CC BY
7
УДК 619:636.2
ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НОВОГО СРЕДСТВА НА ПРОЦЕСС ФОРМИРОВАНИЯ БИОПЛЕНОК БАКТЕРИЯМИ, УЧАСТВУЮЩИМИ В РАЗВИТИИ ЭНДОМЕТРИТА У КОРОВ
ХАМИДУЛЛИН Р.Р.,
аспирант отдела биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: [email protected], тел: 8-987-270-80-27.
ТРЕМАСОВА А.М.,
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, заведующий отделом биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: [email protected], 8-917-868-88-34.
ГАНИЕВ ИМ.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, отдела биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: [email protected], 8-927-672-39-96.
ТРЕМАСОВ Ю.М.,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, отдела биотехнологии, ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», e-mail: [email protected], 8-904-664-42-93.
Реферат. В статье представлены результаты научного эксперимента по изучению влияния нового комплексного средства, разработанного сотрудниками ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», на процесс формирования биопленок патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Новое комплексное средство предназначено для лечения и профилактики эндометритов у животных и имеет в своем составе компоненты, обладающие антисептическими, миотропными, ранозаживляющими и противовоспалительными действиями. Исследование влияния разработанного средства на способность бактерий к образованию биопленки осуществляли в двух сериях экспериментов. В качестве тест-культур для проведения опытов in vitro использовали изо-ляты Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Proteus vulgaris, выделенные от коров, больных эндометритом. Изначально определяли влияние средства на процесс образования биопленок микроорганизмами, затем оценивали способность средства к разрушению уже сформировавшихся микробных биопленок. Определены концентрации средства, оказывающие более выраженный эффект. Разработанное средство in vitro обладает способностью к снижению интенсивности процесса формирования и разрушению уже сформированных микробных биопленок.
Ключевые слова: эндометрит, микроорганизмы, биопленки, этиология, корова, лечение, изоляты, патогенные и условно-патогенные бактерии, концентрации, средства.
STUDY OF THE EFFECT OF A NEW DRUG ON THE FORMATION OF BIOFILMS FORMED BY BACTERIA INVOLVED IN THE DEVELOPMENT OF ENDOMETRITIS IN COWS
KHAMIDULLIN R.R.,
Postgraduate Student, Department of Biotechnology, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: [email protected], 8-987-270-80-27.
TREMASOVA A.M.,
Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher, Head of Biotechnology, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: [email protected], 8-917-868-88-34.
GANIEV I.M.,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Department of Biotechnology, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: [email protected], 8-927-672-39-96.
TREMASOV Y.M.,
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Department of Biotechnology, Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, e-mail: [email protected], 8-904-664-42-93.
Essay. The article presents the results of a scientific experiment to study the effect of a new complex agent developed by the staff of FSBSI «FCTRBS-ARrVI» on the process of biofilm formation by pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms. The new complex remedy is intended for the treatment and prevention of endometritis in animals and has components with antiseptic, myotropic, wound healing and anti-inflammatory effects. The study of the effect of the developed agent on the ability of bacteria to form biofilms was carried out in two series of experiments. Isolates of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Proteus vulgaris isolated from cows with endometritis were used as test cultures for in vitro experiments. Initially, the effect of the agent on the formation of biofilms by microorganisms was determined, then the ability of the agent to destroy already formed microbial biofilms was evaluated. Concentrations of the agent that have a more pronounced effect have been determined. The developed in vitro agent has the ability to reduce the intensity of the formation process and the destruction of already formed microbial biofilms.
Keywords: endometritis, microorganisms, biofilms, etiology, cow, treatment, isolates, pathogenic and conditionally pathogenic bacteria, concentrations, drugs.
Введение. Сохранение стабильного воспроизводства стада продолжает оставаться актуальной проблемой для повышения рентабельности сельскохозяйственных предприятий. Для успешного воспроизводства требуется рождение хотя бы одного жизнеспособного теленка в течение 12-14 месяцев после предыдущего отела. Это, в свою очередь, требует быстрого повторного зачатия. Изменения в физиологии коров, связанные с интенсивным увеличением генетического потенциала удоя молока в сочетании с проблемами оптимального управления кормлением, содержанием и увеличением размера стада способствует снижению фертильности [1-3]. Стресс, связанный с отелом, дисбаланс кормления и пониженная общая резистентность являются важными факторами, способствующими ухудшению здоровья. Многие болезни у молочных коров, чаще всего возникают в первые 2 месяца лактации и приводят к выбраковке, а значит к сокращению срока их хозяйственного использования. К распространенным послеродовым заболеваниям относят задержку плодных оболочек, метрит и эндометрит, хромоту и смещение сычуга, клиническую гипокаль-циемию и кетоз. Все эти заболевания чаще всего возникают в начале лактации и, следовательно, в период, предшествующий осеменению. Инфекционные заболевания репродуктивных органов встречаются примерно у 40 %
коров, а эндометрит является одной из главных причин бесплодия в молочном стаде [46].
