CC BY
42
МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
ИЗУЧЕНИЕ ДНК ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА ПРИМЕРЕ РОДА ANTHYLLIS L.
В.М. Баева1 , К.Э. Вальехо-Роман2, Т.Х. Самигуллин2
1Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова, Москва
2Научно-исследовательский институт физической химии им. А.Н.Белозерского, Москва
verabaeva@mail.ru
Резюме: Изучена ДНК представителей рода Anthyllis L. для систематической характеристики перспективных лекарственных видов по определенным критериям строения генома и описаны характеристики подлинности перспективного сырья по определенным маркерам.
Ключевые слова: лекарственные растения, род язвенник, геном, полимеразная цепная реакция.
STUDYING MEDICINAL HERBS DNA AS EXEMPLIFIED BY ANTHYLLIS L.
V.M. Baeva, K. E. Vallejo-Roman, T.H. Samigullin
Abstract: The DNA of the representatives of Anthyllis L. has been studied for the purpose of the systematic characteristics of promising medicinal species with certain genome structure criteria. The identity characteristics for certain markers of promising raw materials have been described.
Key words: medicinal herbs, Anthyllis, genome, polymerase chain reaction.
В настоящее время возрождение интереса к лекарственным средствам природного происхождения поддерживается данными, полученными доказательной медициной за последние десятилетия. Многие лекарственные растения, применяемые веками традиционной медициной, могут служить дополнительной сырьевой базой для получения новых эффективных и безопасных лекарств.
Обширное семейство бобовые — Fabaceae включает много пищевых и лекарственных растений, синтезирующих разнообразные ценные биологически активные вещества, которые могут явиться основой для перспективных лекарственных препаратов. Представители семейства из рода язвенник — АпЛу1Ш Ь., такие как я. ранозаживляющий, я. крупноголовчатый и я. опушенный имеют богатый химический состав, включающий стероидные сапонины, кумарины, дубильные вещества и флавонои-ды, углеводы и их производные и др. В литературе описаны лекарственные свойства трех видов язвенника: я. крупноголовчатого, я. опушенного и я. ранозаживляющего [1].
Трава и цветки язвенника в традиционной (народной) медицине находят применение как успокаивающее, при бессоннице и эпилепсии, противовоспалительное и ранозаживляющее, при язве желудка, ревматизме, бронхите, гриппе, кашле, бешенстве, диаррее, острых энтеритах и энтероколитах, диабете. Применение настоя надземной части язвенника при язвенной болезни желудка и болях в нем, возможно, обусловлено седативным и антибактериальным действием и его положительным влиянием на трофику тканей желудка. Имеются данные о возбуждающем и тонизирующем действии препаратов язвенника. В эксперименте показано, что сумма флавоноидов (100 мг/кг) внутрибрюшинно продлевает барбами-
ловый наркоз, угнетает спонтанную двигательную активность, повышает порог болевой реакции, т.е. оказывает угнетающее действие на ЦНС [1].
Большинство авторов, в том числе и зарубежных, не дифференцирует виды рода. Поэтому для выявления наиболее перспективных для отечественной медицины растений нам представляется целесообразным использование молекулярно-биологических методов, позволяющих характеризовать их по определенным критериям строения генома и описать характеристики подлинности сырья по определенным маркерам. Систематические связи рода Anthyllis L. активно изучаются по морфологическим признакам [2, 3] и представляется интересным и новым изучение ДНК видов этого перспективного рода в сравнении.
Цель настоящей работы: изучение ДНК представителей рода Anthyllis L. для систематической характеристики перспективных лекарственных видов по определенным критериям строения генома и описание характеристики подлинности перспективного сырья по определенным маркерам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования явились: Anthyllis
vulneraria L., - язвенник ранозаживляющий, а также Anthyllis cornicina L, Anthyllis cytisoides L, Anthyllis lagascana Benedí, Anthyllis lotoides L, Anthyllis hamosa Desf., Anthyllis circinnata L, Anthyllis barbajovis L., Anthyllis hermanniae L., Anthyllis ramburei Boiss., Anthyllis tejedensis Boiss., Anthyllis terniflora (Lag.) Pau. [2], представители других родов трибы Loteae [2].
Препараты ДНК получали СТАВ-методом [6] с небольшими модификациями. Препараты ДНК хранили при —20°С.
Методика проведения полимеразной цепной
Таблица 1. Последовательности использованньх в работе праймеров
Название праймера Последовательность праймера Длина
L 5’-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3’ 23 н.
