CC BY
36
М.В. Жданова (специальная премия)
Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия
Изучение BclI полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора у детей с бронхиальной астмой
ЗНАЧЕНИЕ ВОСПАЛЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ИММУННОЙ АКТИВАЦИИ В ПАТОГЕНЕЗЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ (БА) ХОРОШО ИЗВЕСТНО. ГЛЮКОКОРТИКОИДЫ — НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНЫЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СРЕДСТВА, ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ЭТОМ ЗАБОЛЕВАНИИ. АВТОРАМИ БЫЛА ИЗУЧЕНА ЧАСТОТА АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКЁРА BCLI ГЕНА ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА У ДЕТЕЙ С БА РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ. ПОКАЗАНО, ЧТО РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ И ГЕНОТИПОВ BCLI ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА НЕ ОТЛИЧАЕТСЯ В ГРУППАХ ДЕТЕЙ С БА РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ И КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЕ И СОВПАДАЕТ С СООТВЕТСТВУЮЩИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ В ПОПУЛЯЦИЯХ ЗАПАДНЫХ СТРАН.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА, ГЛЮКОКОРТИКОИДЫ, ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫЙ РЕЦЕПТОР, ГЕН ГЛЮКОКОРТИКОИДНОГО РЕЦЕПТОРА, BCLI ПОЛИМОРФИЗМ, ДЕТИ.
Данное исследование было выполнено под руководством доктора медицинских наук В.И. Ларионовой с участием докторов А.Н. Войтович, О.Р. Ромашкиной, М.А. Богдановой и Г.А. Новик.
Эпидемиологические исследования последних лет свидетельствуют о том, что от 4 до 8% населения страдают бронхиальной астмой (БА). В детской популяции этот показатель составляет до 5-10%, у взрослых колеблется в пределах 5% [1]. Исходя из ведущей роли воспаления в патогенезе БА, лечение предусматривает использование противовоспалительных средств. Глюкокортико-иды (ГК) — наиболее эффективные противовоспалительные средства, широко используемые при этом заболевании. Предполагаемые механизмы действия ГК при БА включают их действие на клеточный транспорт (уменьшение содержания эозинофилов, базофилов, лимфоцитов и моноцитов в крови), нарушение хемотаксиса (особенно нейтрофилов), снижение синтеза медиаторов и их высвобождения, увеличение активности p-адренорецепторов и снижение сосудистой проницаемости [2].
ГК реализуют свои эффекты посредством связывания со специфическим цитоплазматическим рецептором, который затем переносится в ядро и связывается со специфическим сайтом ДНК. Различные формы глюкокортикоидного рецептора могут влиять на регуляцию многих биологических функций, таких, как регуляция гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и быстрота ответа на ГК. Мутации в этом гене ассоциируются с нарушением функции сердечно-сосудистой системы, метаболическими расстройствами и злокачественными изменениями крови [3-5]. Также функциональная вариабельность рецептора может нарушать ответ на терапию ГК. Таким образом, идентификация различных вариантов гена глюкокортикоидного рецептора может помочь в оценке его роли в восприимчивости к заболеваниям или в решении вопроса предрасположенности к побочным действиям препаратов ГК [6].
Ген глюкокортикоидного рецептора расположен на длинном плече хромосомы 5 (5q31) [7], имеет размеры ~80 kb и состоит из 10 экзонов, которые кодируют три
Контактная информация:
Ларионова Валентина Ильинична, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой молекулярной кардиологии Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии Адрес: 194100, г. Санкт-Петербург, ул. Александра Матросова, 22, тел. (812) 245-10-71.
M.V. Zhdanova
Saint-Petersburg Pediatric Medical Academy
BCLI gene polymorphism of glucocorticoid receptor in children with bronchial asthma
AIRWAYS INFLAMMATION AND IMMUNE ACTIVATION ARE KNOWN TO PLAY AN IMPORTANT PART IN ASTHMA PATOGENESIS. GLUCOCORTICOIDS ARE COMMONLY USED AS THE MOST EFFECTIVE AGENTS TO TREAT ASTHMA. FREQUENCY IN ALLELES AND BCLI:GENE POLYMORPHISM OF CLUCORTICOID RECEPTOR HAS BEEN STUDIED IN CHILDREN WITH MILD TO SEVERE ASTHMA AND IN CONTROLS. THE ALLELES AND BCLI GENE POLYMORPHISM GENOTYPES HAVE BEEN UNIFORMLY DISTRIBUTED IN ALL GROUPS REGARDLESS TO ASTHMA SEVERITY. THE DISTRIBUTION CORRESPONDS WITH THE DATA OBTAINED IN THE WESTERN COUNTRIES.
