Изучение белкового состава иммунобиологических препаратов из селезенки быка Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

>- Аграрный вестник Урала № 10 (116), 2013 г. —«

Ветеринария

УДК 615.324:615.281.8+615.273.3

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ БЫКА

т. л. бахареба,

руководитель отдела биотехнического контроля, Н. П. ГЛИНСКИХ,

доктор медицинских наук, профессор, директор,

Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Роспотребнадзора

(620030, г. Екатеринбург, ул. Летняя, д. 23; тел.: 8 (343) 261-99-60)

Ключевые слова: иммунобиологические препараты, селезенка, белковый состав, электрофорез, полиакриламидный гель, ультрафильтрация, полипептиды.

Аннотация. В статье представлены результаты изучения белкового состава иммунобиологических препаратов из селезенки быка, методом электрофореза в полиакриламидном геле. Этот метод обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделение белковых смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме белковых глобул, что позволяет количественно оценить содержание в них как крупных белков, так и мелких полипептидов. Исследования проведены на образцах препарата Нуклеопептид, который производится с предварительным автолизом селезенки и препарата Лиелин, который производится без предварительного автолиза. Белковые компоненты исследуемых препаратов разделяли методом электрофореза в 1-3 мм пластинах 10 % полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия. Наиболее четко их разделение происходило при нанесении в лунку геля 0,56 мг препарата. Исследование показало, что оба препарата содержат гетерогенную смесь белков. В Нуклеопептиде было выделено 16 белковых компонентов с молекулярными массами от 70 до 14 кДа, с преобладанием белков в диапазоне молекулярных масс 18-14 кДа и менее. В Лиелине было выделено 20 белковых компонентов с молекулярными массами от 14 и свыше 100 кДа, среди которых в значительном количестве присутствовали средне- и высокомолекулярные белки от 14 до 55 кДа, а преобладающими являлись — 63 и 19,5 кДа. Полипептидные компоненты образцов разделяли методом электрофореза в пластинках 12,5 % полиакриламидного геля в присутствии 8 М мочевины и 0,1 % додецилсульфата натрия. Показано, что Нуклеопептид более насыщен различными низкомолекулярными соединениями 2-5 кДа, по сравнению с Лиелином. Очищенная ультрафильтрацией через мембраны УМ-5 и УМ-2 фракция Нуклеопептида содержит более низкомолекулярные пептиды 2,3-3,0 кДа, по сравнению с фракцией Лиелина, которая в основном содержит соединения 4,5-4,7 кДа.

head of biotechnical control, N. P. GLINSKIH,

doctor of medical sciences, professor, director, Ekaterinburg research institute of viral infections epidemiology

(620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23, phone: 8 (343) 261-99-60)

Keywords: immunobiologicalpreparations, spleen, protein composition, electrophoresis, polyacrylamide gel, ultrafiltration, polypeptides.

Abstract. Results of investigating the protein composition of bovine spleen-derived immunobiological preparations by PAAG electrophoresis were presented. PAAG is a high-resolution assay due to separating the protein mixture not only by the molecule charge, but also by its size and shape, allowing quantitative assessment not only of large protein, but also that of small polypeptide content. The study was performed on Nucleopeptide samples produced with preliminary spleen autolysis and on Lyelin samples produced without preliminary autolysis. The protein components of the test preparations were separated by electrophoresis in 1-3 mm 10 % PAAG sheets in the presence of sodium dodecyl sulphate. The separation was most clean-cut when 0.56 mg of each preparation per well was added. It was demonstrated that both preparations contained heterogenous protein mixtures. 16 protein components with molecular weights of 70 to 14 kDa were isolated from Nucleopeptide with predominance of 18-14 kDa and lower-molecular proteins. From Lyelin, 20 protein components with molecular weights of 14 to 100 kDa and higher were isolated with considerable amounts of medium-and higher-molecular proteins of 14 to 55 kDa and predominance of 63 to 19.5 kDa proteins. The polypeptide components of the test samples were separated by electrophoresis in 12.5 mm PAAG sheets in the presence of 8 M urea and 0.1 % dodecyl sulphate. It was demonstrated that Nucleopeptide was more saturated with various low-molecular kDa compounds compared with Lyelin, the Nucleopeptide fraction purified by ultrafiltration through UM-5 and UM-2 membranes contains lower-molecular 2.3-3.0 kDa peptides compared with the Lyelin fraction containing mainly 4.5-4.7 kDa compounds.

