CC BY
68
I I I I I
14
Новости клеточных технологий
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИИ
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
Эмбриональный нейрогенез у млекопитающих: роль центросом в асимметричном делении стволовых клеток
Эмбриональный нейрогенез у млекопитающих сопровождается активной пролиферацией клеток радиальной глии — полярных нейроэпителиальных клеток, тела которых расположены в вентрикулярной зоне коры развивающегося головного мозга. Эти глиальные клетки-предшественники (ГКП) — стволовые клетки головного мозга зародыша — делятся асимметрично, давая начало дифференцирующимся нейронам, которые затем мигрируют в направлении кортикальной пластинки, где происходит образование слоев неокортекса. Но что определяет способность стволовых клеток к асимметричному делению?
Накопленные данные свидетельствуют о том, что асимметричное деление обусловлено неравномерным распределением молекулярных факторов, которые определяют дальнейшую судьбу клетки [1 ]. Этими факторами могут быть как поверхностные, так и внутриклеточные молекулы. Так, показано, что асимметричное деление нейрогенных глиальных клеток у позвоночных связано с концентрированием мембранных белков (в частности, проминина-1) на апикальной поверхности клетки, что определяет дальнейшую асимметричную сегрегацию внутриклеточных факторов (Numb, Minibrain, PTEN) [2]. Таким образом, в случае асимметричного деления клеток радиальной глии ключевым событием является наследование апикальной мембраны, контактирующей с полостью желудочка. Это, в свою очередь, во многом зависит от пространственной ориентации веретена деления, которое контролирует плоскость разделения дочерних клеток. Поэтому логично предположить, что центросомы — центры организации клеточного цитоскелета, в том числе веретена деления — могут быть вовлечены в процесс асимметричного деления глиальных клеток-предшественников.
Особо интересным оказалось то, что сами центросомы могут расходиться асимметрично. Это было зафиксировано в некоторых стволовых клетках беспозвоночных, например, в сперматогенных стволовых клетках и ней-робластах дрозофилы [3—6]. Асимметрия наследования обусловлена различиями в структуре и функции двух центриолей, из которых состоят центросомы [7]. Так, более старая, «материнская» центриоль имеет дополнительные сателлитные комплексы (appendages/ satellites), в которые входят специфические белки, в частности, ценексин (ODF2) и нинеин. Именно сателлиты «материнских» центриолей обеспечивают закрепление микротрубочек цитоскелета и цилиогенез (образование
ресничек). «Дочерние» же центриоли, которые синтезируются во время S-фазы клеточного цикла, подобных структур не содержат. Таким образом, когда центросомы удваиваются, то одна из двух получает «материнскую» центриоль, а другая — «дочернюю», которая лишь через полтора клеточных цикла приобретет сателлитные комплексы и тоже станет зрелой «материнской» центриолью.
Исследовательская группа под руководством Song-Hai Shi (Нью-Йорк) задалась вопросом о роли центросом в асимметричном делении глиальных клеток-предше-ственников млекопитающих. Согласно результатам, опубликованным в октябрьском номере журнала Nature, центросомы в глиальных клетках мышиных эмбрионов способны к асимметричной сегрегации, при этом «материнская» центросома удерживается в ГКП, а «дочерняя» наследуется нейральными клетками, коммитированны-ми к дальнейшей дифференцировке.
Вначале авторы решили выяснить, различается ли локализация центросом в глиальных клетках-предше-ственниках и дифференцирующихся клетках. Для этого авторы пометили центриоли флуоресцентным маркером, внедрив в ткани эмбриона плазмиду, кодирующую ген центрина-1 (CETN1 ; основной компонент центриолей), «слитый» с геном белка-репортера EGFP. Введение плазмиды осуществлялось путем электропорации in utero на 13,5-й сут. эмбрионального развития, когда отмечается активный нейрогенез. Поскольку ГКП и дифференцирующиеся нейрональные клетки различаются по своей морфологии, авторы электропорировали в ткани эмбрионов еще одну плазмиду с геном флуоресцентного белка DsRedex, который накапливается в цитоплазме, что позволило увидеть форму клеток. В биполярных клетках радиальной глии центросомы располагались в дистальной части отростка, контактирующего с поверхностью желудочка, слева), в то время как дифференцирующиеся мультиполярные клетки субвентрикулярной и промежуточной зон содержали центросомы в теле нейрона. Со временем все больше CETN1—EGFP центриолей выявлялось в субвентрикулярной и промежуточной зонах, что говорит о миграции в эти зоны дифференцирующихся клеток.
Различается ли структура центросом в ГКП и дифференцирующихся нейрональных клетках? Чтобы ответить на этот вопрос, авторы аналогичным образом пометили как центрин-1 (DsRedex^CETNI ), так и нинеин (EGFP^ Nin) — один из компонентов сателлитных комплексов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 1, 2010
I I I I I I
Новости клеточных технологий
■ I I I
15
Это позволило проследить за судьбой «материнской» (Nin+) и «дочерней» (Nin~) центриолей. Важно, что Nin-экспрессирующие центриоли в ГКП концентрировались преимущественно в одной из центросом, что свидетельствует о неидентичности центросом в клетках радиальной глии. Далее, сравнивая распределение «материнских» и «дочерних» центриолей спустя два дня после электропорации плазмид, авторы обнаружили, что зрелые Nin+ центриоли в основном остаются в клетках вентрикулярной зоны, где концентрируются ГКП. Напротив, «дочерние» центриоли, содержащие только CETN1, распределяются по промежуточной зоне и кортикальной пластинке, где локализованы нейрональные клетки на разных стадиях дифференцировки. Таким образом, авторы получили весомое свидетельство в пользу асимметричного распределения центросом в глиальных клетках мышиных эмбрионов: центросома, содержащая зрелую «материнскую» центриоль, удерживается в ГКП, а центросома с «дочерней» центриолью наследуется клеткой, коммитированной к дальнейшей дифферен-цировке.