В лечении эндометритов главной целью является восстановление репродуктивной функции у животных [7-9]. В связи с чем перед ветеринарными специалистами стоит задача не только подавить патогенную микрофлору, но и купировать воспалительный процесс [10].
Многие бактерии, являющиеся причиной возникновения инфекций у животных, растут с образованием биопленок. Биопленка - обладающее пространственной и метаболической структурой сообщество микроорганизмов, расположенных на поверхности раздела сред и погружённых во внеклеточный полимерный матрикс [11]. Способность к образованию биопленки - своеобразная стратегия выживания бактериальных популяций, позволяющая в 1000 раз повысить их устойчивость к антибактериальным препаратам [12].
Поиск и разработка препаратов для лечения эндометритов у животных, этиологическим фактором возникновения которых является патогенная и условно-патогенная микрофлора, остается актуальной задачей современной ветеринарной науки.
Цель исследования заключалась в изучении влияния нового комплексного средства на формирование биопленок патогенными и ус-
ловно-патогенными микроорганизмами, являющимися этиологическим фактором развития эндометритов.
Объекты и методы. Исследования проведены в отделении биотехнологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань). Для проведения экспериментов использовали новое комплексное средство, разработанное сотрудниками ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», имеющее в своем составе компоненты, обладающие антисептическими, миотропными, ранозаживляю-щими и противовоспалительными действиями.
Изучение влияния разработанного средства на процесс образования биопленок осуществляли в двух сериях экспериментов. В первой серии определяли влияние средства на процесс образования биопленок, во второй -оценивали способность средства к разрушению уже сформировавшихся микробных биопленок.
В экспериментах использовали изоляты бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Proteus vulgaris выделенные нами от коров, больных эндометритом в одном из хозяйств Кукморского района Республики Татарстан. Данные микроорганизмы in vitro обладают выраженной способностью к формированию биопленок.
Для проведения экспериментов готовили суточные культуры микроорганизмов, путем их посева на скошенный мясо-пептонный агар и инкубации при 37 °С в течении 24 часов.
Из полученных суточных культур по отраслевому стандарту мутности готовили разведения на стерильном физиологическом растворе с содержанием 5х106 КОЕ/см3.
В первой серии опытов в лунки полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносили по 100 мкл суспензии микроорганизмов и исследуемое средство в концентрациях 25,0 %; 50,0 % и 75,0 %. В контрольные лунки исследуемое средство не вносили. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 48 ч при непрерывном низкоамплитудном встряхивании на термошейкере PST-100 (Латвия).
Во второй серии экспериментов в лунки полистиролового планшета вносили 100 мкл суспензии микроорганизмов. Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч при непрерывном низкоамплитудном встряхивании на термошейкере. По истечении указанного времени в лунки с суспензией микроорганизмов вносили исследуемое средство в
концентрациях 25,0 %; 50,0 % и 75,0 %, после чего посевы инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Контролем служили лунки с суспензией микроорганизмов без добавления средства. Через 24 ч из лунок удаляли содержимое и проводили окрашивание биопленки путем внесения 0,1 % водного раствора кристаллического фиолетового при 37 °С в течение 30 мин. Затем раствор кристаллического фиолетового полностью удаляли и проводили экстракцию красителя из биопленки путем добавления 96 % этилового спирта и экспозиции в течение 1 ч при комнатной температуре. Для построения калибровочной кривой готовили спиртовые растворы кристаллического фиолетового с концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 25,0 и 50,0 мг/л. Измерение оптической плотности проводили на фотометре микропланшетном Мultisсan FC (Финляндия), длина волны 580 нм.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel с использованием дополнительной функции «анализ данных».