2 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ 20 н.
3 5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’ 20 н.
4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGT-3’ 20 н.
F rps16 5-AAACGATGTGGTAAAAAGCAAC-3' 22 н.
R rps16 5' -GGAT CATAAAAACCCACTTT CC-3' 22 н.
PI petB 1411 F 5-GCCGTMTTTATGTTAATGC-3' 19 н.
PI petD 738 R 5' -AATTTAGCYCTTAATACAGG-3' 20 н.
реакции (ПЦР) подробно описана в нашей предыдущей работе [2]. Для амплификации внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона ядДНК использовали праймеры, комплементарные L и 4. При секвенировании ITS 1 и ITS 2 использовали наряду с внешними праймерами пару внутренних праймеров 2 и 3. Для амплификации хлоропластного участка pet B-petD были использованы праймеры: PI pet B 1411 F и PI petD 738 R [12], для хлоропластного участка интрона гена rps 16 праймеры: F rps 16 и R rps 16. Последовательности использованных в работе праймеров представлены в таблице 1.
Реакционная смесь содержала около 20 нг ДНК; 60 мМ трис-HCl (pH 8,5); 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритон Х-100; 200 мкМ каждого dNTP; 12,5 пМ каждого праймера и 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим»).
Условия проведения реакции амплификации (автоматизированный вариант). Амплификцию проводили в термоциклере фирмы Biometra (Göttingen, Germany) модель Т3000 по схеме: ITS 1-2 [5].
Методика очистки амплификата. Для очистки
полученного продукта амплификации использовали набор NucleoSpin® Extract II (Marcherey-Nagel GmbH&Co).
Методика проведения секвенирования. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводили методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).
Для построения филогенетических деревьев использовали метод объединения соседей NJ (neighbor-joining), метод максимальной экономии (maximum parsimony methods, MP). В качестве статистической поддержки индивидуальных узлов при построении филогенетических деревьев применялся метод бут-стрепа.
Байесовская реконструкция филогении (MB) была проведена с помощью программы MrBayes 3.1 [4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
(Молекулярный и филогенетический анализ)
Нами было выделено 15 препаратов ДНК из гербарного материала СТАВ-методом [6]. Далее были определены с прямого и обратного праймеров нуклеотидные последовательности участка ITS1-2 яд-рДНК у 25 таксонов трибы Loteae семейства Leguminosae. Помимо этого, были получены последовательности хлоропластных участков petB-petD и rps16 хпДНК у 25 таксонов этой же трибы [7, 8]. Данные о размерах участков, нуклеотидном составе, объеме выборки анализируемых таксонов, длине выравнивания, а также количестве вариабельных и информативных позиций в каждом исследуемом участке генома приведены в таблице 2.
Всего при анализе участка ITS 1-2 были выявлены 281 постоянная позиция и 318 вариабельных из
Таблица 2. Характеристики длины, нуклеотидного состава и выравнивания изученных последовательностей в рассматриваемой группе Ы^щттоъае
Нуклеотидный состав, % Число позиций
Участок генома Число таксонов в выравнивании Размер участка, п.н. Длина вы-равнива-ния, п.н. А С G Т і S р о -& н К 1 V VO а и ари м
ITS 1-2 25 452-618 689 22,8 26,1 226,5 24,6 214 104
petB-petD 25 847-955 1082 32,6 15,1 18,8 33,5 88 144
rps16 25 838-931 1029 33,5 13,4 19,7 33,4 89 167
МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
них: 104 неинформативных и 214 информативных; на участке petB—petD выявлено 682 постоянных позиции и 232 вариабельных из них: 144 неинформативных и 88 информативных; в интроне гена rps16 615 постоянных позиций и 256 вариабельных: 167 неинформативных и 89 информативных [9, 10]. Уровень различий в нуклеотидных последовательностях участка ITS 1-2 внутри рода Anthyllis семейства Leguminosae составил 14,4%, для участка petB-petD — 3,7%, для участка rps16 — 3,9%.
