ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ORTHOPEDIA HOMEOBOX В РАЗЛИЧНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ И НОРМАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ЧЕЛОВЕКА Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

_оригинальные статьи_

Б. Экспериментальные исследования

©Коллектив авторов, 2017 Вопросы онкологии, 2017. Том 63, № 1

УДК 575.113:616-006

Ю.К. Карнаухова12, д.Е. Полев1,3, л.л. Круковская1,2, А.П. Козлов12

изучение экспрессии гена Orthopedia 1ютеоЬох в различных опухолевых и нормальных тканях человека

1 Биомедицинский центр, 2 санкт-петербургский политехнический университет петра Великого, 3 санкт-петербургский государственный университет, г. санкт-петербург

изучена экспрессия гена ОТР в различных нормальных и опухолевых тканях человека методом пЦр со специфическими праймера-ми. ген ОТР экспрессируется в 23 из 29 опухолевых образцов, а интронный фрагмент гена ОТР (последовательность AI267901) в 49 из 59 опухолевых образцов различных локализаций. изучаемые нами фрагменты гена ОТР практически не транскрибируются в нормальных и эмбриональных тканях за исключением нормальной ткани яичка, то есть могут быть отнесены к категории раково-тестикулярных транскриптов. по предварительным данным рнк AI267901 и мрнк гена ОТР транскрибируются с разных нитей Днк. Таким образом, с локуса гена ОТР получается два независимых опухолеспецифических транскрипта, являющихся потенциальными маркерами для диагностики онкологических заболеваний.

ключевые слова: опухолеспецифическая экспрессия, Orthopedia homeobox (ОТР), опухолевые маркеры, диагностика онкологических заболеваний

В 2001 году нами была разработана программа HSAnalyst для поиска в электронных базах данных нуклеотидных последовательностей с опухолеспецифической экспрессией. С ее помощью был обнаружен целый ряд нуклеотидных последовательностей, которые экспресси-руется преимущественно в опухолях, но не в нормальных тканях [1, 5]. Впоследствии, часть компьютерных результатов была подтверждена экспериментально методом ПЦР на панелях кДНК из нормальных и опухолевых тканей [6]. В процессе этой работы были обнаружены две, предположительно опухолеспецифические, нуклеотидные последовательности: мРНК гена Homo sapiens Orthopedia homeobox (отр) и РНК AI267901 (идентификационный номер в базе данных GenBank).

Впоследствии оказалось, что AI267901 транскрибируется с области второго интрона гена

отр. При этом остается неясным, является ли указанная РНК самостоятельным транскриптом или альтернативным экзоном мРНК гена отр в опухолях.

В данной работе представлены результаты по анализу экспрессии гена отр, включая его интронную область, в различных опухолевых и нормальных тканях человека.

Материалы и методы

образцы кДнК

В работе применялись коммерческие наборы кДНК Multiple Tissue cDNA (MTC) panels (Clontech, Mountain View, CA). Были использованы следующие панели: Human MTC Panel I, Human MTC Panel II, Human Immune System MTC Panel, Human Fetal MTC Panel, Human Digestive System MTC Panel и Human Tumor MTC Panel. Данные наборы не содержат примесей геномной ДНК и нормализованы по четырём генам домашнего хозяйства. Образцы нормальных тканей представляют собой суммарные препараты кДНК от разных доноров (от двух до 550 доноров). Эмбриональная панель содержит образцы кДНК тканей плода человека от 16 до 36 недель развития. Образцы кДНК опухолевых тканей получены из опухолей человека, ксенотрансплантированных бестимусным мышам. Помимо набора кДНК опухолевых тканей фирмы Clontech, в работе применялись коммерческие образцы кДНК опухолевых тканей, полученные от различных пациентов (BioChain Institute, USA) и кДНК клинических образцов опухолевых тканей, полученная в нашей лаборатории. Клиничекие образцы были представлены следующими опухолями: ин-вазивный протоковый рак молочной железы (МЖ) II-III стадии (4 образца), аденокарцинома молочной железы III стадия (2 обр.), инвазивный протоковый рак МЖ III стадия (1 обр.), плоскоклеточный рак шейки матки IV ст. (1 обр.) и его метастазы в тело матки, большого сальника, правого и левого яичника (4 обр.), миосаркома шейки матки II-III стадия (1 обр.), низкодифференцированная бластома яичника IV стадия (1 обр.), рак яичника (2 обр.), умеренно дифференцированная аденокарцинома эндометрия II стадия (1 обр.), умеренно дифференцированная аденокарци-нома эндометрия с метастазами III стадия (1 обр.), плоскоклеточный рак легкого (2 обр.), рак бронха III стадия (1 обр.), рак легкого (1 обр.), рак желудка (3 обр.), семинома яичка (1 обр.), опухоль краниоспинального стыка (1 обр.), менингиома (2 обр), хронический лимфолейкоз IV стадия (1 обр.), неходжкинская Т-клеточная лимфома ^стадия (1 обр.), злокачественная лимфома II стадия, лимфогрануло-матоз, рецидив IV стадия (1 обр.), неходжкинская лимфома

