CC BY
34
Изучение динамики и уровня накопления интерферона в сыворотке крови лабораторных животных
С. Я. ЛОГИНОВА, В. Н. ЩУКИНА, С. В. БОРИСЕВИЧ
48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
The Study of the Dynamics and the Level of Accumulation of Interferon in the Serum of Laboratory Animals
S. YA. LOGINOVA, V. N. SHCHUKINA, S. V. BORISEVICH
48th Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Sergiev Posad
Проведённые исследования показали, что высокомолекулярные индукторы интерферона Ларифан®, Ридостин® и Рифа-стин вызывают «раннюю» продукцию интерферона с максимумом через 3 ч после введения. Повторное введение индукторов интерферона с интервалом 3 сут. не вызывает торможение синтеза интерферона, т. е. рефрактерность не наблюдается. Низкомолекулярный индуктор интерферона Арбидол® при пероральном применении также стимулирует синтез эндогенного интерферона в сыворотке крови кроликов, но значительно в более низких концентрациях. Реаферон® при внутримышечном введении приматам в терапевтически эффективных концентрациях обнаруживается в сыворотке крови обезьян через 6 ч после применения. При пероральном применении Реаферон® в сыворотке крови обезьян не выявлен. Также не удалось выявить препарат при внутримышечном применении его у кроликов даже при высоких дозах.
Ключевые слова: вирус везикулярного стоматита, культура клеток, Ларифан®, Рифастин, Ридостин®, Реаферон®, Арбидол®, зелёные мартышки, хлопковые крысы, кролики.
Studies have shown that high-molecular inducers of interferon Larigan®, Ridostin®, and Rifastin cause «early» interferon production which amounts to maximum 3 hours after injection. Re-introduction of interferon inducers with an interval of 3 days does not cause the inhibition of interferon synthesis, i.e. refractoriness is not observed. Oral administration of a low molecular weight interferon inducer Arbidol® also stimulates the synthesis of endogenous interferon in the blood serum of rabbits, but in much lower concentrations. Reaferon® when administered intramuscularly to primates in therapeutically effective concentrations is detected in the serum of monkeys 6 hours after application. Reaferon® is not detected in the serum of monkeys after oral administration. It was also impossible to identify the drug after intramuscular administration in rabbits, even at high doses.
Keywords: vesicular stomatitis virus, cell culture, Larifan®, Rifastin, Ridostin®, Reaferon®, Arbidol®, green monkeys, cotton rats, rabbits.
Введение
В силу определённых причин возрастает эпидемиологическая опасность заноса возбудителей опасных и особо опасных инфекций и распространение их на территории нашей страны. Вирусы животных могут становиться опасными для человека в случае их мутаций и рекомбинации. Так, птичий грипп приводит к быстрой гибели домашней птицы, а у диких птиц он может и не вызывать заболевания, несмотря на его носи-тельство [1—4]. Вызвавший несколько лет назад сенсацию вирус атипичной пневмонии оказался мутировавшим вариантом вируса китайских вивер [5—7], возбудитель заболевания ближневосточного респираторного синдрома (MERS) [8, 9]. Огромное разнообразие вирусов и их уникальная
© Коллектив авторов, 2018
Адрес для корреспонденции: 141306, г. Сергиев Посад-6. 48 ЦНИИ
изменчивость ставит серьёзную задачу перед разработчиками противовирусных средств.
За последние 10 лет сложилась стратегия молекулярного дизайна противовирусных препаратов. Современные методы исследования позволяют проследить весь цикл взаимодействия клетки с отдельной вирусной частицей в реальном времени, однако эти новые данные мало использованы для построения одной общей теории процесса вирус — клеточного взаимодействия, способной прогнозировать влияние различных штаммов вируса гриппа на культуру клеток или живой организм, а также для возможных путей блокирования данного процесса. В связи с этим особый интерес вызывают два класса препаратов: интерфероны (ИФ) и индукторы интерферонов (ИИФ) [10—12].
