CC BY
55УДК 57.083.31: 579.842.16: 579.842.22 DOI: 10.24412/1999-6780-2020-4-72-76
ИЗУЧЕНИЕДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДОВ KLEBSIELLA SPP. И PROTEUS SPP.
Шепелин А.П. (зам. директора), Полосенко О.В. (в.н.с.)*, Храмов М.В. (зам. директора), Марчихина И.И. (зав. лаб.)
Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская область, Россия
В последнее время спектр возбудителей внутриболь-ничных инфекций постоянно расширяется. Среди значимых из семейства Enterobacteriaceae в эпидемиологическом отношении отмечают представителей родов Klebsiella и Proteus.
Основным методом диагностики инфекций, вызываемых энт ер о бактериям и, является бактериологический. В статье описаны питательные среды, применяемые в практике микробиологических исследований при клебсиел-лезной и протейной инфекциях. Представлены данные по изучению диагностической ценности высокоселективных питательных сред отечественного производства: «диф-ференциально-злективная питательная среда для выделения клебсиелл» и «дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» и их сравнительный анализ с питательными средами, используемыми в современных условиях. Качество испытуемых сред оценивали по основным биологическим показателям на широком наборе тест-штаммов: чувствительность, скорость роста, дифференцирующие и ингибируюгцие свойства.
Ключевые слова: питательные среды, энтеробакте-рии, селективность, чувствительность, дифференцирующие свойства
EVALUATING OF THE DIAGNOSTIC VALUE OF HIGHLY SELECTIVE CULTURE MEDIA FOR ISOLATION OF BACTERIA OF THE GENUS KLEBSIELLA SPP. AND PROTEUS SPP.
Shepelin A.P. (deputy director), Polosenko O.V. (leading scientific researcher), Khramov M.V. (deputy director), Marchikhina I.I. (head of the laboratory)
* Контактное лицо: Полосенко Ольга Вадимовна, e-mail: polosenko.olga@yandex.ru
State Research Center for Applied Microbiology & Biotechnology, Obolensk, Moscow region, Russia
The spectrum of pathogens causing nosocomial infections is constantly expanding. Among the most significant of the Enterobacteriaceae family in epidemiological terms are representatives of the genera Klebsiella and Proteus.
The main method of diagnosis of infections caused by en-terobacteria is bacteriological. The nutrient media used in microbiological research of Klebsiella-asssociated and Proteus infections have been described in the article. There are data on evaluating of the diagnostic potential of highly selective domestic nutrient media, such as "differential-elective culture medium to isolate Klebsiella" and "differential-diagnostic medium to isolate bacteria of the genera Proteus, Morganella, Providencia" and their comparative analysis with nutrient media used in modern conditions. The media were tested for quality based on their key biological parameters (sensitivity, growth rate, differentiating and inhibiting properties) using a wide range of test strains.
Key words: culture media, enterobacteria, selectivity, sensitivity, differentiating properties
ВВЕДЕНИЕ
По критериям патогенности семейство Enterobacteriaceae включает практически все категории микроорганизмов. Наибольшую группу составляют условно-патогенные виды, адаптированные к обитанию в нестерильных областях организма и входящие в состав нормальной микробиоты. Их вирулентный потенциал весьма вариабелен, но они выступают частыми возбудителями поражений у человека (например, Klebsiella pneumoniae, Escherichia с olí или Proteus vulgaris) [1].
Особую актуальность приобретают представители семейства Enterobacteriaceae, у которых отмечена бурная эволюция в сторону накопления факторов вирулентности и антибиотикорезистентности [2-
4].
Наиболее ярким представителем таких бактерий является Klebsiella pneumoniae. Новые, гипервирулентные, варианты К. pneumoniae (hvKp) распространились сначала во внегоспитальных экологических нишах, вызывая опасные формы инфекций в виде гнойных абсцессов печени, эндофтальмитов и инфекций центральной нервной системы, а затем и в госпитальной среде. Клебсиеллы этого типа характеризуются наличием большого набора вирулентных свойств, способностью к мультиорганному распространению в пораженном организме и высоким уровнем смертности [5, 6].