из клеток мантийной зоны IV стадия (1 обр.). Информированное согласие пациентов было получено. Работа была одобрена этическими комитетами Военно-медицинской академии и Биомедицинского центра.

Выделение РНК

Выделение тотальной РНК из опухолевых тканей проводили по стандартной методике [2]. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I, свободной от РНКазы (Sigma, USA).

Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре Ultrospec® 3100 pro. Качество препаратов РНК оценивали

по соотношению оптических плотностей и гель-

260 280

электрофорезом по соотношению количества 28s и 18s рРНК в 1% агарозном геле [9].

Отсутствие примесей ДНК определяли с помощью ПЦР с использованием образца тотальной РНК и прайме-ров к фрагменту гена домашнего хозяйства G3PDH. При обнаружении сигналов после 40 циклов амплификации обработку ДНКазой I повторяли.

Синтез кДНК

Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) с использованием гексануклеотидных праймеров согласно рекомендациям производителя.

ПЦР

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в растворе, содержащем 2,5 мкл кДНК, 1-кратный ПЦР-буфер (Fermentas), MgCl2 (4 mM), dNTP (200 ^M каждого), 0,2 ^M каждого праймера и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы в общем объёме 25 мкл при следующих условиях: 1 мин. при 95°C, 35 циклов, включавших 30 сек. при 95°C, 30 сек при температуре отжига праймеров и 1 мин при 72°C. В завершение проводили достройку фрагментов в течение 5 мин при 72°C. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозе и прокрашивали бромистым этидием. Присутствие искомой мРНК в образце определяли по наличию продукта амплификации соответствующего размера.

Качество всех панелей кДНК проверяли с помощью ПЦР с использованием праймеров к фрагменту гена домашнего хозяйства G3PDH (Прямой 5'- TGAAGGTCGGAGTCAAC-GGATTTGGT -3', обратный 5'- CATGTGGGCCATGAG-GTCCACCAC -3'), Температура отжига праймеров 68°C, 30 циклов, размер амплифицируемого фрагмента 983 п.о.

Прямой праймер к изучавшемуся фрагменту отР-2 (OTP-2forv) имел последовательность: 5'- AGGCG-GTGAAGTGTAGGCTG -3', а обратный OTP-2rev 5'-CGCTTCTGCTTCTGTTGGC -3', температура отжига праймеров — 65°C. Длина ожидаемого фрагмента амплификации составляла 244 п.н.

Праймеры к изучамому фрагменту ОТР-in были подобраны по последовательности AI267901, прямой in-forv 5'- ACTCCCTCTCCTCAAACAA -3' и обратный in-rev 5'- GTGTCGGCGATGGATAAAC -3', температура отжига праймеров — 65°C. Длина ожидаемого фрагмента амплификации составляла 389 п.н.

Результаты и обсуждение

С помощью интернет ресурса UCSC Genome Browser последовательность AI267901 была картирована на геном человека. Изучаемая последовательность встречается в геноме человека только один раз в районе 5q14.1 и располагается в области второго интрона гена Homo sapiens Orthopedia homeobox (OTP) (рис.1).

Для изучения экспрессии гена OTP в тканях человека использовали, как отмечалось, ком-

мерческие панели кДНК нормальных и опухолевых тканей (С1оПеЛ, ВюОДат), так и панель кДНК, полученную нами из РНК клинического материала опухолей человека. Экспрессию гена определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами к гену ОТР. Для этого были подобраны прай-меры к последовательности второго экзона гена ОТР (фрагмент ОТР-2) и к последовательности А1267901, экспрессирующейся с интронной областью гена ОТР (фрагмент ОТР-т) (рис. 1).