INVESTIGATING PROTEIN COMPOSITION OF BOVIN SPLEEN-DERIVED IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS

T. L. BAKHAREVA,

Положительная рецензия представлена Н. А. Верещак, доктором ветеринарных наук Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Россельхозакадемии.

Аграрный вестник Урала №10 (116), 2013 г. —

Ветеринария

Экологическое неблагополучие и возрастающая нагрузка неблагоприятных антропогенных факторов на сельскохозяйственных животных ведут к существенному росту иммунодефицитных состояний. Возрастающие сложности иммунодефицитов, рост устойчивости патогенов к традиционным лекарственным средствам обуславливают интерес практикующих врачей к иммуномодуляторам [2]. В настоящее время основную роль в воздействии природных иммуномодуляторов на организм отводят пептидам. Пептидные биорегуляторы содержатся в различных клетках и тканях, образуются в ходе ограниченного протеолиза, обладают широким спектром биологического действия [3]. С целью изучения белкового состава иммунобиологических препаратов достаточно широко используется электрофорез в полиакрила-мидном геле. Этот метод обладает большой разрешающей способностью в связи с тем, что разделение белковых смесей идет не только по заряду, но и по размерам и форме белковых глобул, что позволяет количественно оценить содержание в них как крупных белков, так и мелких полипептидов.

Цель и методика исследований.

Цель настоящей работы заключалась в изучении методом электрофореза в полиакриламидном геле белкового состава иммунобиологических препаратов из селезенки быка — Нуклеопептида (НП) и Ли-елина (ЛН), а также их низкомолекулярных фракций

(ФНП и фли).

Фракции исследуемых препаратов получали методом ультрафильтрации в ячейке ФМ02-200 через мембраны УМ-5 и УМ-2 (Атюоп, США). Лиофи-лизацию предварительно замороженных в жидком азоте образцов проводили при разрежении 0,1 мбар (10 Па) на аппарате фирмы Hitosicc (Голландия) при конвекционном подогреве 20 °С в течение 3-4 часов в предварительно взвешенных колбах. Взвешивание исследуемых образцов осуществляли в таре для ли-офилизации на электронных аналитических весах 2004 МР Sartorius (ФРГ), с суммарной ошибкой взвешивания 0,06 мг на образец.

Белковые компоненты исследуемых препаратов разделяли методом электрофореза в 1-3 мм пластинах 10 % полиакриламидного геля в присутствии до-децилсульфата натрия [4] в концентрациях 0,05; 0,1;

0,2; 0,4 мг и 0,56; 0,94 мг. Наиболее четко разделение белковых компонентов происходило при нанесении в лунку геля 0,56 мг препарата. В качестве маркеров использовали набор стандартов белков фирмы Sigma, США.

Полипептидные компоненты образцов разделяли методом электрофореза в пластинках 12,5 % полиакриламидного геля в присутствии 8 М мочевины и 0,1 % додецилсульфата натрия [5]. В качестве метчиков использовали стандартные белки фирмы LKB 1860-101 (Швеция).

Статистическую обработку результатов проводили по программе MlKROSTA, в соответствии с ГФ XI, вып. 1 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний».

Результаты исследований.

Изучение методом электрофореза в 10 % полиа-криламидном геле показало, что оба препарата содержат гетерогенную смесь белков. В НП было выделено 16 белковых компонентов с молекулярными массами от 70 до 14 кДа, с преобладанием белков в диапазоне молекулярных масс 18-14 кДа и менее. В то же время в ЛН было выделено 20 белковых компонентов с молекулярными массами от 14 и свыше 100 кДа, среди которых в значительном количестве присутствовали средне- и высокомолекулярные белки 14-18, 24, 28, 41, 48 и 55 кДа, а преобладающими являлись — 63 и 19,5 кДа (табл. 1). Картина электрофореза НП характеризовалась худшим разделением на отдельные фракции, по сравнению с ЛН, что связано с его более высокой белковой насыщенностью (рис. 1).

Электрофорез полипептидных компонентов в 12,5 % полиакриамидном геле подтвердил преобладание в НП полипептидов от 2,5 до 14 кДа, тогда как в препарате ЛН преобладали белки свыше 17 кДа, а полипептиды от 2,5 до 6,2 кДа присутствовали лишь в незначительном количестве. Очистка образцов исследуемых препаратов ультрафильтрацией привела к значительному обогащению их фракций 2-5 кДа низкомолекулярными полипептидными компонентами от 2 до 5 кДа. В НП преобладали низкомолекулярные полипептиды 2,33,0 кДа, а в ЛН большая часть их имела молекулярную массу 4,5-4,7 кДа (рис. 2).