В настоящее время опубликовано уже достаточно много сообщений о формировании генетических линий К. pneumoniae, обладающих одновременно свойствами гипервирулентных и мультирезистент-ных патогенов, в том числе — в России [7, 8].
Лабораторную диагностику клебсиеллезной инфекции традиционно осуществляют бактериологиче-
ским методом путем выделения и идентификации возбудителя из клинического материала на широко известных питательных средах: Эндо, Левина, Мак-Конки, К-2 (МПА с мочевиной, раффинозой и бромтимоловым синим) др. Из-за слабой селективности и дифференциации использование таких питательных сред в бактериологической практике диагностики клебсиеллезов малоинформативно, так как рост других грамотрицательных бактерий осложняет работу бактериологов по отбору колоний, характерных именно для клебсиелл, и их дальнейшей идентификации. Поэтому для определения принадлежности выделенных культур к клебсиеллам необходима постановка целого ряда подтверждающих тестов, а, следовательно, значительного времени и материальных затрат [9].
Известны питательные среды для выделения клебсиелл, принцип действия которых основан на утилизации преимущественно клебсиеллами инозита или рамнозы с одновременным добавлением антибиотиков или других ингибиторов сопутствующей микробиоты (желчные соли, кристаллический фиолетовый и др.). Стандартами ISO для выделения клебсиелл являются модифицированные среды МакКонки с инозитом, обладающие более высокими селективными свойствами, чем традиционные среды, но недостаточными для подавления Serratia spp. Дифференциация колоний клебсиелл от серраций по морфологии на этих средах весьма затруднительна.
В настоящее время возросла потребность в применении высокоселективных сред для выделения бактерий рода Klebsiella spp., которые могут ускорить выделение патогена из клинического образца. Быстрота получения результатов при микробиологических исследованиях в значительной степени влияет на диагностику, проведение терапевтических и противоэпидемических мероприятий.
Ряд представителей рода Proteus представляют большой интерес для микробиологов и инфекционистов, так как в последнее время они часто (примерно в 25% случаев) становятся причиной вторичных воспалительных процессов у человека. Что касается внутрибольничных инфекций, то наиболее часто протеи обнаруживают в гное из послеоперационных ран урологических больных и пациентов с трофическими язвами. Клинически значимыми штаммами протея являются P. mirabilis, P. rettgeri и Р. morganü. Реже из биологических материалов выделяют Р. vulgaris. Несмотря на чувствительность P. mirabilis к антибиотикам, описаны случаи вспышек инфекции, вызываемой штаммами, устойчивыми одновременно к нескольким препаратам [11].
Бактериологический метод остается основным и наиболее достоверным способом диагностики протейной инфекции. Диагноз инфекции, вызванной Proteus spp., зависит от результатов культурального
выделения микроорганизма. Для целей клинической микробиологии применяют ряд широко известных питательных сред, таких как среда Эндо, агар с эозин-метиленовым синим, среда Плоскирева. Слабоселективные среды без внесения соответствующих ингибиторов — антибиотиков, растворов хлоралгидрата или других компонентов, обычно не справляются с вуалеобразным ростом протеев.
Действующие до настоящего времени методические рекомендации «Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий — возбудителей внутрибольничных инфекций» для выявления бактерий родов Proteus и Providencia рекомендуют посев материала осуществлять на среду П-2, в состав которой в качестве селективных агентов входят желчные соли по Олькеницкому, кристаллический фиолетовый и полимиксин [11].
Рост протеев в виде изолированных колоний можно наблюдать на таких многокомпонентных питательных средах, как ксилозо-лизиновый дезокси-холатный агар (XLD), лактозный агар с тергитолом 7. Но они, как правило, обеспечивают рост и других грамотрицательных бактерий [12-14].