При амплификации фрагмента ОТР-2 на наборах кДНК нормальных и эмбриональных тканей человека слабый специфический сигнал 224 п.н. наблюдался только в одном образце ткани яичка. Результаты представлены на рис. 2 и сведены в табл. 1.

При амплификации фрагмента ОТР-2 на наборе кДНК опухолевых тканей (ВюЗДат) сигналы наблюдались в образцах опухолей пищевода, желудка, тонкого кишечника, мочевого пузыря и матки. Слабые сигналы различимы в образцах опухоли мозга, молочной железы, яичка и уретры. Данный фрагмент мРНК гена не обнаружен в аденокарциномах толстой кишки и яичников, а также в карциномах легкого, печени, почки и фаллопиевых труб (рис.3(а)).

Дополнительно было проведено исследование экспрессии фрагмента ОТР-2 на клиническом материале опухолей человека. Для этого из образцов опухолей была выделена тотальная РНК и синтезирована кДНК. Полученная кДНК была использована для проведения ПЦР с прай-мерами, специфическими к фрагменту ОТР-2. Результаты эксперимента приведены на рис.3(б) и сведены в табл.2. Амплификация наблюдается в образцах всех изучавшихся опухолей: рака шейки матки, молочной железы, легкого, бронха, желудка, а также в лимфомах и семиноме.

Результаты проведенной полимеразной цепной реакции фрагмента ОТР-т на матрице кДНК коммерческих панелей нормальных тканей человека представлены на рис.4 и сведены в табл.1. Специфический фрагмент, соответствующий последовательности А1267901, также обнаружен только в одном из двух исследовавшихся образцов яичка (45 доноров на один образец кДНК) и не обнаружен ни в одном из образцов иммунной и эмбриональной панели (рис.4, табл.1).

Экспрессию фрагмента ОТР-т в опухолях исследовали, используя амплификацию со специфическими праймерами на трех коммерческих панелях кДНК опухолевых тканей (С1оШ;еЛ, ВюЗДат). Результаты на панели кДНК опухолевых тканей (С1оШ;еЛ) представлены на рис.5(а). Результаты амплификации ОТР-т на панели кДНК опухолевых тканей (ВюСЬат) представлены на рисунке 5(б,в). Сигналы амплификации

наблюдаются в четырех образцах карциномы легкого, в трех образцах карциномы молочной железы, в двух образцах аденокарциномы яичников, а также в опухолях пищевода, желудка, тонкой и толстой кишки, почки, мочевого пузыря, матки, уретры и простаты. Специфический фрагмент не обнаружен в двух из трех адено-карцином толстой кишки, а также в астроцитоме мозга, аденокарциноме поджелудочной железы, семиноме, карциномах печени и фаллопиевых труб и в лейомиоме матки.

При исследовании экспрессии последовательности AI267901 в клиническом материале опухолей человека оказалось, что амплификация последовательности AI267901 наблюдается в большинстве образцов опухолей молочной железы, тела и шейки матки, а также во всех исследуемых образцах опухолей лёгкого, желудка, яичка, мозговых оболочек и в лимфомах (рис.5(г)). Все результаты по экспрессии последовательности AI267901 в опухолевых тканях сведены в табл.2.

Специфичность амплификации изучаемых фрагментов гена OTP выборочно была подтверждена секвенированием (результаты не представлены).

Обсуждая полученные данные, следует подчеркнуть, что в настоящее время большое внимание уделяется исследованиям, направленным на поиск молекулярных маркеров опухолей, позволяющих выявлять заболевание на ранних стадиях, когда существующие методы лечения бывают наиболее эффективными. Для этого в общемировой практике используется ряд достаточно трудоемких и дорогостоящих методов анализа [3]. Созданная нами в 2001 году программа HSAnalyst открывает новые возможности для сравнительного изучения экспрессии генов. С ее помощью мы провели компьютерное сравнение электронных библиотек кДНК, полученных из опухолей, с библиотеками кДнК из нормальных тканей человека. В результате этой работы был выявлен целый ряд опухолеспеци-фических транскриптов [1]. Среди них были мРНК гена OTP и нуклеотидная последовательность AI267901, закодированная в области второго интрона гена OTP (рис.1).

