CC BY
28
Труды Кольского научного центра РАН. Химия и материаловедение. Вып. 5. 2021. Т. 11, № 2. С. 285-290. Transactions tola Science Centre. Chemistry and Materials. Series 5. 2021. Vol. 11, No. 2. P. 285-290.
Научная статья
УДК 546.05'41'562'185:165.2
DOI:10.37614/2307-5252.2021.2.5.057
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ОБРАЗЦОВ МЕДЬ-МОДИФИЦИРОВАННОГО ГИДРОКСИАПАТИТА
Анастасия Александровна Шнайдмиллер1М, Дмитрий Александрович Федоришин2, Наталья Михайловна Коротченко3
12 3Национальный исследовательский Томский государственный университет (НИ ТГУ), Томск, Россия 1 shnaidmiller97@gmail. com 2strix187@yandex.ru 3korotch@mail. ru
Аннотация
Статья посвящена исследованию биологической активности in vitro и in vivo образцов медь-модифицированного гидроксиапатита (CurA), полученных микроволновым жидкофазным синтезом. Кинетика осаждения ионов кальция из SBF-раствора на подложках из CurA не зависит от количества ионов меди в образцах. Имплантация образцов CurA вызывают местную реакцию отторжения, выраженность которой возрастает с увеличением количества ионов меди. Ключевые слова:
гидроксиапатит, жидкофазный синтез, СВЧ-синтез. РФА, SBF, имплантация, местное действие Original article
RESEARCH OF THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF COOPER-DOPED HYDROXYAPATITE SAMPLES
Anastasia A. Shnajdmiller1M, Dmitriy A. Fedorishin2, Natalia M. Korotchenko3
12 3National Research Tomsk State University, Tomsk, Russia
1 shnaidmiller97@gmail.com
2strix187@yandex.ru
3korotch@mail.ru
Abstract
The paper considers in vitro and in vivo research of the biological activity of cooper-doped hydroxyapatite samples (CuHAp). Samples were obtained by microwave-assisted liquid-phase synthesis. Kinetic of the calcium ions sedimentation on CuHAp samples from SBF solution does not depend from cooper ions quantity. Implantation of CuHAp samples induces local rejection reaction. The reaction severity incises with increase of cooper ions quantity. Keywords:
hydroxyapatite, liquid-phase synthesis, microwave synthesis, XRD, SBF, implantation, local effects
Гидроксиапатит (ГА), являясь основной неорганической частью костной ткани, находит применение в медицине как в качестве имплантата для замены поврежденной кости, так и в качестве его покрытия или наполнителя. Однако при проведении хирургических вмешательств существует риск возникновения инфекции, что требует изменения свойств синтетического ГА, в частности, увеличения его антибактериальной активности. Одним из способов модификации ГА является введение в него катионов и анионов, улучшающих такие свойства, как биосовместимость, антибактериальный эффект, механическая прочность, растворимость. Известно, что ионы меди обладают антибактериальным, фунгицидным и противовирусным действием [1], поэтому они могут придать данные свойства ГА.
Методика эксперимента
Синтез образцов
В данной работе медьзамещенный гидроксиапатит (СиГА) был получен методом осаждения из водных растворов с последующей обработкой СВЧ-излучением согласно методике [2]. Процесс синтеза можно описать следующим уравнением:
(10-х)Са(Шз)2 + xCu(NOs)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH = Ca<io -x)Cux(PO4)6(OH)2 + 2ONH4NO3 + 6H2O,
где x — количество (моль) ионов меди, от 0,1 до 2,0.
© Шнайдмиллер А. А., Федоришин Д. А., Коротченко Н. М., 2021
После фильтрования и просушивания осадок измельчали и прокаливали в течение 3 часов при 800 °С. Всего было синтезировано 9 образцов с различной степенью замещения:
Номер образца 1 2 3 4 5 6 7 8 9
х, моль Си2+ 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,3 1,5 1,7 2,0
Фазовый состав синтезированных порошков СиГА 1, 3, 5, 7, 9 определен методом РФА на дифрактометре XRD-6000 с CuKa-излучением (Материаловедческий центр коллективного пользования ТГУ) с использованием баз данных PDF 4+, а также программы полнопрофильного анализа POWDER CELL 2.4.
Исследование биологической активности образцов СиГА в SBF-растворе
Раствор SBF (с англ. simulated body fluid) подобен по ионному составу и pH неорганической составляющей плазмы крови человека и может быть применен при оценке биологической активности образцов тестируемого материала, а именно процесса формирования кальцийфосфатного слоя (КФС) на его подложке [3]. Исследование включало следующие этапы: подготовка подложек из образцов медь-модифицированного ГА; помещение подложек в SBF-раствор; комплексонометрическое определение ионов кальция и магния в SBF-растворе.