Чтобы провести наблюдение за асимметричной сегрегацией центросом непосредственно in situ, был разработан оригинальный подход, позволяющий определить возраст центриоли. Для мечения центрин-1+ центриолей в качестве флуоресцентного репортера использовали белок Kaede, который изменяет свою флуоресценцию с зеленой на красную под действием фиолетового света (длина волны — 350^400 нм). Фотоконверсия Kaede необратима, а сам белок высоко стабилен, что позволяет пометить все центриоли одного возраста коротким световым импульсом и затем проследить за их судьбой. Поскольку при удвоении центриолей молекулы центрина-1 синтезируются de novo, все «дочерние» центриоли, образовавшиеся после фотоимпульса, будут содержать зеленый неконвертированный CETNI^Kaede. Фотоконверсию проводили также in utero через сутки после электропорации плазмиды, несущей CETN1^ Kaede, а затем анализировали судьбу центриолей в развивающемся неокортексе через различные временные промежутки.
Через 1 сут. после фотоконверсии около 95% центросом включали «красные» и «зеленые» центриоли, что говорит о прохождении клетками одного цикла деления. На 2-е сут. около 30% центросом содержали только «зеленые», «дочерние» центриоли (второе деление). В то же время приблизительно 4% центросом несли только «красные» центриоли, т.е. принадлежали еще не поделившимся клеткам. Отметим, что авторы не обнаружили обмен молекулами центрина между центриолями и его диффузию в цитоплазму, что исключает вклад данных процессов в результаты экспериментов.
Авторы подтвердили, что большинство (более 76%) «зеленых» центросом, образовавшихся уже после фотоконверсии маркера, принадлежат дифференцирующимся клеткам промежуточной зоны и кортикальной пластинки. Большинство таких клеток экспрессируют TUJ1 — маркер дифференцирующихся нейронов. В свою очередь, около 78% центросом, содержащих первичную «материнскую» («красную») центриоль, находились в глиальных клетках вентрикулярной и субвентрикулярной зон и ассоциировались с экспрессией Рахб, молекулярного маркера ГКП.
Чтобы увидеть, как происходит распределение центриолей в делящихся глиальных клетках in situ, S.-Н. Shi с коллегами подготовили тканевые культуры кортикальных срезов, предварительно проведя трансфекцию
CETNI^Kaede и mPlum — еще одного флуоресцентного белка для визуализации клеточной морфологии. Через сутки после фотоконверсии CETNI^Kaede в культивируемых тканевых срезах авторы наблюдали, что в 6 из 7 делящихся клеток радиальной глии центросома, содержащая «материнскую» центриоль, удерживается у поверхности вентрикулярной зоны, а центросома с «дочерними» («зелеными») центриолями мигрирует в сторону кортикальной пластинки. Таким образом, авторы работы убедительно продемонстрировали асимметричное распределение центросом при делении глиальных клеток-предшественников в развивающемся головном мозге млекопитающих.
Наконец, было выяснено, насколько значимо избирательное наследование зрелой «материнской» центриоли для локализации и функционирования глиальных клеток-предшественников. Угнетение экспрессии нинеина — компонента, необходимого для созревания центриолей, — с помощью антисмысловой РНК (shRNA или siRNA) приводило к нарушению асимметричной сегрегации центросом. Более того, ингибирование нинеина вызывало утрату клеток в вентрикулярной зоне, где расположены глиальные предшественники. Действительно, отмечалось выраженное снижение относительного количества Рах6+ и GLAST+ клеток (маркеры ГКП) и увеличение доли TUJ1 -позитивных дифференцирующихся нейрональных клеток. Это свидетельствует о том, что асимметричное распределение центросом играет ключевую роль в поддержании недифференцированного состояния клеток-предшественников радиальной глии. При нарушении направленной сегрегации зрелых и «дочерних» центриолей ГКП утрачивают способность к самообновлению и запускают программу нейрональной дифференцировки.
Каким образом результаты, полученные S.-H. Shi и его коллегами, вписываются в общую картину регуляции асимметричного деления глиальных предшественников в эмбриональном головном мозге? Поскольку «материнские» центриоли являются центром прикрепления микротрубочек, можно полагать, что сигналы от апикальной поверхности клетки могут напрямую, через изменение локализации центросомы, регулировать положение веретена деления, а, значит, судьбу клетки. Кроме того, «материнские» центриоли необходимы для образования первичных (сенсорных) ворсинок, которые участвуют в проведении сигналов, например, от рецепторов SHH (Sonic Hedgehog) и ростового фактора тромбоцитов (PDGF). Вероятно, что рецепторы, ассоциированные с первичными ворсинками, могут играть важную роль в восприятии и проведении сигналов от апикальной поверхности клетки и определять положение веретена деления. Наконец, микротрубочки, соединенные с «материнской» центриолью, могут служить «направляющими» для транспорта везикул с молекулами, определяющими судьбу клетки.
Если предположить, что одна из центриолей постоянно удерживается в глиальных клетках-предшествен-никах, то выходит, что «время жизни» такой центриоли становится чрезвычайно долгим по сравнению с другими белками в клетке. Здесь хочется провести аналогию с гипотезой «бессмертной» цепи ДНК, предложенной J. Cairns в 1975 г. Согласно этой гипотезе, при асимметричном делении расхождение хромосом в стволовых клетках также происходит асимметрично [8]. В результате одна из цепей ДНК, называемая «бессмертной» цепью, всегда остается в стволовой клетке, в то время как вторая цепь попадает в дочернюю клетку, коммити-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 1, 2010