Нами были отмечены значительные различия между ядерными и хлоропластными участками по нуклеотидному составу: для ядерного участка ITS 1-2 в целом характерно довольно высокое содержание GC-пар (52,5%), в то время как хлоропластные участки petB-petD (33,9%) и rps16 (33,1%) богаты АТ-парами. Для участка ITS 1-2 обнаружена вариабельность по длине, которая обусловлена инделями [5, 6], дупликациями и амплификациями отдельных фрагментов из 1-59 п.н. общим числом 39, возникновение которых, вероятно, связано с механизмом «проскальзывания» при репликации. На участке petB-petD число инделей составило 34, а их размер варьировал от 1-145 п.н., на участке rps16 — число инделей — 43, длина — 1-48 п.н. Для всего рода Anthyllis характерны: вставка из трех нуклеотидов (GTG) на участке ITS1-2 и вставка (AAGT) в интроне гена rps 16. При анализе участков ядерной ДНК построено филогенетическое дерево методом NJ по участку ITS 1-2 [5]. Распределение видов на филогенетическом дереве и маркирование согласуется с системой Д.Д. Соколова [3], в которой подрод Anthyllis sensu Akulova разделен на три самостоятельных под-рода [3]: Anthyllis s.str, Terniflora и Barba-Jovis. Эти растения похожи на представителей подрода Terniflora элементарными соцветиями с предлистом, расположенным в их верхней или средней части (особенность, не отмеченная у других видов трибы). В то же время, ось элементарного соцветия у видов подрода Anthyllis укороченная, а не удлиненная в нижней части, как у видов подрода Terniflora. Помимо строения соцветий, виды подрода Anthyllis отличаются от других видов рода по строению (в том числе анатомическому) плодов и чашечки [3]. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthyllis vulneraria, характеризуемого рядом уникальных морфологических особенностей и помещаемого в отдельный подрод Anthyllis, подтверждается также данными об инделях: вставка из 6 п.н. (ATAACA) на участке petB-petD.
К подроду Terniflora относят два вида (A. terniflora и A.cytisoides), которые резко отличаются от всех остальных видов Loteae листорасположением в 1/3 или 2/5 (а не в 1/2) и элементарными соцветиями — кистями (а не головками или зонтиками) [3]. Их отличие от других видов подтверждает и анализ молекулярных маркеров: делеция двух нуклеотидов (АТ) на участке ITS1-2 и две вставки в интроне гена rps 16 длиной 9 (TTTTTTCTA) и 6 (ATCATA) п.н.
Большинство видов рода включают в подрод Barba-Jovis. В пределах этого подрода выделяют 5 секций [3]. Следует отметить, что подрод Barba-Jovis рода Anthyllis, не имеющий специфических инделей, и на морфологическом уровне характеризуется только комплексом симплезиоморфий [3] и колозиоморфий [3]. Для всех видов подрода Cornicina на участке ITS 1-2 характерна делеция 7 п.н. (CACCATG).
Анализ полученных данных о последовательностях. Набор из 25 выравненных последовательностей участка ITS ядДНК содержит 689 позиций, из которых 90 позиций были удалены из анализа, поскольку представляли собой области неоднозначного выравнивания. Таким образом, в анализ было включено 599 позиций, из которых 281 были постоянными, 214 пар-симонно-информативными и 104 парсимонно-неин-формативными. Набор последовательностей участка petB-petD содержит 1082 позиции, из которых 168 были исключены из анализа. Следовательно, в анализ было включено 914 позиций: 682 постоянные, 88 информативных и 144 неинформативных. Набор интрона гена rps16 содержит 1029 позиций, 158 были исключены из анализа. Анализ включал в себя 871 позицию: 615 — постоянных, 89 — информативных и 167 — неинформативных.
Филогенетические деревья строили с помощью методов ближайшего связывания, максимальной экономии и методом Байеса (NJ, MP и MB). Деревья, построенные разными методами, имеют не идентичные, но не противоречащие друг другу топологии [4].
Согласно новейшей системе трибы Loteae [3] род Anthyllis делится на несколько подродов: Barba-Jovis, Terniflora, Cornicina и Anthyllis. Анализ с использованием участка ITS 1-2 подтвердил наличие четырех под-родов, при этом подрод Terniflora имеет уровень поддержки бутстрепа 100%, подрод Barba-Jovis — 100%, подрод Cornicina — 93%, подрод Anthyllis становится сестринской группой для всех остальных видов рода (71%).
На основании участка ITS 1-2 выделяется четыре клады подродов: Barba-Jovis, Terniflora, Cornicina и Anthyllis. Клада подрода Barba-Jovis пропадает на остальных деревьях, построенных по участкам petB-petD, rps16 и объединенном дереве. Подрод Anthyllis не имеет четкого родства и в зависимости от участка, на основании которого строилось дерево, занимает различные положения.