Подложки представляли собой таблетки диаметром 7 мм, спрессованные под давлением 75-80 бар из порошков непрокаленного СиГА, которые после этого отжигались в муфельной печи в течение 3 часов при 800 °С. SBF-исследования проведены с подложками, изготовленными из образцов СиГА под номерами 1, 2, 3, 5, 8, которые были помещены в раствор.
Таблетки-подложки ставились на ребро на дно пластиковых стаканчиков, после чего заливались 25 мл раствора SBF и помещались в термостат с температурой 37 °С. Смена раствора происходила каждые 24 часа, после чего в растворах из-под таблеток комплексонометрически по методике [4] определялись концентрации ионов Ca2+ и Mg2+ и сравнивались с таковыми в заливаемом SBF-растворе.
До и после эксперимента поверхность подложек была исследована при помощи электронного микроскопа Hitachi TM-3000 в режиме высокого вакуума с ускоряющим напряжением 15 кэВ с анализатором для рентгеноспектрального микроанализа Quantax 70.
Исследование местного действия образцов СиГА после имплантации
Образцы модифицированного гидроксиапатита для имплантации подготавливались в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 10993-6-2011 и представляли собой спрессованные таблетки диаметром 4 мм и высотой 3 мм. Каждый имплантируемый образец стерилизовался выдерживанием в течение 30 мин в растворе 96 %-го этанола с последующей обработкой ультрафиолетом в течение 1 часа. После окончательной подготовки и стерилизации все манипуляции с имплантатами проводились в асептических условиях для того, чтобы не допустить повреждения или контаминацию образцов до или во время имплантации. Проведено биотестирование трех образцов СиГА: 1 (х = 0,1), 2 (х = 0,3) и 3 (х = 0,5).
Тест-системой для проведения эксперимента служили мыши домовые (Mus musculus) возрастом 4 недели и средней массой 25-30 г (n = 25). Все мыши разделялись на пять равных групп — опыт (три образца), положительный контроль и отрицательный контроль. Численность каждой группы составила 5 животных. Мышам, входящим в состав опытных групп, устанавливались имплантаты, изготовленные из образцов СиГА, мышам из группы положительного контроля устанавливались имплантаты, изготовленные из немодифицированного ГА. Над животными из группы отрицательного контроля проводились те же экспериментальные процедуры, что из остальных групп. Ее главное отличие от двух других состояло в том, что животным из данной группы не устанавливались имплантаты.
Продолжительность эксперимента — 45 дней — является оптимальной для оценки биосовместимости гидроксиапатита и наблюдения эффектов, вызванных непосредственно операцией и действием объектов исследования — имплантатов. Раз в два дня все экспериментальные животные подвергались тщательному методическому осмотру в условиях естественного местообитания для определения боли у них и общего состояния. При этом также контролировалась масса экспериментальных животных, потребление ими воды и корма.
После выведения животных из эксперимента они подвергались гуманной эвтаназии с последующей полной некропсией. В процессе некропсии образцы имплантов вырезались вместе с достаточным количеством окружающей ткани для оценки местной тканевой реакции, высушивались
на воздухе и передавались для проведения химических и морфологических исследований. Образцы ткани из мест установки имплантатов подвергались фиксации с помощью раствора забуференного формалина по стандартному протоколу и гистологическому исследованию.
Результаты и обсуждение Рентгенофазовый анализ
Согласно результатам РФА, большинство образцов СиГА — двухфазные (табл.). С увеличением количества ионов меди в образцах соотношение между основными фазами ГА (Ca5(PO4)з(OH)) и ТКФ (Caз(PO4)2) происходит в сторону увеличения доли ТКФ. Уменьшение параметров элементарной ячейки ГА в образцах СиГА при увеличении содержания ионов меди является косвенным доказательством того, что ионы Си2+ входят в кристаллическую решетку гидроксиапатита, возможно, образуя твердый раствор замещения.
Результаты рентгенофазового анализа порошков ^ГА
Номер X Обнаруженные фазы Содержание, Параметры решетки
образца массовая доля, % а, А с, А
1 0,1 Ca5(PO4)з(OH), Hexagonal 100 9,4142 6,8767
3 0,5 Ca5(PO4)з(OH), Hexagonal 85 9,4137 6,8763
Caз(PO4)2, Rhombohedral 15 10,3842 37,3029
Ca5(PO4)з(OH), Hexagonal 46 9,4130 6,8729
5 0,9 Caз(PO4)2, Rhombohedral 52 10,3952 37,3029
CuO, Monoclinic 2 4,6340 5,0897
Ca5(PO4)з(OH), Hexagonal 6 9,4539 6,8664
7 1,5 Caз(PO4)2, Rhombohedral 91 10,4398 37,4303
CuO, Monoclinic 3 4,6925 5,1391
9 2,0 Caз(PO4)2, Rhombohedral 100 10,3801 37,3895
Исследование образцов CuГА в SBFрастворе
Кинетические кривые процесса накопления ионов кальция и магния на поверхности подложек, изготовленных из образцов СиГА, представлены на рис. 1. Полученные данные показывают, что накопление ионов Са2+ и Mg2+, пропорциональное накоплению КФС на поверхности образцов с разным содержанием ионов меди, происходит для всех образцов примерно одинаково, причем после 400 часов (16 сут) наблюдается ускорение процесса формирования кальцийфосфатного слоя (угол наклона кривой возрастает) и данный процесс не прекращается после 28 сут исследования. Это можно объяснить тем, что к этому времени на поверхности подложки произошло осаждение первичного слоя фосфатов кальция и магния, который облегчает последующее накопление ионов Са2+ и Mg2+ из раствора.