Для оценки возможности использования ИФ и ИИФ в качестве противовирусных лекарственных препаратов необходима адекватная лабораторная модель, позволяющая определить дина-
Таблица 1. Оценка динамики и уровня интерферониндуцирующей активности препаратов Ридостина® и Ла-рифана® в сыворотке крови хлопковых крыс
Препарат Уровень индуцированного интерферона, ИЕ /мл
время после 1-го введения время после 2-го введения (+72 ч) _ 3 ч 6 ч 9 ч 24 ч~ 3 ч 6 ч 9 ч 24 ч
Ридостин®_675 560_194_160 1480 810 680_320_
Ларифан® 1040 810 264 180 2440 1350 810 540
Таблица 2. Оценка динамики и уровня интерферониндуцирующей активности препаратов Ридостина®, Ла-рифана® и Рифастина в сыворотке крови кроликов породы шиншилла
Препарат Уровень индуцированного интерферона, ИЕ /мл
время после 1-го введения время после 2-го введения (+72 ч) время после 3-го введения (+144 ч) _ 3 ч 6 ч 12 ч 24 ч 3 ч 6 ч 12 ч 24 ч 3 ч 6 ч 12 ч 24 ч~
Ридостин® 1480 1750 3500 312 4950 7000 2100 740 11800 8300 2980 1250 Ларифан® 16384 27200 3420 1450 6800 8100 2430 610 5750 6800 2040 1040 Рифастин 7000 16384 2030 865 13650 13650 13650 1040 19400 23000 8100 865
мику и уровень накопления интерферона в крови экспериментальных животных.
Цель работы — изучение динамики и уровня накопления эндогенных и экзогенных интерферо-нов в сыворотке крови лабораторных животных, для последующего использования их в качестве лабораторной модели при оценке эффективности в отношении различных вирусных инфекций.
Материал и методы
Вирус. В работе использовали вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана, полученный из Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ФГБУ «ФНИИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Специализированной коллекции Филиала ФГБУ «48 ЦНИИ Минобороны России».
Культура клеток. Использована перевиваемая культура клеток почек зелёных мартышек — GMK-AH-1 (Д); почек кроликов — RK-13; почек крыс — Rat TK- и диплоидная культура клеток лёгкого эмбриона человека, клон КЛ-17. В качестве среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на растворе Хенкса, содержащую 2% сыворотки крупного рогатого скота. Перед применением препараты растворяли в физиологическом растворе.
Исследуемые препараты. Арбидол® — производства ЗАО «Мастерлек», Россия. Ридостин® (инъекционный) — дрожжевая дс РНК, производства ЗАО «ВЕКТОР-МЕДИКА», Кольцово, Россия. Ларифан® (инъекционный) — дсРНК фага f2 E.coli производства Института микробиологии им. Кир-хенштейна, Латвия. Рифастин — дрожжевая дсРНК. Реафе-рон-ЕС® — человеческий рекомбинантный «^-интерферон, производства ЗАО «Вектор-Медика», Кольцово, Россия.
Лабораторные животные. В работе использовали хлопковых крыс массой 40—50 г, кроликов породы «шиншилла», зелёных мартышек.
Оценка уровня интерферона в сыворотке крови лабораторных животных. Активность интерферона определяли по задержке цитопатического эффекта вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана, в культуре клеток Rat TK-, RK-13, GMK-AH-1 (Д) и КЛ-17. За титр интерферона (ИЕ5о/мл) принимали величину, обратную его наибольшему разведению, вызывающему задержку цитопатического эффекта в 50% культур.
Результаты и обсуждение
Для изучения динамики и уровня синтеза интерферона в сыворотке крови хлопковым крысам животным внутримышечно вводили индукторы интерферона Ридостин® и Ларифан в дозе 5 мг/кг
массы животного. Уровень индуцированного интерферона в сыворотке крови крыс рассчитывали по задержке цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (тест-вирус) в монослой-ной культуре клеток Rat TK- (табл. 1).
Исследования интерферониндуцирующей активности показало, что оба препарата вызывают синтез интерферона в сыворотке крови хлопковых крыс уже в первые часы после введения, то есть вызывают «раннюю» продукцию интерферона: пик синтеза приходится через 3 ч после введения и составляет для Ридостина® 675 ИЕ /мл, Ла-рифана® - 1040 ИЕ /мл.
