CC BY
178
[гиена и санитария 6/2012
Литер атур а
1. Беспамятное Г.П., Кротов Ю.А. Предельно допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде.-Л.: Химия, 1985.
2. БуровЮ.В., РожновГ.И. //Гиг и сан. - 1995. -№ 4. - С. 21-25.
3. ГороховаЛ.Г., МартыноваН.А. // Актуальные вопросы профпатологии, гигиены и экологии человека: Материалы XLV науч.-практ. конф. / Под ред. В.В. Захаренкова. - Кемерово: Примула, 2010. - С. 97-101.
4. Навакатикян М.А., Платонов Л.А. //Гиг. и сан. - 1988. - № 2. - С. 60-62.
5. Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского. - М.: Медицина, 2002.
6. Сгибнев А.К., Орлова Т.А. // Проблемы космической биологии (сборник). - М.: Наука, 1971. - Т 16. - С. 190-195.
7. Adler Terrine K., Adrien Albert // J. Med. Chem. - 1963. - Vol.6, N 5. - P. 480-483.
Поступила 21.02.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.37-078
Г.И. Корчак, Е.В. Сурмашева, А.И. Михиенкова, Н.А. Никонова, Л.И. Романенко, З.А. Олийнык, А.К. Горваль,
М.А. Росада
ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ СВОЙСТВ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА В ВИДЕ
коллоидного раствора и в матрице высокодисперсного кремнезема
ГУ Институт гигиены и медицинской экологии им. А.Н. Марзеева НАМИ Украины, Киев
В ходе экспериментального исследования установлено, что полученные химическим методом коллоидный раствор наночастиц (НЧ) серебра (Ag) и композит на его основе в матрице высокодисперсного кремнезема с размером частиц 8-12 нм и концентрацией НЧ в базовом растворе 0,0016% (0,016 мг/см3) проявляли высокую антимикробную активность относительно тест-микроорганизмов E. coli, P. aeruginosa, S. aureus и C. albicans, которая зависела от ряда факторов. Изучены бактерицидные свойства ткани, импрегнированной НЧ Ag. В качестве стабилизирующих веществ использовали смесь поверхностно-активного вещества доде-цилсульфата натрия и полимера поливинилпирролидона. Перед началом исследования был подобран эффективный нейтрализатор. Установлены сроки сохранения антимикробной активности опытных образцов, а также показана их стабильность на протяжении длительного срока наблюдения (24 мес). Изучено влияние органического загрязнения на антимикробную активность образцов.
На основании полученных результатов разработан алгоритм изучения антимикробных свойств нанопрепаратов.
Ключевые слова: наночастицы серебра, высокодисперсный кремнезем, стабильность антимикробной активности, методический подход
G. I. Korchak, E. V Surmasheva, A. I. Mikhienkova, N. A. Nikonova, L. I. Romanenko, Z. A. Oliynyk, A. K. Gorval’,
M.A. Rosada - THE STUDY OF ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF SILVER NANOPARTICLES IN THE FORM OF A COLLOIDAL SOLUTION IN THE MATRIX OF FINELY DISPERSED SILICA
State Institution O.M.Marzeev Institute of Hygiene and Medical Ecology of Ministry of Health of Ukraine, Kiev, Ukraine
In the experimental study obtained with chemical method colloid solution of nanoparticles (NPs) of silver (Ag) and a composite on his base in the matrix of finely dispersed silica with particle size of 8-12 nm and NPs concentration in basic solution of 0,0016% (0, 016 mg/cm3) were established to exhibit high antimicrobial activity against the test organisms: E. coli, P. aeruginosa, S. Aureus and C. Albicans, which depended on a set of factors. Antibacterial properties of tissue impregnated with Ag-NPs were studied. As stabilizing substances a mixture of surface-active substance sodium dodecyl sulfate and polymer polyvinylpyrrolidone was used. Before the beginning of the study effective neutralizer was tailored. Times ofpreservation of antimicrobial activity of test samples have been established, and also their stability throughout long term of supervision (24 months) has been shown. Effect of organic pollution on antimicrobal activity of the samples has been studied. Based on obtained. results the algorithm of the study of antimicrobial properties of nanopreparations has been elaborated
Key words: silver nanoparticles, finely dispersed silica, stability of antimicrobial activity, methodical approach
В последние 30 лет наблюдается интенсивное развитие нанотехнологий. Эффекты, которые можно получить при применении наночастиц (НЧ), зависят от технологии синтеза НЧ, их размера, формы, концентрации,
Корчак Г.И. - д-р мед. наук, гл. науч. сотр. (galynakorchak@ ukr.net); Сумашева Е.В. - д-р мед. наук, зав. лаб. санитарной микробиологии (sumasheva_elena@ukr.net); Михиенкова А.И. - науч. сотр. диссертант (anna_mikhienkova@ukr.net); Никонова Н.А. -канд. биол. наук, вед. науч. сотр. (27nnikonova@ukr.net); Романенко Л.И. - науч. сотр (korchak_galina@ukr.net); Олийнык З.А. - науч. сотр.; Горваль А.К. - канд. биол. наук, ученый секретарь (health. gov@health.gov.ua); Росада М.А. - канд. мед. наук, докторант.