40
35
ъ
14 25
о
л
!Л
>15
Е
* 10 5
0
Рис. 1. Кривые накопления ионов Са2+ и М£2+ на поверхности подложек из СиГА
Для сравнения поверхностных свойств таблеток до и после опыта с SBF-раствором были получены электронные микрофотографии методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и рентгеноспектрального микроанализа (РСМА). Результаты СЭМ и РСМА представлены на рис. 2 и 3.
а б в г д
Рис. 2. СЭМ-изображения поверхности подложек из образцов СиГА до погружения в $ВР -раствор: а — образец 1; б — образец 2; в — образец 3; г — образец 5; д — образец 8
а б в г д
Рис. 3. СЭМ-изображения поверхности подложек из образцов СиГА после 28 дней выдерживания в 8БР-растворе: а — образец 1; б — образец 2; в — образец 3; г — образец 5; д — образец 8)
Из микрофотографий поверхности подложек до погружения их в SBF-раствор (рис. 2) видно, что все образцы имеют поверхность разной степени шероховатости с агломератами неправильной формы.
После опыта с SBF-раствором поверхность большинства образцов становится однотипной со сферическими агломератами размером 1,38-14,8 мкм. Трещины на поверхности образцов появляются в результате сушки, но поверхность образца 3 отличается размером и формой агломератов, что связано, вероятнее всего, с более гладкой поверхностью подложки до помещения в раствор SBF.
Поверхность образца 8 имеет самый тонкий КФС, сферические агломераты не перекрываются, что видно из рис. 3. Этот факт подтверждается также наличием меди после опыта в РСМА (рис. 4) и видом кинетической кривой (рис. 1), у которой смена угла наклона происходит только через 600 часов (25 сут). Вероятнее всего, это связано с большей растворимостью фосфата кальция, доля которого в образце 8, по данным РФА, составляет большую часть.
Исследование местного действия образцов СиГА после имплантации
В результате осмотра опытных животных не было выявлено отклонений от естественной динамики массы тела и в их поведении. Потребление воды и корма оставалось на обычном уровне для животных данного возраста. Случаев незапланированной гибели животных в течение всего эксперимента выявлено не было.
В результате некропсии экспериментальных животных были получены следующие данные. Все имплантаты в той или иной степени оказывали негативное воздействие на окружающие ткани. Всего было извлечено семь имплантатов группы СиГА (х = 0,1); пять — группы СиГА (х = 0,3) и восемь — группы положительного контроля.
Особо следует отметить, что при некропсии животных группы СиГА (х = 0,5) извлечь имплантаты не удалось по причине отсутствия таковых в местах установки в связи с интенсивным процессом отторжения. Повреждений операционного шва у данных животных установлено не было. У всех животных данной группы с наружной стороны кожи в местах установки имплантатов наблюдались
а б
Рис. 4. Распределение атомов меди по поверхности подложки из образца 8: а — до опыта; е — после опыта
рубцы, а с внутренней — множественные петехиальные кровоизлияния. Сформированный подкожный карман отсутствовал. Экссудата и признаков воспаления также обнаружено не было. Это свидетельствует о прошедших процесса заживления после отторжения имплантатов.
Имплантаты группы CurA (х = 0,3) вызвали реакцию отторжения в несколько меньшей степени. Имплантаты отсутствовали у пяти животных, при этом с наружной стороны кожи в местах установки имплантатов наблюдались рубцы. Кроме того, у двух животных этой группы обнаружено одностороннее прободение кожных покровов с частичным обнажением имплантата, при этом в перимплантарном пространстве наблюдалась гиперемия окружающих тканей и экссудат, а вокруг имплантатов наблюдались кровоизлияния, однако также наблюдался и активный процесс васкуляризации. В перимплантарном пространстве в области прободения кожного покрова можно отметить область некроза диаметром 3-4 мм и гнойный экссудат. В одном случае материал имплантата был раскрошен на осколки. Жирового инфильтрата в местах установки имплантатов не обнаружено. Фиброзные капсулы вокруг имплантатов слабо выражены.