На всех построенных деревьях род Anthyllis выявляется как монофилетическая группа (1.00 на всех четырех деревьях). Независимо от участка, по которому строили дерево, стабильно выделяются две клады: подрод Terniflora и Cornicina, апостериорная вероятность 1.00 для обеих клад. Подрод Anthyllis группируется с представителями подрода Barba-Jovis с довольно высокой вероятностью (0.82 по участку ITS 1-2, 0.99 по участку rps16 и на объединенном дереве).
В пределах рода Anthyllis нами были обнаружены интересные комбинации инделей, которые достаточно хорошо согласуются с распределением видов на филогенетических деревьях и маркируют выделяемые в пределах каждого рода подроды, согласно системе Д.Д. Соколова [3]. Следует отметить, что подрод Barba-Jovis рода Anthyllis, не имеющий специфических инде-лей, и на морфологическом уровне характеризуется только комплексом симплезиоморфий [3]. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthyllis vulneraria, характеризуемого рядом уникальных морфологических особенностей и помещаемого в отдельный подрод Anthyllis, подтверждается также данными об инделях. Сравнение топологий деревьев, построенных разными методами и по разным исследуемым участкам, показывает, что род Anthyllis выявляется как монофилетический. В том случае, когда виды одного подрода не формируют самостоятельную группировку со значимым уровнем поддержки, как, например, в случае представителей подрода Barba-Jovis на деревьях, построенных при помощи метода максимальной экономии, максимальной экономии с использованием бутстреп-анализа и метода Байеса по всем участкам, кроме ITS 1-2, то их расположение на дереве, однако, не противоречит гипотезе о монофилии подрода.
На основании филогенетического анализа установлено, что род Anthyllis проявляет себя как монофи-летическая группа с высокими уровнями поддержки при анализе как ядерных, так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетических деревьях вида Anthyllis vulneraria L, характеризуемого
ЛИТЕРАТУРА
1. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование. Т.3. Л.: Наука, 1987. 326 с.
2. Баева В.М., Вальехо-Роман К.Э., Самигуллин Т.Х. Изучение растений рода язвенник с использованием секвенирования ДНК. Фармация, 2009. № 3. С. 23-26.
3. Соколов Д.Д. Морфология и система трибы 1_о1еае DC. семейства Leguminosae. Диссертация докт. биол. наук. М., 2003. 466 с.
4. Alfaro M.E., Zoller S., Lutzoni F. Bayes or bootstrap? A simulation study comparing the performance of Bayesian Markov chain Monte Carlo sampling and bootstrapping in assessing phylogenetic confidence // Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 255-266.
рядом уникальных морфологических особенностей и помещаемого в отдельный подрод Anthyllis, подтверждается также полученными данными об инделях: вставка из 6 п.н. (ATAACA) на участке petB-petD.
Эти молекулярные маркеры (индели) могут быть рекомендованы для изучения лекарственных растений молекулярно-филогенетическими методами.
Язвенник ранозаживляющий заслуживает пристального дальнейшего фармакогностического изучения, поэтому выявленные молекулярные маркеры могут быть рекомендованы также при установлении подлинности нового вида перспективного лекарственного сырья.
ВЫВОДЫ
1. Распределение видов на филогенетическом дереве согласуется с системой Д.Д. Соколова, и род Anthyllis разделяется на четыре подрода: Anthyllis s.str, Terniflora, Cornicina и Barba-Jovis, что подтверждается данными об инделях в различных участках генома.
2. Для всего рода Anthyllis свойственны: вставка из трех нуклеотидов (GTG) на участке ITS 1-2 и вставка (AAGT) в интроне гена rps16.
3. Виды, родственные связи которых не выявляются однозначно по молекулярным данным, нередко не находят однозначного места в системе и по данным морфологии (например, Anthyllis vulneraria).
4. Все выявленные молекулярные маркеры (индели) могут быть рекомендованы для идентификации ЛРС молекулярно-филогенетическими методами.
5. Älwares I., Wendel J.F. Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference // Mol. Phylogenet. Evol. 2003. Vol. 29. P. 417-434.
6. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32. № 5. P. 17921797.
7. Kelchner S.A. The evolution of non-coding chloroplast DNA and its application in plant systematics // Ann. Missouri Bot. Gard. 2000. Vol. 482498.
8. Löhne C., Borsch T. Molecular evolution and phylogenetic utility of the petD group II intron: a case study in basal angiosperms // Mol. Biol. Evol. 2005. Vol. 22. № 2. P. 317-332.
МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