Ген OTP человека является гомологом гена Orthopedia мыши и принадлежит к семейству гомеобокс-содержащих генов. Его функции у человека пока до конца не выяснены, однако, по всей видимости, он является ключевым звеном в определении судьбы клеток в развитии организма, как и все гомеобокс-содержащие гены. Его экспрессия была выявлена в мозге 17-недельно-го плода, что позволяет предположить роль OTP в развитии мозга. Ген OTP человека закодирован в «минус» нити 5 хромосомы и включает три экзона и два интрона [7].

В настоящей работе получены экспериментальные данные, подтверждающие компьютерные результаты. Нами была изучена экспрессия гена OTP в различных нормальных и опухолевых тканях человека методом ПЦР со специфическими праймерами к гену OTP (рис.1). Для исследования были выбраны: фрагмент ОТР-2, соответствующий второму экзону гена OTP, и фрагмент ОТР-in, соответствующий последовательности AI267901, экспрессирующейся с ин-тронной области гена OTP.

В табл. 2 сведены данные по экспрессии гена в различных опухолях человека. Из таблицы видно, что изучаемые фрагменты представлены в большинстве образцов опухолей, за исключением карциномы печени, фаллопиевых труб и поджелудочной железы. Фрагмент ОТР-2 экспрессируется в 23 из 29 опухолевых образцов, а фрагмент ОТР-in в 49 из 59 опухолевых образцов. Экспрессия ни одного из этих фрагментов не обнаружена только в аденокарцино-ме поджелудочной железы, карциноме печени и фаллопиевых труб.

В табл. 1 сведены данные по экспрессии изучаемых последовательностей гена в различных нормальных тканях взрослого человека и в эмбриональных тканях. Таблица наглядно показывает, что изучаемые нами фрагменты гена OTP практически не транскрибируются в нормальных и эмбриональных тканях. Так, фрагмент ОТР-2 и последовательность AI267901 обнаруживаются только в нормальных тканях яичка, т.е. могут быть отнесены к категории раково-те-стикулярных транскриптов. Следует учесть, что каждый образец нормальной ткани объединяет в себе кДНК от нескольких доноров, что даёт возможность обнаружения транскриптов, которые присутствуют лишь в части проб.

Фрагмент ОТР-in относится к интронной области гена OTP и в процессированной мРНК Orthopedia homeobox должен отсутствовать [7]. В то же время, наши результаты свидетельствуют о том, что последовательность AI267901 и ген OTP имеют схожий профиль экспрессии как в нормальных тканях, так и в изучаемых опухолях (табл.1, 2). Из данных фактов следует, что последовательность AI267901 может являться либо альтернативным экзоном гена OTP в опухолях, либо самостоятельным транскриптом.

В данный момент мы проводим эксперименты по определению полной нуклеотидной последовательности этого транскрипта и направлению его синтеза. По предварительным данным последовательность AI267901 транскрибируется с обратной по отношению к гену OTP нити ДНК и является частью более протяженного самостоятельного транскрипта (результаты не представлены).

Таблица 1. Экспрессия фрагментов гена ОТР в нормальных и эмбриональных тканях человека

Ткань/орган ОТР-2 Положительные образцы/ общее кол-во образцов оТр-in Положительные образцы/ общее кол-во образцов Кол-во доноров на образец Ткань/орган отр-2 Положительные образцы/ общее кол-во образцов оТр-in Положительные образцы/ общее кол-во образцов Кол-во доноров на образец