При переходе к современным методам исследования большое значение приобретает унификация процедуры выполнения используемых методик. Для усовершенствования этих методов микробиологического анализа при выделении протеев актуально применение эффективных высокоселективных питательных сред.
В работе представлены данные по изучению диагностической ценности высокоселективных питательных сред для выделения бактерий родов Klebsiella spp. и Proteus spp. и их сравнительный анализ с питательными средами, используемыми в настоящее время.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучены 155 тест-штаммов микроорганизмов, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН «ГНЦ ПМБ»: тест-штаммы энтеробактерий для определения специфической активности питательных сред по показателям чувствительности, скорости роста и проявлению типичных морфологических свойств и грамположительные тест-штаммы для определения ингибирующих свойств питательных сред.
Взвеси тест-штаммов готовили в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации, соответствующей 10 единицам по стандартному образцу мутности бактериальных взвесей ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-86И). Исходные взвеси доводили до нужных концентраций, используемых при исследованиях.
Для сравнительного изучения биологических показателей «дифференциально-элективной питательной среды для выделения клебсиелл» применяли модифицированный агар МакКонки, (MacConkey Agar, Modified) (HiMedia Laboratories Pvt Ltd); для «дифференциально-диагностической питательной среды для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» - среду лабораторного приготовления П-2 согласно методическим рекомендациям «Определение грамотрицательных потенциально патогенных бактерий — возбудителей внутри-больничных инфекций» [11].
Приготовление сухих питательных сред осуществляли в соответствии с инструкциями по применению, изучение диагностической ценности (специфическая активность: чувствительность, скорость роста, дифференцирующие и ингибирующие свойства) - согласно МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Питательные среды для выделения клебсиелл.
Наибольшим ингибирующим эффектом для придания селективных свойств питательным средам обладают соли основных желчных кислот — холевой и дезоксихолевой. При разработке сухой «диффе-ренциально-элективной питательной среды для выделения клебсиелл» в качестве селективного компонента были использованы сухие соли желчных кислот (СЖК), приготовленные по отечественной технологии. СЖК получали путем адсорбции примесей активированным углем с последующими стадиями фильтрации, щелочного гидролиза осветленной желчи 50%-ным раствором натрия гидроокиси с последующим освобождением от непрогидролизованных белков и высокомолекулярных пептидов путем обработки хлористым барием, отстаивания осажденных примесей, осаждения желчных кислот в кислой зоне, их нейтрализации в щелочной среде, последующего осветления активированным углем, фильтрации и высушивания [16].
При конструировании среды было доказано, что наличие в среде, полученной по новой технологии СЖК, кристаллического фиолетового и карбеницил-лина в значительной степени ингибировало рост грамположительных микроорганизмов и большинства представителей семейства Enterobacteriaceae, панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной обеспечивали ростовые потребности клебсиелл в азотистом питании, а мезо-инозит в присутствии нейтрального красного - дифференциацию клебсиелл [17].
При сравнительном анализе биологического контроля «дифференциально-элективной питательной среды для выделения клебсиелл» и среды MacConkey Agar, Modified выявили, что обе среды
обеспечивали хорошие ростовые свойства тест-штаммов К. pneumoniae subsp. pneumoniae 3534/51, К. pneumoniae subsp. pneumoniae 418 и К. oxytoca. Клебсиеллы, расщепляя инозит с образованием кислоты через 20-24 часа инкубации при 37 °С, формировали круглые, гладкие, слизистые колонии малинового цвета. Питательная среда полностью подавляла рост грамположительных бактерий: Staphylococcus spp., Streptococcus spp. из разведений 10~4. При посеве широкого набора тест-штаммов — представителей родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter и Proteus из разведений 10"5 была доказана хорошая ингибирующая способность сред. На среде сравнения, в отличие от «дифференциально-элективной питательной среды для выделения клебсиелл», в равнозначных условиях культивирования при тех же разведениях наблюдали рост Serratia spp. На всех средах при посеве из разведений 10_1-10"2 отмечали рост некоторых штаммов эшерихий, не мешающих выделению клебсиелл. В этом случае рост микроорганизмов рода Escherichia, не утилизирующих инозит, обнаруживали в виде круглых, гладких, бесцветных колоний.