Результаты исследований и их обсуждение. По результатам первой серии экспериментов установлено, что испытуемое средство в концентрации 50,0 % снижает интенсивность процесса образования биопленок изоля-тами E. coli, Staph. aureus и P. vulgaris относительно контроля на 20,3 % (Р<0,05), 18,4 % (Р<0,05) и 38,5 % (Р<0,01) соответственно.
Под влиянием изучаемого средства в концентрации 75,0 % у изолятов E. coli, Staph. aureus и P. vulgaris процесс формирования биопленок снижался относительно контроля на 38,4 % (Р <0,05), 36,3 % (Р<0,05) и 74,0 % (Р<0,001) соответственно.
Испытуемое средство в концентрации 25,0 % оказывало менее выраженный эффект на процесс биопленкообразования тест-микроорганизмами (рисунок 1).
Результаты второй серии опытов, направленных на определение наиболее эффективной концентрации испытуемого средства, при которой оно способно разрушать уже сформированные микробные биопленки, представлены на рисунке 2.
В отношении изолятов E. coli, Staph. aureus и P. vulgaris, выделенных от больных коров, испытуемое средство в концентрации 50,0 % обладало способностью разрушать сформировавшиеся биопленки относительно контроля на 34,6 % (Р<0,001), 32,4 % (Р<0,05) и 37,0 % (Р<0,001) соответственно.
Рисунок 1 - Влияние различных концентраций испытуемого средства на процесс формирования биопленок тест-микроорганизмами
Рисунок 2 - Влияние различных концентраций испытуемого средства на процесс разрушения уже сформированных микробных биопленок
При использовании концентрации испытуемого средства 75,0 % разрушение биопленок относительно контроля отмечали на 58,0 %, 66,8 % и 72,0 % (Р<0,001) соответственно.
Испытуемое средство в концентрации 25,0 % по отношению к изолятам E. coli, Staph. aureus и P. vulgaris оказалось менее эффективно.
Выводы. По результатам исследования установлено, что разработанное комплексное
средство в концентрациях 50,0 % и 75,0 % обладает выраженной способностью к снижению интенсивности процесса формирования и разрушению уже сформированных микробных биопленок in vitro. Следовательно, данное средство может применяться в терапии эндометритов, этиологическими факторами возникновения которых является патогенная или условно-патогенная микрофлора.
Список использованных источников
1. Приемы повышения воспроизводительной функции в интенсивном молочном животноводстве / К.В. Племяшов, Г.С. Никитин, Е.А. Корочкина и др. - СПб.: Проспект Науки, 2020. - 226 с.
2. Титова С.В. Воспроизводительные качества молочных коров при разном уровне удоя // Аграрная наука Евро-Северо-Востока. - 2021. - Т. 22. - № 4. - С. 589-596.
3. Pinedo, Santos P.J.E.P. et al. Associations of reproductive indices with fertility outcomes, milk yield, and survival in Holstein cows / Journal of Dairy Science. - 2020. - Vol. 103. - No. 7. - Pp. 6647-6660.
4. Григорьева Т.Е. Кондручина С.Г., Трифонова Л.А. Результаты применения электропунктуры для профилактики болезней матки у коров после родов // Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных: матер. Междунар. науч.-практич. конф., посвященной 85-летию со дня рождения профессора Г.А. Черемисинова и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров. - Воронеж: Изд-во Истоки. - 2012. - С. 162-166.
5. Ильинский Е.В. Физиология размножения и предупреждения бесплодия крупного рогатого скота. - Краснодар: Кн. изд-во, 1972. - 224 с.
6. Gilbert R.O. Symposium review: Mechanisms of disruption of fertility by infectious diseases of the reproductive tract / Journal of Dairy Science. - 2019. - Vol. 102. - No. 4. - Pp. 3754-3765.
7. Тремасов Ю.М. Фармако-токсикологическая и биологическая оценка препарата ДС-2 и его применение при эндометритах у животных: специальность 16.00.04 «Ветеринарная фармакология с токсикологией»: дисс. ... на соиск. учен. степ. канд. биол. - Казань, 2009. - 137 с.
8. Войтенко Л.Г. Система комплексной фармакотерапии острого послеродового эндометрита у коров: автореф. докт. вет. наук. - Краснодар, 2012. - С. 41.
9. Тремасов Ю.М., Тремасова А.М. Препарат ДС-2 для лечения эндометритов у животных // Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов: матер. Междунар. науч. -практич. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С. 74-76.