Мозг 0/1 0/2 4 Слепая кишка 0/1 0/1 29

Лёгкое 0/1 0/2 2-4 Восходящая ободочная кишка 0/1 0/1 5

Сердце 0/1 0/2 16 нисходящая ободочная кишка 0/1 0/1 7

Селезёнка 0/2 0/4 6-11 Поперечная ободочная кишка 0/1 0/1 19

Тимус 0/2 0/4 9-18 двенадцатиперстная кишка 0/1 0/1 30

Лейкоциты периферической крови 0/2 0/4 550 Пищевод 0/1 0/1 39

Лимфатический узел 0/1 0/2 12 Подвздошно-сле-пая кишка 0/1 0/1 19

Миндалевидная железа 0/1 0/2 5 Подвздошная кишка 0/1 0/1 8

Красный костный мозг 0/1 0/2 74 Тощая кишка 0/1 0/1 6

Почка 0/1 0/2 14 Прямая кишка 0/1 0/1 6

Печень 0/2 0/3 4 желудок 0/1 0/1 7

Поджелудочная железа 0/1 0/2 20 Фетальный мозг 0/1 0/2 10

Тонкая кишка 0/1 0/2 32 Фетальное сердце 0/1 0/2 13

Толстая кишка 0/1 0/2 20 Фетальная печень 0/2 0/4 32

Яичник 0/1 0/2 14 Фетальная почка 0/1 0/2 17

Простата 0/1 0/2 32 Фетальное лёгкое 0/1 0/2 38

Яичко 1/1 1/2 45 Фетальные мышцы 0/1 0/2 13

Плацента 0/1 0/2 10 Фетальная селезёнка 0/1 0/2 17

Скелетная мышца 0/1 0/2 35 Фетальный тимус 0/1 0/2 17

жирным шрифтом отмечены образцы, в которых выявлена экспрессия соответствующих фрагментов гена ОТР.

Таблица 2. Экспрессия фрагментов гена ОТР в различных опухолях человека

Фрагмент гена отр Локализация опухоли ' -------- отр-2 отр-in

Головной мозг 1/1 0/1

Краниоспинальный стык - 1/1

Молочная железа 2/2 8/9

Легкое 3/4 6/6

Бронх 1/1 1/1

Пищевод 1/1 1/1

желудок 3/3 2/2

Поджелудочная железа - 0/1

Тонкая кишка 1/1 1/1

Толстая кишка 0/1 2/4

Печень 0/1 0/1

Почка 0/1 2/2

Мочевой пузырь 1/1 1/1

Матка 1/1 3/4

Шейка матки 2/2 1/2

Фаллопиевы трубы 0/1 0/1

Яичники 0/1 5/5

Яичко 2/2 1/2

Уретра 1/1 2/2

Простата - 1/1

Менингиома - 2/2

Лимфома 4/4 5/5

Таким образом, оба изучаемых фрагмента гена OTP экспрессируются в подавляющем большинстве опухолей (табл. 2) и практически не обнаруживаются в нормальных тканях человека (табл. 1). При этом с локуса гена OTP мы получаем два независимых опухолеспецифиче-ских транскрипта, являющихся перспективными маркерами для диагностики онкологических заболеваний.

В качестве потенциального маркера раннего выявления рака ген OTP впервые начал рассма-

триваться в 2012 году, когда M.S. Kim и соавт. показали наличие атипичного метилирования гена OTP в опухолях молочной железы [4].

В настоящее время ген OTP активно исследуется несколькими группами ученых, как прогностический маркер для карциноидных опухолей легкого [8, 10]. Опубликованы данные об экспрессии гена OTP только в опухолях легкого [8, 10] и мочевого пузыря [8], тогда как нами показана экспрессия гена OTP в широком спектре опухолей почти всех локализаций.

Рис. 1. Схема гена ОТР

Жирными стрелками показаны места посадки праймеров для амплификации соответствующих фрагментов гена ОТР.

Рис. 2. Результаты амплификации фрагмента ОТР-2 в нормальных тканях человека

а) 1 — мозг, 2 — сердце, 3 — почка, 4 — печень, 5- легкое, 6 - поджелудочная железа, 7 - плацента, 8 - скелетная

мышца, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

б) 1 - толстая кишка, 2 - яичник, 3 - лейкоциты периферической крови, 4 - предстательная железа, 5 - тонкая киш-

ка, 6 - селезенка, 7 - яичко, 8 - тимус, К— ПЦр без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

в) 1 - костный мозг, 2 - фетальная печень, 3 - лимфатический узел, 4 — лейкоциты периферической крови, 5 - се-

лезенка, 6 - тимус, 7 - миндалевидная железа, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека; г) 1 - фетальный мозг, 2 - фетальное сердце, 3 - фетальная почка, 4 - фетальная печень, 5 - фетальное легкое, 6 — фетальная скелетная мышца, 7 - фетальная селезенка, 8 - фетальный тимус, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на

геномной ДНК человека.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 К- К+

Human Tumor Panel (BioChain Instutute, USA) 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 К- K+