Питательные среды для выделения протеев
В результате экспериментов по созданию «дифференциально-диагностической питательной среды для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» обоснованно показано, что среда, содержащая в качестве белковой составляющей панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной, обеспечивает рост и выделение микроорганизмов не только рода Proteus, но и родов Morganella и Providencia. Наличие в среде кристаллического фиолетового и полимиксина В значительно ингибирует рост грамположительных микроорганизмов и большинства представителей семейства Enterobacteriaciae.
Согласно проведенным сравнительным исследованиям, «дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» и среда П-2 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10~б через 20-24 ч инкубации при t (37±1) °С на всех засеянных чашках Петри обеспечивали рост тест-штаммов Providencia alcalifaciens NCTC 1068-50, Proteus mirabilis 3177, Proteus vulgaris HX 19 222, Morganella m or garni 1518 в количестве не менее 30 колоний в виде: колонии P. alcalifaciens NCTC 1068-50 - круглые, гладкие, полупрозрачные, розового цвета диаметром от 1,5 до 2,5 мм, колонии М. morganii 1518 — круглые, гладкие, полупрозрачные, розового цвета диаметром от 1,5 до 2,5 мм. Колонии P. mirabilis 3177 на «дифференциально-диагностической питательной среде для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» -полупрозрачные, розовые с темным центром, без
роения, диаметром от 1,0 до 2,5 мм. На среде П-2 отмечали незначительное почернение культуры, что свидетельствовало о слабых дифференцирующих свойствах среды.
«Дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» обеспечивала рост Р. vulgaris НХ 19 222 в виде круглых, гладких, полупрозрачных, желтоватых колонии без роения, со слабым пожелтением среды, иногда колонии имели темный центр, диаметром от 1,0 до 2,5 мм. На среде лабораторного приготовления П-2 рост тест-штамма Р. vulgaris НХ 19 222 при посеве из разведения 10~б отсутствовал, тогда как при посеве более высокой концентрации 10 4 -10"5 наблюдали рост в виде гладких, полупрозрачных, желтоватых колоний.
При посеве широкого набора тест-штаммов эн-теробактерий - представителей родов Escherichia, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Salmonella, Yersinia, Klebsiella из разведений 10"4 10"5 была показана достаточная для выделения и дифференциации ингибирующая способность обеих сред.
Обе испытуемые среды подавляли рост бактерий рода Streptococcus и Staphylococcus при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10 4 на всех засеянных чашках Петри через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1) °С.
При исследовании высокоселективной «диффе-ренциально-диагностической питательной среды для выделения бактерий родов Proteus, Morganella, Providencia» в сравнении со средой лабораторного приготовления П-2 выявили, что сухая среда удоб-
нее в использовании и обладает большей чувствительностью.
ВЫВОДЫ
Внесение в «дифференциально-элективную питательную среду для выделения клебсиелл» желчных солей отечественного производства позволило получить среду с хорошими ростовыми свойствами в отношении клебсиелл и, в совокупности с карбени-циллином и кристаллическим фиолетовым, обладающую выраженным ингибирующим эффектом в отношении грамположительных бактерий и большинства представителей семейства Enterobacteriaciae. Питательная среда зарегистрирована в установленном порядке в Росздравнадзоре, получено Регистрационное удостоверение № РЗН 2020/12517 от 11 ноября 2020 г.
