CC BY
0УДК 611.81.013
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И РОЛИ ГЕНА SPOUT1 В РАЗВИТИИ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА
DOI 10.24412/CL-37228-2024-53-55
А. Е. Филатьева1, П. Е. Анисимова1, Н. Н. Митина1, Р. Маруфиан2, В. С. Тарабыкин3, Е. В. Кондакова1
'Научно-исследовательский институт нейронаук Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород, Российская Федерация 2Институт неврологии Университетского колледжа Лондона,
Лондон, Великобритания 'Институт клеточной биологии и нейробиологии клиники Шарите,
Берлин, Германия E-mail: filatjevaanastasia@yandex.ru
Аннотация. Мутации гена Spoutl ассоциированы с нарушениями развития нервной системы, однако молекулярные механизмы патогенеза не изучены. Нами было показано, что ген Spoutl экспрессируется на всех важнейших стадиях кортикогенеза, а его инактивация c помощью shRNA методом in utero электропорации в предшественниках нейронов приводит к задержке их выхода из митоза и последующему нарушению дифферен-цировки, что в свою очередь может приводить к уменьшению количества нейронов в коре головного мозга.
Ключевые слова: нарушения развития нервной системы, микроцефалия, инактивация гена Spoutl, кортикогенез.
Развитие коры головного мозга — это сложный, многоступенчатый процесс, нарушения которого приводят к серьёзным нейро-патологиям. Такие нарушения часто обусловлены генетическими факторами и вызывают структурные аномалии, такие как микро-и макроцефалия или нарушения функции мозга, проявляющиеся в расстройствах аутистического спектра, умственной отсталости и эпилепсии. Было показано, что мутации в гене Spoutl могут приводить к подобным нарушениям [1], однако молекулярные механизмы патогенеза на данный момент не изучены. Целью данной работы явилось установление паттерна экспрессии гена Spoutl на эмбриональных стадиях развития мыши и изучение влияния инактивации гена на процессы кортикогенеза.
Для изучения паттерна экспрессии гена Spoutl использовали метод гибридизации РНК in situ (ISH). В ходе проведения ISH мРНК гена на срезах гибридизовали с синтетическими РНК пробами, меченными дигоксигенином. Срезы обрабатывали BCIP/NBT, который при взаимодействии с щелочной фосфатазой образует нерастворимый осадок сине-фиолетового цвета, наблюдаемый в световой микроскоп. В экспериментах по инактивации гена Spoutl в кортикальных предшественниках in vivo использовали метод in utero электропорации (IUE). На 13 день эмбрионального развития в боковые желудочки головного мозга эмбриона мыши линии C3H вводили плазмидный конструкт, экспрессирующий shRNA против мРНК Spoutl, а также плазмиду, экспрессирующую кДНК белка GFP. Через 24 часа после электропорации беременным самкам однократно внутрибрюшинно вводили синтетический нуклеозид-ный аналог тимидина, бромодезоксиуридин (BrdU). Через 24 часа после инъекции BrdU осуществляли выделение и фиксацию образцов головного мозга.
Экспрессия гена Spoutl была обнаружена на стадиях е14.5, е16.5 и е18.5 в вентрикулярной и субвентрикулярной зонах. Кроме того, более слабый уровень экспрессии был обнаружен в кортикальной пластинке и в интермедиальной зоне. При помощи иммуногистохи-мии срезы мозга были проанализированы на наличие клеток, дважды положительных по GFP и маркеру пролиферирующих клеток Ki67 — это клетки, остающиеся в митотическом цикле через 48 часов после IUE. В контрольном эксперименте процент таких клеток составил 20% от всех GFP-положительных клеток. В экспериментах с IUE доля клеток, которые не вышли из митотического цикла, была вдвое больше по сравнению с контрольными образцами. Дополнительное окрашивание антителами к BrdU показывает клетки, которые находились в митотическом цикле через 24 часа после электропорации. Процент клеток, положительных на GFP/BrdU/ Ki67 в опытных образцах составил 48% по сравнению с контролем, где доля клеток оказалась значительно ниже — 33%, что свидетельствует о нарушении выхода из митотического цикла и процесса дифференцировки при инактивации данного гена.
Полученные результаты показывают, что ген Spoutl экспрес-сируется в нейрональных предшественниках на протяжении всего периода кортикогенеза, что в свою очередь подчеркивает важность этого гена и связанных с ним молекулярных каскадов на каждом из изученных этапов развития коры головного мозга. Продемон-
стрировано, что инактивация гена Spoutl в делящихся клетках приводит к задержке их выхода из митоза и нарушению дифферен-цировки нейрональных предшественников. Следовательно, можно предположить, что причина микроцефалии при мутации данного гена заключается в нарушении выхода из клеточного цикла, что приводит к уменьшению количества нейронов в коре.
Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (проект № FSWR-2023-0029).
Список литературы
1. Dharmadhikari A. V., Abad M. A., Khan S., Maroofian R., et al. RNA methyltransferase SPOUT1/CENP-32 links mitotic spindle organization with the neurodevelopmental disorder SpADMiSS // medRxiv [Preprint]. — 2024 Jan. — doi: 10.1101/2024.01.09.23300329.
STUDYING THE EXPRESSION AND ROLE OF THE SPOUT1 GENE IN THE DEVELOPMENT OF THE CEREBRAL CORTEX
Abstract. Mutations of the Spoutl gene are associated with disorders of the development of the nervous system, but the molecular mechanisms of pathogenesis have not been studied. We have shown that the Spoutl gene is expressed at all important stages of corticogenesis, and its inactivation using shRNA by in utero electroporation in the precursors of neurons leads to a delay in their exit from mitosis and subsequent disruption of differentiation, which in turn can lead to a decrease in the number of neurons in the cerebral cortex.
Key words: disorders of the nervous system, microcephaly, inactivation of the Spoutl gene, corticogenesis.