6)\

Клинические образцы опухолей человека (Биомедицинский центр)

Рис. 3. Результаты амплификации фрагмента оТР-2 в опухолевых тканях человека

а) 1- астроцитома головного мозга, 2- карцинома молочной железы, 3- карцинома легкого, 4- аденокарцинома пищевода, 5- аденокарцинома желудка, 6- аденокарцинома тонкой кишки, 7- аденокарцинома толстой кишки, 8- карцинома печени, 9- карцинома почки, 10- карцинома мочевого пузыря, 11- аденокарцинома матки, 12- карцинома фаллопиевых труб, 13-

аденокарцинома яичников, 14- семинома яичка, 15- карцинома уретры, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК

человека;

б) 1 - рак шейки матки, 2- семинома, 3 - миосаркома шейки матки, 4,5 -плоскоклеточный рак легкого, 6 - рак бронха, 7-рак легкого, 8- аденокарцинома молочной железы, 9,10,12,13- лимфомы, 11,14 - рак желудка, К— ПЦР без матрицы, К+

- ПЦР на геномной ДНК человека.

Human МТС Panel I (Clontech, USA)

Human Immune System MTC Panel (Clontech, USA)

1 2 3 4 5 6 7 8 K+K-

1 2 3 4 5 6 7 8 K- к+

Human МТС Panel 11 (Clontech, USA)

1 2 3 4 5 6 7 8 K+ К-

J 2 3 4 5 6 7 8_К- к+

Human Fetal MTC Panel (Clontech, USA)

1

8 9 10 11 12 К- K+

Human Digestive System MTC Panel (Clontech, USA)

Рис. 4. Результаты амплификации фрагмента OTP-in в нормальных тканях человека

а) 1 — мозг, 2 — сердце, 3 — почка, 4 — печень, 5- легкое, 6 - поджелудочная железа, 7 - плацента, 8 - скелетная мышца, К— ПЦР

без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

б) 1 - толстая кишка, 2 - яичник, 3 - лейкоциты периферической крови, 4 - предстательная железа, 5 - тонкая кишка, 6 - селезенка,

7 - яичко, 8 - тимус, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

в) 1 - костный мозг, 2 - фетальная печень, 3 - лимфатический узел, 4 — лейкоциты периферической крови, 5 - селезенка, 6 - тимус,

7 - миндалевидная железа, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

г) 1 - фетальный мозг, 2 - фетальное сердце, 3 - фетальная почка, 4 - фетальная печень, 5 - фетальное легкое, 6 — фетальная ске-

летная мышца, 7 - фетальная селезенка, 8 - фетальный тимус, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека; д) 1 - слепая кишка, 2 - восходящая ободочная кишка, 3 - нисходящая ободочная кишка, 4 - поперечная ободочная кишка, 5 - двенадцатиперстная кишка, 6 - пищевод, 7 - подвздошно-слепая кишка, 8 - подвздошная кишка, 9 - тощая кишка, 10 - печень, 11 - прямая кишка, 12 - желудок, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека.

Рис. 5. Результаты амплификации фрагмента ОТР-т в опухолевых тканях человека а) 1 - карцинома молочной железы, 2 - карцинома лёгкого, 3 - аденокарцинома толстой кишки, 4 - рак лёгкого, 5 - аденокарцинома простаты, 6 - аденокарцинома толстой кишки, 7 - карцинома яичника, 8 - аденокарцинома поджелудочной железы, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

б) 1 - карцинома молочной железы, 2 - аденокарцинома толстой кишки, 3 - карцинома почки, 4 - карцинома лёгкого, 5 - аденокарци-

нома желудка, 6 - лейомиома матки, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека;

в) 1- астроцитома головного мозга, 2- карцинома молочной железы, 3- карцинома легкого, 4- аденокарцинома пищевода, 5- аденокарцинома желудка, 6- аденокарцинома тонкой кишки, 7- аденокарцинома толстой кишки, 8- карцинома печени, 9- карцинома почки, 10-

карцинома мочевого пузыря, 11- аденокарцинома матки, 12- карцинома фаллопиевых труб, 13- аденокарцинома яичников, 14- семино-ма яичка, 15- карцинома уретры, К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека; г) 1-6 рак молочной железы, 7 - рак шейки матки, 8-11 - метастазы в тело матки, большого сальника, правого и левого яичника от №7, 12 - миосаркома шейки матки, 13-15 рак яичника, 16-17 — аденокарцинома эндометрия матки, 18-19 -плоскоклеточный рак легкого, 20 - рак бронха, 21 - рак желудка, 22 - рак яичка, 23-24 - менингиома, 25- опухоль краниоспинального стыка, 26-30 лимфомы,

К— ПЦР без матрицы, К+ - ПЦР на геномной ДНК человека.