При сравнительной оценке качества дифференциально-диагностических питательных сред по селективным свойствам установлено преимущество питательной среды для выделения бактерий родов Proteus, Providencia, Morganella по сравнению со средой лабораторного приготовления П-2 по чувствительности при росте тест-штамма Р. vulgaris НХ 19 222. Кроме того, ее применение дополнительно позволило по фенотипическим признакам дифференцировать изоляты протеев по способности образовывать сероводород.
Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шепелин А.П., Дятлов И.А. Питательные среды для энтеробактерий. Монография. Изд. Династия. 2017: 230 с. [Shepelin А.Р., Dyatlov I.A. Nutrient media for enterobacteria. Monografía. Ed. Dinastía. 2017: 230 p (In Russ)]
2. Анганова E.B., Распопина Л.В., Ветохина A.B., Духанина A.B. Антибиотикоустойчивость Klebsiella pneumoniae к препаратам цефалоспоринового ряда. Микробиология и вирусология. 2017; 2 (4): 43-47. [Anganova E.V., Raspopina L.V., Vetohina A.V., Duhanina A.V. Antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae to cephalosporin preparations. Microbiology and Virology. 2017; 2 (4): 43-47 (In Russ)].
3. Козлова H.C., Баранцевич H.E., Баранцевич Е.П. Чувствительность к антибиотикам штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных в многопрофильном стационаре. Инфекция и иммунитет. 2018; 8 (1): 79-84 [Kozlova N.S., Barantsevich N.E., Barantsevich Е.Р. Susceptibility to antibiotics in Klebsiella pneumoniae strains isolated in a multidisciplinary medical centre. Russian Journal of Infection and Immunity. 2018;8 (l):79-84 (In Russ)]. doi.org/10.15789/2220-7619-2018-1-79-84
4. Fursova N.K., Astashkin E.I., Knyazeva A.I., et al. The spread of blaOXA-48 and blaOXA-244 carbapenemase genes among Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Enterobacter spp. isolated in Moscow, Russia. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2015; 14:46. dx.doi.org/10.1186/sl2941-015-0108-y
5. Sachdev D.D., Yin M.T., Horowitz J.D., et al. Klebsiella pneumoniae K1 liver abscess and septic endophthalmitis in a U.S. resident. J. Clin. Microbiol. 2013; 51:1049e 51. dx.doi.org/10.1128/JCM.02853-12.
6. Prokesch B.C., TeKippe M., Kim J., et al. Primary osteomyelitis caused by hypervirulent Klebsiella pneumoniae. Lancet Infect. Dis. 2016; 16: el90e5. dx.doi.org/10.1016/S1473-3099 (16)30021-4
7. Lev A.I., Astashkin E.I., Kislichkina A.A., et al. Comparative analysis of Klebsiella pneumoniae strains isolated in 2012-2016 that differ by antibiotic resistance genes and virulence genes profiles. Pathog. Glob. Health. 2018;112 (3):142-151. dx.doi.org/10.1080/20477724.2018.1460949
8. Albasha A.M., Osmcm Е.Н., Abd-Alhalim S., et al. Detection of several carbapenems resistant and virulence genes in classical and hyper-virulent strains of Klebsiella pneumoniae isolated from hospitalized neonates and adults in Khartoum. BMC Res Notes. 2020; 13 (1): 312. DOI: dx.doi.org/10.1186/sl3104-020-05157-4
9. Полосенко О.В., Шепелин А.П., Фурсова Н.К. Современный подход к проблеме выделения клебсиелл с использованием питательных сред. Справочник заведующего КДЛ. 2020; 9: 23-34 [Polosenko O.V., Shepelin А.Р., Fursova N.K. A modern approach to the problem of Klebsiella isolation using nutrient media. Directory of the head of the CDL. 2020; 9: 23-34 (In Russ)].
