором, и затруднению переноса энергии. На этом этапе были подобраны оптимальные условия слияния липосом с клетками рН 5,65 и концентрация ПЭГ 30010%. Клетки перед опытом хранились при 50С в анаэробных условиях, в результате этого получили метаболическое истощение и увеличили проницаемость мембран.

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org