KEY WORDS: BRONCHIAL ASTHMA, GLUCOCORTICOIDS, GLUCOCOTICOID RECEPTOR, GLUCOCOTICOID RECEPTOR GENE, BCLI POLYMORPHISM, CHILDREN.
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ №2/ 2006
Материалы X Конгресса педиатров России
62
5q31
Хромосома
Ж
BcLI
Ген
5'
-3'
Размер интрона (кБ) -4
>30
-0,4 >16 >2 -4,6 -13,5
-0,8 -0,2
кДНК
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Размер экзона (Ьр) 184
1197
167 117 279 145 131 158
2475
1478
Белок NH2 I I I I I I I СООН
Домены Трансактивация ДНК-связывающий Лиганд-связывающий
структурных и функциональных домена: структурный ^терминальный домен, отвечающий за функцию трансактивации; центральный домен, связывающийся с ДНК элементов глюкокортикоидной регуляции; и С-терминальный домен, связывающий лиганд (рис. 1).
В соответствии с общепринятой номенклатурой, исследованный полиморфизм может называться ^Б2+646, однако в литературе чаще применяют термин «BclI полиморфизм» [8]. BclI полиморфизм в настоящее время установлен как С^ точечная мутация во 2 интроне, в позиции 646-го нуклеотида от 2-го экзона [8,9]. Он расположен вне кодирующего, регуляторного или сплай-сингового участков гена глюкокортикоидного рецептора и не имеет явного влияния на процессинг пре-мРНК; его функциональная роль не ясна. Предположительно этот полиморфизм не влияет на аффинность рецептора, но может проводить к тканеспецифическим различиям в экспрессии глюкокортикоидного рецептора посредством влияния на промоторный участок [10]. Возможно, что этот полиморфизм связан с функционально значимыми изменениями в промоторном участке или 3' нетранслируемом участке гена. Кроме того, BclI полиморфизм также может быть связан с изменениями в двух ранее неизвестных экзонах гена глюкокортикоидного рецептора человека (1А и 1В) или в двух ассоциированных промоторах, открытых недавно [11].
Обследовано 485 детей с БА: 396 мальчиков и 89 девочек, которые находились на лечении в аллергологическом отделении ДГБ № 2 им. Св. Марии Магдалины г. Санкт-Петербурга. Возраст обследованных составил от 2 до 17 лет (средний возраст — 12,7 лет). Диагностика БА осуществлялась на основании критериев, предложенных международными согласительными документами [12]. Степень тяжести оценивали по общепринятой классификации [1]. Лёгкая БА отмечалась у 101 ребёнка (20,8%), среднетяжёлая — у 261 (53,8%), тяжёлая — у 123 (25,4%).
В качестве контроля использовались образцы крови детей, не страдающих аллергическими заболеваниями
(n = 151, 78 мальчиков и 73 девочки) в возрасте от 4 до 17 лет (средний возраст — 12,5 лет), проходившие обследование ДГБ № 2 г. Санкт-Петербурга.
Выделение ДНК осуществлялось модифицированным фенольно-хлороформным методом из лейкоцитов периферической крови.
Молекулярно-генетический анализ вариантов BclI полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Этот полиморфизм обусловлен заменой гуанина на цитозин в 646-м положении во 2-м интроне этого гена. В результате замены (TGATCA на TCATCA) формируется сайт рестрикции для эндонуклеазы Ksp 22I [6]. В большинстве работ полиморфизм определяется на сенс-цепи, в этом случае C меняется на G [8]. ПЦР проводили на автоматическом термоциклере MJ (MJ Research Inc) с использованием термостабильной рекомбинантной Taq полимеразы фирмы «Сиб-энзим» (Россия).
Для ПЦР анализируемого участка гена глюкокортикоидного рецептора были выбраны следующие праймеры: F 5' AAATTgAAgCTTAACAATTTTggC 3', R 5' gCAgTgAACAgTgTACCA-gACC 3'.
Проводили 40 циклов амплификации в конечном объёме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг геномной ДНК, 250 пкмоль каждого праймера, 10мМ Tris-HCl, 0,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 0,2 мМ каждого dNTP и одну единицу Taq полимеразы. Длина фрагмента, нарабатываемого в результате ПЦР, — 206 п.н.
Для генотипирования продукты ПЦР рестрицировали Ksp 22I («Сибэнзим», Россия, E081, E082), после чего анализировали в 2,5% агарозном геле. При комбинации нормального аллеля C и мутантного G формируются три генотипа: GG (206 п.н.); CG (206 п.н., 116 п.н., 90 п.н.); CC (116 п.н., 90 п.н.).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета SPSS 11,0. Для сравнения частот распределения генотипов в
основной и контрольной группах и в группе детей больных БА различной степенью тяжести использовали критерий хи-квадрат.