10. Борзилов А.И., Коробова О.В., Комбарова Т.И. и др. Эффективность бактериофага РтЗ при лечении летальной инфекции у мышей, обусловленной Proteus mirabilis. Материалы V Национального конгресса бактериологов. 2019: 18-19 [Borzilov A.I., Korobova O.V., Kombarova T.I., et al. Efficacy of Pm3 bacteriophage in the treatment of lethal infection in mice caused by Proteus mirabilis. Proceedings of the V National Congress of bacteriologists. 2019: 18-19 (In Russ)].
11. Определение грамотрицательных потенциально-патогенных бактерий — возбудителей внутрибольничных инфекций М., 1986. Утв. 03.06.1986 Минздрав РСФСР. Дата актуализации 01.02.2020 [Determination of gram-negative potentially pathogenic bacteria-pathogens of nosocomial infections M., 1986. Approved 03.06.1986 by Russian Federation Minzdrav. Date of actualization 01.02.2020 (In Russ)].
12. Шепелин А.П., Полосенко О.В. Идентификация протеев на отечественных питательных средах. Материалы V Национального конгресса бактериологов. Изд. Династия, 2019: 87. [Shepelin А.Р., Polosenko O.V. Identification of Proteas on domestic nutrient media. Proceedings of the V National Congress of Bacteriologists. Ed. Dynasty, 2019: 87 (In Russ)].
13. Шепелин А.П., Полосенко О.В. Сравнительный анализ питательных сред для выделения протеев. Бактериология. 2019; 4 (3): 31-37 [Shepelin А.Р., Polosenko O.V. Comparative analysis of nutrient media for Proteus isolation. Bacteriology. 2019; 4 (3): 31-37 (In Russ)].
14. Шепелин А.П., Полосенко О.В. Современные возможности культурального метода выявления протеев. Современная лабораторная диагностика. 2019. 3: 28-30. [Shepelin А.Р., Polosenko O.V. Modem possibilities of the cultural method of detecting Proteas. Modern laboratory diagnostics. 2019. 3: 28-30 (In Russ)].
15. Методы контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. МУК 4.2.2316-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008: 67 с. [Modern possibilities of the cultural method of detecting Proteas. Modem laboratory diagnostics, 2008: 67 p. (In Russ)].
16. Шепелин А.П., Марчихина И.И., Шолохова Л.П., Полосенко О.В., Миронова Е.Н. Способ производства сухих очищенных солей желчных кислот для бактериологии. Патент RU 2705314 С1 Рос. Федерация: МПК: C12N 1/20, А61К 31/575, заявитель и патентообладатель ФБУН ГНЦ ПМБ. Заявл. 2019.03.18; опубл. 2019.11.06 [Shepelin А.Р., Marchikhina I.I., Sholokhova L.P., Polosenko O.V., Mironova E.N. Method of production of dry purified bile acid salts for bacteriology. Patent RU 2705314 CI ROS. Federation: IPC: C12N 1/20, A61K 31/575, applicant and patent holder of the Federal state budgetary INSTITUTION SSC PMB. Appl. 2019.03.18; publ. 2019.11.06 (In Russ)].
17. Шепелин А.П., Марчихина И.И., Полосенко О.В., Шолохова Л.П. Дифференциально-элективная питательная среда для выделения клебсиелл. Патент RU 2704854 С1; МПК C12N 1/20, C12Q 1/04, C12R 1/01 заявитель и патентообладатель ФБУН ГНЦ ПМБ. № 2019107617. Заявл. 2019.03.18; опубл. 2019.10.31 [Shepelin А.Р., Marchikhina I.I., Polosenko O.V., Sholokhova L.P. Differential-elective nutrient medium for Klebsiella isolation. Patent RU 2704854 CI; IPC C12N 1/20, C12Q 1/04, C12R 1/01 applicant and patent holder of the Federal state budgetary INSTITUTION SSC PMB. № 2019107617. Appl. 2019.03.18; publ. 2019.10.31 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 09.12.2020 Рецензент: JI.A. Кафтырева