10. Иванюк В.П., Бобкова Г.Н. Этиологические аспекты и разработка лечебных приёмов при остром катаральном мастите у коров // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2020. - № 1(81). - С. 136-139.
11. Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Биопленка - «город микробов» или аналог многоклеточного организма? // Микробиология. - 2007. - № 76(2). - С. 149-163.
12. Биопленки: основные методы исследования: учебно-методическое пособие / А.М. Марда-нова, Д А. Кабанов, Н.Л. Рудакова, М.Р. Шарипова. - Казань: К(П)ФУ, 2016. - 42 с.
Spisok ispoFzovanny'x istochnikov
1. Priemy' povy'sheniya vosproizvoditel'noj funkcii v intensivnom molochnom zhivotno-vodstve / K.V. Plemyashov, G.S. Nikitin, E.A. Korochkina i dr. - SPb.: Prospekt Nauki, 2020. - 226 s.
2. Titova S.V. Vosproizvoditel'ny'e kachestva molochny'x korov pri raznom urovne udoya // Agrarnaya nauka Evro-Severo-Vostoka. - 2021. - T. 22. - № 4. - S. 589-596.
3. Pinedo, Santos P.J.E.P. et al. Associations of reproductive indices with fertility outcomes, milk yield, and survival in Holstein cows / Journal of Dairy Science. - 2020. - Vol. 103. - No. 7. - Pp. 6647-6660.
4. Grigor'eva T.E. Kondruchina S.G., Trifonova L.A. Rezul'taty' primeneniya e'lektropunktury' dlya profilaktiki boleznej matki u korov posle rodov // Sovremenny'e problemy' veterinarnogo akusherstva i biotexnologii vosproizvedeniya zhivotny'x: mater. Mezhdunar. nauch.-praktich. konf., posvyashhennoj 85-letiyu so dnya rozhdeniya professora G.A. Cheremisinova i 50-letiyu sozdaniya Voronezhskoj shkoly' veterinarny'x akusherov. - Voronezh: Izd-vo Istoki. - 2012. - S. 162-166.
5. Il'inskij E.V. Fiziologiya razmnozheniya i preduprezhdeniya besplodiya krupnogo rogatogo skota. -Krasnodar: Kn. izd-vo, 1972. - 224 s.
6. Gilbert R.O. Symposium review: Mechanisms of disruption of fertility by infectious diseases of the reproductive tract / Journal of Dairy Science. - 2019. - Vol. 102. - No. 4. - Pp. 3754-3765.
7. Tremasov Yu.M. Farmako-toksikologicheskaya i biologicheskaya ocenka preparata DS-2 i ego primenenie pri endometritax u zhivotny'x: special'nosf 16.00.04 «Veterinarnaya farmakologiya s toksikologiej»: diss. ... na soisk. uchen. step. kand. biol. - Kazan', 2009. - 137 s.
8. Vojtenko L.G. Sistema kompleksnoj farmakoterapii ostrogo poslerodovogo e'ndometrita u korov: avtoref. dokt. vet. nauk. - Krasnodar, 2012. - S. 41.
9. Tremasov Yu.M., Tremasova A.M. Preparat DS-2 dlya lecheniya e'ndometritov u zhivotny'x // Biotexnologii v reshenii e'kologicheskix problem prirody', obshhestva i cheloveka v Evrazii: vzglyad molody'x ucheny'x i specialistov: mater. Mezhdunar. nauch.-praktich. konf. molody'x ucheny'x i specialistov. - Kazan', 2013. - S. 74-76.
10. Ivanyuk V.P., Bobkova G.N. E'tiologicheskie aspekty' i razrabotka lechebny'x priyomov pri ostrom kataral'nom mastite u korov // Izvestiya Orenburgskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. - 2020. - № 1(81). - S. 136-139.
11. Nikolaev Yu.A., Plakunov V.K. Bioplenka - «gorod mikrobov» ili analog mnogokletochnogo organizma? // Mikrobiologiya. - 2007. - № 76(2). - S. 149-163.
12. Bioplenki: osnovny'e metody' issledovaniya: uchebno-metodicheskoe posobie / A.M. Mar-danova, D.A. Kabanov, N.L. Rudakova, M R. Sharipova. - Kazan': K(P)FU, 2016. - 42 s.