Таблица 1

Молекулярная масса белковых компонентов Нуклеопептида (НП) и Лиелина (ЛН) по калибровочным кривым

электрофорезов в 10 и 12,5 % полиакриламидном геле

Препарат Молекулярная масса (а ± ip), кДа

электрофорез в 10 % полиакриламидном геле в 12,5 % геле

ЛН о о л 0 о л 0 о о Os о 00 77-68 64 ± 4 55 ± 2 48 ± 2 41 ± 3 35 ± 1 33 ± 2 00 <N <N <N <N о <N 18 ± 2 \D V 1 12,0 10,5 «4 oo, I 4,7 ± 0,4

НП 1 1 1 1 1 о 58 ± 4 (N 00 38 ± 4 m m 30 ± 2 <N 22 ± 4 О <N 00 «4 5 V 5 V 14,4 10,6 ± 0,4 7,5 ± 0,2 5,5 ± 0,4 4,5 ± 0,4 3,3 ± 0,4 2,7 ± 0,2

— Аграрный вестник Урала № 10 (116), 2013 г. - ^ ^^^

Ветеринария

■И

Белки-стандарты по 3 мкг каждого:

-Фосфор«лаза — 97,5 кДа;

-БСА — 66=0 кДа;

- Овальбумин— 43.0 кДа;

ГАФЖ-ЗбкЦа; Карбоангидраза— 29 кДа:

Лахтотло&^ган —18 кДа; Лшстогло&х™Я— 14.1 кДа

ЛН НП НП

НП НП ЛН

Полипептады - стандарты па 5 мкг

МиоглоБин — 16:9 к&а Мипглооик — 12—14 4 к

МиоглоБин —1—8:2 £ Миаглооин —2-62 к

Мнпглобнн —3—2.5 в

0,6 Фнп

O^L

0,6 мг Флн

Рисунок 1

Электрофоретическое разделение белковых компонентов препаратов Нуклеопептид (НП) и Лиелин (ЛН)

в 10% полиакриламидном геле Рисунок 2

Электрофоретическое разделение полипептидных компонентов препаратов НП, ЛН и ФНП, ФЛН в 12,5 % полиакриламидном геле

Выводы.

Таким образом, НП и его фракция ФНП насыщены более низкомолекулярными полипептидами, по сравнению с ЛН и его фракцией ФЛН. Возможно, это связано с более высокой удельной антивирусной активностью НП, по сравнению с ЛН [1].

Литература

1. Бахарева Т. Л. Физико-химическая характеристика и биологическая активность различных производственных серий тканевого иммуномодулятора из селезенки быка. Проблемы инфекционной патологии в Уральском регионе : сб. работ III-й окружной науч.-практ. конф. Екатеринбург : Издательство АМБ, 2010. С. 104-109.

2. Федоров Ю. Н. Иммунокоррекция : применение и механизм действия иммуномодулирующих препаратов // Ветеринария. 2005. № 2. С. 3-6.

3. Хавинсон В. Х. с соавт. Роль пептидов в зпигенетической регуляции активности генов в онтогенезе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т. 152. № 16. С. 452.

4. Laemmli U. K. Nature. 1970. V 227. P. 680-685.

5. Swank R. T., Mankres K. D. Anal. Biochem. 1971. V. 39. P. 462-477.

References

1. Bahareva T. L. Physico-chemical characterization and biological activity of different production batches of spleen tissue immunomodulator bull. The problems of infectious diseases in the Urals region : works IIIth district scientific and practical. conf. Yekaterinburg : AMB Publishing, 2010. P. 104-109.

2. Fedorov Yu. N. Immunotherapy : application and mechanism of action of immunomodulatory drugs // Veterinary Medicine. 2005. № 2. P. 3-6.

3. Havinson W. H. et al. The role of peptides in the regulation of gene activity zpigeneticheskoy in ontogeny // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2011. T. 152. № 16. P. 452.

4. Laemmli U. K. Nature. 1970. V 227. P. 680-685.

5. Swank R. T., Mankres K. D. Anal. Biochem. 1971. V. 39. P. 462-477.