Через 6 ч концентрация интерферона в сыворотке снижалась и составляла 560 ИЕ/мл и 810 ИЕ/мл; через 9 ч — 194 ИЕ/мл и 264 ИЕ/мл; через 24 ч — 160 ИЕ/мл и 180 ИЕ/мл, соответственно. Повторное введение индукторов интерферона через 72 ч не вызывает торможения индукции интерферона.
Оценивали интерферониндуцирующую способность Ридостина®, Рифастина и Ларифана® у кроликов при внутримышечном введении препаратов. Уровень индуцированного интерферона в сыворотке крови кроликов рассчитывали по задержке цитопатического действия вируса везикулярного стоматита (тест-вирус) в монослойной культуре клеток RK-13 (табл. 2). Кровь из краевой вены уха кроликов отбирали с интервалом 24 ч для оценки позднего интерферона, стимулированного низкомолекулярным индуктором интерферона, и с интервалом 3 ч — при оценке интерферо-ниндуцирующей активности высокомолекулярных индукторов интерферона.
Было показано, что изученные препараты индуцируют синтез интерферона в сыворотке крови кроликов уже в первые часы после введения. Препараты Ларифан®, Рифастин и Ридостин® вызывают «раннюю» продукцию интерферона с максимумом (16384, 7000 и 1480 ИЕ/мл, соответственно) через 3 ч после введения. За быстрым нарастанием концентрации индуцированного интерферона в сыворотке крови следует такое же быстрое её снижение. Хотя через 24 ч количество
Таблица 3. Оценка динамики и уровня интерферониндуцирующей активности препарата Арбидол® в сыворотке крови кроликов породы шиншилла при пероральном применении
Препарат Схема введения Уровень индуцированного интерферона, ИЕ /мл
препарата в различные сроки после первого введения препарата
_1ч_2ч_3ч_4ч_5ч_6ч_
Арбидол® _0, +24_167_180_65_34_24_24
0, +24, +48, +72, +96, +120_140_120_134_47_186_160
_0, +48, +96, +144_130_180_266_375_160_147
Таблица 4. Результаты оценки интерферониндуцирующей активности высокомолекулярных индукторов интерферона в сыворотке крови приматов
Вид животного Препарат Схема введения Уровень интерферона в сыворотке крови,
препарата ИЕ/мл в различные срок после введения, ч _ 3 6 12 24 _
Зелёные мартышки Ларифан® 0 819 2130 665 120
Через 72 1971 1260 597 104 ~
_Через 144_518_721_н. д. н. д._
Рифастин_0_1563 1137 579_98_
_Через 72_1516 784_206_75_
_Через 144_876_1683 н. д. н. д._
Ридостин®_0_1003 1137 475_98_
_Через 72_985_564_211_72_
Через 144 786 963 197 69
Таблица 5. Динамика и уровень накопления Реаферона® в сыворотке крови лабораторных животных
Вид животного Способ применения Разовая доза
препарата препарата, МЕ/кг
Зеленые мартышки внутримышечно 1х106
перорально 1х106
__3х107 ~
Кролики внутримышечно 1х106
интерферона в крови ещё является значительным (около 500 ИЕ/мл) и, соответственно, терапевтически значимым. Проведено изучение интерферониндуцирующей активности препарата Арбидол® в сыворотке крови кроликов породы шиншилла при пероральном применении по различным схемам в дозе 18,7 мг/кг (табл. 3).
Низкомолекулярный индуктор интерферона Арбидол® при пероральном применении в дозе 18,7 мг/кг массы животного стимулирует синтез эндогенного интерферона в сыворотке крови кроликов. Наиболее высокие и стабильно поддерживающиеся титры ИФ в сыворотке крови были отмечены при введении препарата с интервалом 48 ч. На протяжении всего срока наблюдения в крови сохранялся терапевтически эффективная концентрация ИФ. При 2-кратном введении Арбидола® с интервалом 24 ч в течение последующих 2 сут. концентрация ИФ также поддерживалась на терапевтически эффективном уровне, далее уровень интерферона в сыворотке крови резко снижался.
Изучение динамики и уровня накопления интерферона в сыворотке крови животных, индуцированного высокомолекулярными индукторами интерферона, проводили на зелёных мартышках.