Распределение аллелей и генотипов BclI полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора не отличается в группах практически здоровых детей и детей, больных БА (табл. 1). Также отсутствовали статистически значимые различия в частоте генотипов у детей с БА разной степени тяжести и в их распределении в зависимости от пола детей (табл. 2).
Таким образом, распределение аллелей и генотипов BclI полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора не отличается в группах детей с БА различной степени тяжести и контрольной группе и совпадает с соответствующими показателями в популяциях западных стран.
Таблица 1. Распределение генотипов исследованного БеН полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора в группе детей с БА в сравнении с контрольной группой
Показатели Основная группа(n=485) Контрольная группа(n=151)
Мальчики Девочки Мальчики Девочки
Количество наблюдений 396 (81,6%) 89 (19,4%) 78 (51,7%) 73 (48,3%)
Частота аллелей, %
С-аллель 62,8 62,4 57,7 60,3
G-аллель 37,2 37,6 42,3 39,7
Частота генотипов, %
СС 40,4 40,4 32 34,2
CG 44,7 43,9 51,3 52,1
GG 14,9 15,7 16,7 13,7
Таблица 2. Распределение генотипов исследованного Бс11 полиморфизма гена глюкокортикоидного рецептора в группе детей с БА в зависимости от степени тяжести
Показатели Лёгкая БА Среднетяжёлая БА Тяжёлая БА
Мальчики Девочки Мальчики Девочки Мальчики Девочки
Количество наблюдений 89 (22,5%) 12 (13,5%) 216 (54,5%) 45 (50,6%) 91 (23%) 32 (36%)
Частота аллелей, %
С-аллель 62,4 62,5 63 62,2 62,6 62,5
G-аллель 37,6 37,5 37 37,8 37,4 37,5
Частота генотипов, %
СС 41,6 33,3 39,4 37,8 41,8 46,9
CG 41,6 58,3 47,2 48,9 41,8 31,3
GG 16,9 8,3 13,4 13,3 16,5 21,9
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика». — М., 1997.
2. Szefler S. Glucocorticoid therapy for asthma: clinical pharmacology // J. Allergy Clin. Immunol. — 1991. — V. 88. — P 147-165.
3. Arai K., Chrousos G.P. Hormone-nuclear receptor interactions in health and disease. Glucocorticoid resistance // Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. — 1994. — V. 8. — P. 317-331.
4. Panarelli M., Fraser R. The glucocorticoid receptor and hypertension // Endocr. Res. — 1994. — V. 20. — P. 101-116.
5. DeRijk R.H., Schaaf M., de Kloet E.R. Glucocorticoid receptor variants: clinical implications // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. — 2002. — V. 81. — P. 103-122.
6. Fleury I., Patrick Beaulieu P, Primeau M. et al. Characterization of the BclI Polymorphism in the Glucocorticoid Receptor Gene // Clin Chem. — 2003. — V. 49, № 9. — P 1528-1531
7. Encio I.J., Detera-Wadleigh S.D. The genomic structure of the human glucocorticoid receptor // J. Biol. Chem. — 1991. — V. 266. — P. 7182-7188.
8. Van Rossum E.F.C, Koper J.W., van den Beld A.W. et al. Identification of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene:
association with sensitivity to glucocorticoids in vivo, and body mass index // Clin Endocrinol (Oxf). — 2003. — V. 59. — R 585-592.
9. Buemann B., Vohl M.C., Chagnon M. et al. Abdominal visceral fat is associated with a BclI restriction fragment length polymorphism at the glucocorticoid receptor gene locus // Obes Res. — 1997. — V. 5. — R 186-192.
10. Ranarelli M., Holloway C.D., Fraser R. et al. Glucocorticoid receptor polymorphism, skin vasoconstriction, and other metabolic intermediate phenotypes in normal human subjects //J. Clin. Endocrinol. Metab. — 1998. — V. 83. — R 1846-1852.
11. Breslin M.B., Geng C.D., Vedeckis W.V. Multiple promoters exist in the human GR gene, one of which is activated by glucocorticoids // Mol. Endocrinol. — 2001. — V. 15. — R 1381-1395.
12. Global Initiative for asthma // NHLB/WHO Workshop Report. — National Heart Lung Blood Institute. — 2002.
13. Rosmond R. The Glucocorticoid Receptor Gene and Its Association to Metabolic Syndrome //Obesity Research. — 2002. — V. 10. — R. 1078-1086.
ПЕДИАТРИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ/ №2/ 2006