Имплантаты группы CurA (х = 0,1) также вызывали реакцию отторжения, но в несколько меньшей степени, чем образцы двух предыдущих групп с большей концентрацией ионов меди. При исследовании экспериментальных животных этой группы обнаружены признаки отторжения, аналогичные первым двум группам.
Имплантаты группы положительного контроля показывали реакцию отторжения в меньшей степени, чем образцы, модифицированные ионами меди. Одностороннее прободение кожи отмечалось у двух животных. В группе отрицательного контроля в местах создания карманов не было обнаружено никаких следов патологических процессов.
Особо следует отметить, что у всех экспериментальных животных на вскрытии не было выявлено следов системного токсического поражения органов. Исходя из этого можно отметить, что острая реакция отторжения имплантатов, даже некротическая, является преимущественно локальной и не вызывает системного поражения организма. Этому способствуют низкая гемодиффузия в местах установки имплантатов и низкая растворимость ГА в воде.
Выводы
Таким образом, по результатам исследования свойств медь-модифицированного гидроксиапатита можно сделать следующие выводы:
1. Получены образцы медь-модифицированного гидроксиапатита методом жидкофазного осаждения из водных растворов в микроволновом поле при атмосферном давлении с разным количеством ионов меди (от 0,1 до 2,0 мол. доли).
2. Образцы CurA являются полидисперсными, преимущественно двухфазными, состоящими из фаз ГА (Ca5(PO4)3(OH)) и ТКФ (Ca3(PO4)2). С увеличением количества ионов меди в CurA увеличивается доля фазы ТКФ.
3. Происходит формирование кальцийфосфатного слоя (КФС) на поверхности образцов CurA из модельного SBF-раствора; кинетика формирования КФС на поверхности образцов с разным содержанием меди одинакова. Наиболее тонкий КФС наблюдается у образца CurA 8 (x = 1,7). Наибольшее накопление ионов Ca2+ и Mg2+ на поверхности наблюдается у образца CurA 5 (х = 0,9).
4. Имплантированные образцы CurA вызывают лишь местную реакцию отторжения, причем выраженность этой реакции различается и зависит от содержания ионов меди. Имплантаты из CurA (х = 0,5) вызывают наибольшее отторжение, при этом происходит быстрый локальный некроз, сопровождающийся прободением кожных покровов и вытеснением имплантатов наружу. Следует отметить, что предыдущие исследования выявили высокую антибактериальную активность данных материалов и, как следствие, высокую цитотоксичность.
Список источников
1. Contact killing and antimicrobial properties of copper / M. Vincent [et al.] // J. Appl. Microbyology. 2017. №. 124. P. 1032-1046.
2. Рассказова Л. A., Коротченко Н. М., Зеер г. М. СВЧ-синтез гидроксиапатита и физико-химическое исследование его свойств // Журнал прикладной химии. 2013. Т. 86, № 5. С. 744-748.
3. Kokubo T. Bioactive glass ceramics: properties and applications // Biomaterials. 1991. Vol. 12. P. 155-163.
4. Шеховцева Т. Н., Веселова И. A. Методическое пособие по аналитической химии. М.: Изд-во МГУ, 2005. 40 с.
References
1. Vincent M., Duval R. E., Hartemann P., Engels-Deutsch M. Contact killing and antimicrobial properties of copper. J. Appl. Microbyology, 2017, No. 124, рр. 1032-1046.
2. Rasskazova L. A., Korotchenko N. M., Zeer G. M. SVCH-sintez gidroksiapatita i fiziko-himicheskoe issledovanie ego svojstv [Microwave synthesis of hydroxyapatite and physico-chemical study of its properties]. Zhurnalprikladnoj himii [Journal of Applied Chemistry], 2013, Vol. 86, No. 5, рр. 744-748. (In Russ.).
3. Kokubo T. Bioactive glass ceramics: properties and applications. Biomaterials, 1991, Vol. 12, рр. 155-163.
4. Shekhovceva T. N., Veselova I. A. Metodicheskoe posobie po analiticheskoj himii [Methodical manual on analytical chemistry]. Moskva, Izd-vo MGU, 2005, 40 р.
Сведения об авторах
А. А. Шнайдмиллер — магистрант;
Д. А. Федоришин — магистрант;
Н. М. Коротченко — кандидат химических наук.
Information about the authors
A. A. Shnajdmiller — Master Student;
D. A. Fedorishin — Master Student;
N. M. Korotchenko — PhD (Chemistry).
Статья поступила в редакцию 21.03.2021; одобрена после рецензирования 01.04.2021; принята к публикации 05.04.2021.
The article was submitted 21.03.2021; approved after reviewing 01.04.2021; accepted for publication 05.04.2021.