Было показано, что при внутримышечном введении Ларифана®, Ридостина® и Рифастина в дозе 5 мг/кг массы животного индуцированный интерферон обнаруживается в сыворотке крови в высоких концентрациях в первые часы после
Уровень индуцированного интерферона, ИЕ /мл в различные сроки после введения 1-е введение 2-е введение
3 ч 6 ч 12 ч 24 ч 3 ч 6 ч 12 ч 24 ч
20 136 184 68 172 720 356 140
>8 >8 >8 >8 >8 >8 >8 >8
>8 >8 >8 >8 >8 >8 >8 >8
>8 >8 >8 >8 >8 >8 >8 >8
инъекции (табл. 4). Кинетика продукции интерферона свидетельствует, что препараты вызывают «раннюю» продукцию интерферона, пик его синтеза приходится на 3—6 ч. Повторное введение интерфероногенов не сопровождается торможением индукции интерферона.
Для изучения динамики и уровня появления Реаферона® в сыворотке крови обезьян и кроликов препарат вводили внутримышечно и перорально в дозе (1—3)х106 МЕ/кг двукратно с интервалом 24 ч (табл. 5). Через 3, 6, 12 и 24 ч после применения Реаферона® у животных отбирали кровь (у обезьян из подкожной вены голени, у кроликов — краевой вены уха).
Уровень Реаферона® в сыворотке крови животных оценивали по задержке цитопатического эффекта в монослойной диплоидной культуре клеток лёгкого эмбриона человека, клон КЛ-17, используя в качестве тест-вируса возбудитель везикулярного стоматита, штамм Индиана.
Результаты исследований показывают, что интерферон при внутримышечном введении в терапевтически эффективных концентрациях обнаруживается в сыворотке крови обезьян через 6 ч после применения. Максимальное количество интерферона наблюдается через 12 ч, а через 24 ч после введения препарата его концентрация снижается до 68 ИЕ/мл.
Повторное введение Реаферона® сопровождается резким увеличением препарата в сыворотке
крови. При пероральном применении Реаферон® в сыворотке крови обезьян не выявлен. Также не удалось выявить препарат при внутримышечном применении его у кроликов даже при высоких дозах.
Генетические манипуляции с вирусом позволили идентифицировать некоторые вирусные маркеры, которые связаны с вирулентностью и патогенезом. В последние годы в связи с разработкой фундаментальных подходов в области молекулярного дизайна появились принципиально новые возможности в конструировании лекарственных препаратов, максимально направленных на конкретную молекулярную мишень, характерную для вируса и отсутствующую в клетке хозяина. Для профилактики и лечения различных инфекционных заболеваний предпочтение отдаётся препаратам, обладающим возможно более широким спектром фармакологической активности.
Хотя прошло несколько десятилетий с начала использования препаратов интерферона, концепцию их клинического применения всё ещё можно сформулировать в самом общем виде. Это связано с тем, что ИФ влияет на многие реакции инфекционного, в частности противовирусного, и противоопухолевого иммунитета, но направленность этого влияния зависит от состояния иммунной и интерфероновой систем организма, а также дозы, кратности, способа введения препарата ИФ.
Препараты интерферона занимают особое место в ряду активно разрабатываемых и применяемых в настоящее время лекарственных средств неспецифической терапии и профилактики вирусных инфекций. Никакие иные противовирусные препараты не обладают в полном объёме функциональными свойствами, присущими или даже подобными ИФ. Индукторы интерферона обладают рядом существенных преимуществ.
В работе изучали динамику и уровень накопления эндогенного и экзогенного интерферона в сыворотке крови лабораторных животных, традиционно используемых в экспериментальных исследованиях по изучению эффективности противовирусных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Tumpey T.M., Suarez D.L., Perkins L.E.L. et al. Characterization of a highly pathogenic H5N1 avian Influenza a virus isolated from duck. Meat J Virol 2002; 76 (12): 6344—6355.
2. Kandeel A., Kareem E, Monhaved A. Ahmed et al. Zoonotic transmission of avian influenza virus (H5N1), Egypt, 2006—2009. Emerg Inf Diseas 2010; 16 (7): 1101—1107.