Другими авторами было показано существование белка, кодируемого геном OTP [7, 10], что дает нам основание предполагать возможность использования продуктов этого гена не только в качестве опухолевого маркера, но и для иммунотерапии рака.

В нашей лаборатории продолжаются эксперименты, направленные на подробное изучение экспресии транскриптов гена OTP в различных тканях, а также работа по определению структуры и полной нуклеотидной последовательности транскрипта AI267901, представляющая не только научный, но и практический интерес.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают свою признательность T.B. Курбатовой за ценные консультации и А.Э. Машарскому за помощь в секвенировании.

Pабота выполнена при поддержке гранта №6.833.2014/K проектной части государственного задания в сфере научной деятельности Минобрнауки PФ

ЛИТЕРАТУРА

1. Baranova A.V., Lobashev A.V., Ivanov D.V. et al. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome // FEBS Lett. - 2001. - Vol. 508. - №

I. - P. 143-148.

2. Chirgwin J.M., Przybyla A.E., MacDonald R.J., Rutter W.J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry. - 1979. - V. 18. - № 24. - P. 5294-5299.

3. Joe W. Gray, Colin Collins. Genome changes and gene expression in human solid tumors // Carcinogenesis. -2000. - Vol. 21. - № 3. - P. 443-452.

4. Kim MS, Lee J, Oh T, Moon Y Chang E, et al. Genome-wide identification of OTP gene as a novel methylation marker of breast cancer // Oncol Rep. - 2012. - Vol. 27. - P.1681-1688.

5. Kozlov A.P. Expression of evolutionarily novel genes in Tumors // Infectious Agents and Cancer. - 2016. - Vol.

II. - № 34. - DOI 10.1186/s13027-016-0077-6.

6. Krukovskaja L.L., Baranova A., Tyezelova T. et al. Experimental study of human expressed sequences newly identified in silico as tumor specific// Tumour Biol.-2005.- V. 26.- № 1.- P. 17-24.

7. Lin X, State MW, Vaccarino FM, Greally J, Hass M, Leckman JF. Identification, chromosomal assignment, and expression analysis of the human homeodomain-containing gene Orthopedia (OTP) // Genomics. - 1999. - Vol. 60. - № 1. - P. 96-104.

8. Nonaka D, Papaxoinis G, Mansoor W. Diagnostic Utility of Orthopedia Homeobox (OTP) in Pulmonary Carcinoid Tumors // Am J Surg Pathol. - 2016. - Vol. 40. - № 6. - P.738-744.

9. Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001.

10. Swarts D.R., Henfling M.E., Van Neste L. et al. CD44 and OTP Are Strong Prognostic Markers for Pulmonary Carcinoids // Clinical Cancer Research. - 2013. - Vol. 19. - P. 2197-2207.

Поступила в редакцию 30.08.2016г.

Yu.K.Karnaukhova12, D.E.Polev13, L.L.Krukovskaya12, A.P.Kozlov12

The study of Orthopedia homeobox gene

expression in different tumor and normal human tissues

1 Biomedical center 2Peter the Great St. Petersburg State Polytechnic University 3St. Petersburg State University St. Petersburg

There was studied the OTP gene expression in different normal and tumor human tissues using PCR with specific primers. OTP gene is expressed in 23 of 29 tumor samples and in-tron fragment of OTP gene (sequence AI267901) is expressed in 49 of 59 tumor samples of different localization. Studied fragments of OTP gene are not transcribed in normal and embryonic tissues except for normal testis tissue, i.e. they can be classified as cancer-testis transcripts. According to preliminary data AI267901 RNA and OTP gene mRNA are transcribed from different DNA strands. Thus locus of OTP gene provides two independent tumor specific transcripts which are potential markers for the cancer diagnostics.

Key words: tumor specific expression, Orthopedia homeo-box (OTP), tumor markers, cancer diagnostics