3. Teifke J.P., Klopfleisch R, Globig A. et al. Pathology of natural infections by H5N1 highly pathogenic avian influenza virus in mute (Cygnus olor) and whooper (Cygnus cygnus) swans. Vet Pathol 2007; 44: 137—143.
4. David L. Evolution of avian influenza viruses. Vet Microbiol 2000; 74: 15—27.
5. Bellini W.J., Campagnoli R.P., Icenogle J.P. et al. SARS coronavirus (SARS-CoV), Urbani strain // http://www.cdc.gov/ncidod/sars/pdf/ nucleoseq.pdf; SARS coronavirus, complete genome. Entrez NC_004718.
6. Holmes K.V. Adaptation of SARS coronavirus to human. Science 2005; 309 (5742): 1822—1823.
7. Lun Z.R., Qu L.H. Animal-to-human SARS-associated coronavirus transmission? Emerg Infect Dis 2004; 10 (5): 959.
Все использованные в работе лабораторные животные являются хорошей моделью для оценки индукторов интерферона. Введение препаратов высокомолекулярных индукторов интерферона в дозе 5 мг/кг массы тела с интервалом 72 ч позволяет поддерживать концентрацию эндогенного интерферона на высоком уровне.
Таким образом, повторное введение высокомолекулярных индукторов интерферона с интервалом 72 ч не вызывает торможение синтеза интерферона, т. е. рефрактерность не наблюдается.
Для низкомолекулярного индуктора интерферона Арбидола® оптимальным является интервал применения 48 ч. Высокомолекулярные индукторы интерферона стимулируют продукцию ИФ в более высоких концентрациях, чем Арбидол®.
Изучение динамики накопления экзогенного интерферона в сыворотке крови приматов и кроликов при внутримышечном введении препарата выявило, что у зелёных мартышек через 6 ч после применения отмечен терапевтически значимый уровень препарата. Введение интерферона один раз в сутки позволяет поддерживать терапевтически эффективную концентрацию препарата в крови обезьян. При пероральном введении Реа-ферон® расщепляется энзимами и в крови зелёных мартышек не выявляется.
При парентеральном применении препарата Реаферон® в высоких дозах (1х 106 МЕ/кг) препарат в крови кроликов на протяжении всего эксперимента не выявлен.
Таким образом, результаты исследований показывают, что при оценке эффективности видос-пецифических препаратов, таких как человеческий интерферон, для получения объективных результатов должны быть использованы приматы. Для оценки индукторов интерферона — любые лабораторные животные.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
8. Cauchemez S, Faser C, Van Kerkhove M.D., Donnelly C.A., Riley S., Rambaut A. Middle East Respiratory Syndrome coronavirus: quantification of the epidemic, surveillance biases, and transmissibility. Lancet Infect Dis 2014; 14: 50—56.
9. Assiri A., Abedi G.R., Saeed A.A. et al. Multifacility Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome in Taif, Saudi Arabia. Emerg Infect Dis 2016; 22 (1): 32—40.
10. Ершов Ф.И., Киселев О.ЖИнтерфероны и их индукторы (от молекул до лекарства). Москва, изд. «Гэотар-Медиа»; 2005. / Ershov F.I., Kiselev O.I. Interferony i ih induktory (ot molekul do lekarstva) . Moskva, izd. «Gjeotar-Media»; 2005. [in Russian]
11. Ершов Ф.И. Этиотропная терапия наиболее распространенных вирусных инфекций. Вестник РАМН. — 2001. — № 11. — С. 34—39. / Ershov F.I. Jetiotropnaja terapija naibolee rasprostranennyh virusnyh infekcij. Vestnik RAMN 2001; 11: 34—39. [in Russian]
12. Ершов Ф.И. Медицинская значимость интерферонов и их индукторов. Вестник РАМН. — 2004. — № 2. — С. 9—13. / Ershov F.I. Medicinskaja znachimost' interferonov i ih induktorov. Vestnik RAMN 2004; 2: 9—13. [in Russian]
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Логинова Светлана Яковлевна — д. б. н., ведущий научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
Щукина Вероника Николаевна — к. б. н., научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учрежде-
ние «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
Борисевич Сергей Владимирович — д. б. н., профессор, член-корр. РАН РФ, начальник института, Федеральное государственное бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации, Сергиев Посад