химической природы стабилизатора, стабильности коллоидной системы, вида микроорганизмов, химической природы композиций на основе НЧ и пр. [1].
Несмотря на обилие данных литературы по изучению антимикробных свойств наноматериалов, отсутствуют конкретные требования к проведению подобных исследований, что в определенной степени не позволяет получать объективные данные и прежде всего провести сравнительный анализ активности изучаемых препаратов.
В данной работе сделана попытка обосновать методический подход к изучению антимикробных свойств НЧ серебра (Ag), на основании которых предложен алгоритм выполнения подобных научных практических задач.
64
Материалы и методы
В работе были исследованы антимикробные свойства образцов растворов НЧ Ag и суспензии высокодисперсного кремнезема (ВДК), на поверхности которого адсорбировано Ag, а также ткани, импрегнированной НЧ Ag. Перечисленные объекты исследования были синтезированы сотрудниками Института химии поверхности им. А.А. Чуйко НАНУ
Коллоидные растворы НЧ Ag получали путем химического восстановления нитрата Ag в присутствии NaBH4. Для стабилизации НЧ Ag использовали следующие соединения: поверхностно-активное вещество (ПАВ) додецилсульфат натрия (ДСН), полимер поливи-нилпирролидон (ПВП), а также смесь обоих стабилизаторов (ДСН + ПВП) [2, 3].
Полученные коллоиды Ag адсорбировали на поверхности кремнезема (ВДК) марки А-300 с удельной поверхностью 300 м2/г [4].
Образцы льняной ткани погружали в реакционную смесь (ДСН, ПВП, NaBH4 и нитрат серебра - AgNO3) на определенное время, высушивали и подвергали термообработке.
Микробиологическому изучению подлежали следующие образцы: коллоидный раствор НЧ Ag со стабилизатором ДСН и восстановителем NaBH4; коллоидный раствор НЧ Ag со стабилизатором ПВП и восстановителем NaBH4: коллоидный раствор НЧ Ag со смесью стабилизаторов (ДСН + ПВП) и NaBH4; композит: суспензия ВДК с НЧ Ag, смесью стабилизаторов (ДСН + ПВП) и NaBH4; льняная ткань, импрегнированная НЧ Ag.
Во всех образцах растворов концентрация НЧ Ag в базовом растворе составляла 0,0016% (0,016 мг/см3), а в рабочих разведениях - 0,0008% (0,008 мг/см3) и 0,0004% (0,004 мг/см3). Суспензия ВДК, модифицированная НЧ Ag (НЧ Ag/SiO2), содержала 3,13% SiO2. Размер частиц Ag был в пределах 8 - 12 нм. Концентрация наносеребра в ткани была на уровне 0,053 г/см2.
При проведении опытов обязательно параллельно исследовали также контрольные образцы в соответствующих концентрациях: раствор AgNO3; ВДК без каких-либо примесей; стабилизаторы (ДСН, ПВП и ДСН + ПВП); льняную ткань без НЧ Ag.
В исследованиях использовали Staphylococcus aureus АТСС 6538 (S. aureus), Escherichia coli K12 NCTC 10538 (Е. coli), Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 (P. aeruginosa), Candida albicans ATCC 10231 (C. albicans).
Указанные тест-штаммы были получены из Центра типичных биологических культур (Германия). Хранение и приготовление суспензий тест-штаммов для исследований осуществляли согласно EN 12353:2006 [5].
Образцы изучали через 1, 2, 4, 24 ч, 15, 30 дней и затем каждый месяц (всего 24 мес) для уточнения сроков сохранения антимикробной активности.
В качестве модели органического загрязнения использовали бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,03 и 0,3%.
Изучение антимикробных свойств коллоидных растворов НЧ Ag и суспензий НЧ Ag/SiO2 проводили количественным суспензионным методом согласно европейским стандартам исследования антимикробной активности дезинфектантов и антисептиков EN 13727:2003, EN 13624:2003 и EN 14347:2005 [8]. Наличие антимикробного действия у льняной ткани проверяли методом агаровых пластин согласно [9].
Каждое исследование сопровождали контролями количества микроорганизмов (в КОЕ/см3) в рабочей
тест-суспензии, отсутствия побочных эффектов в экспериментальных условиях, отсутствия токсичности нейтрализатора, эффективности и нейтрализации.
Считали, что опытный образец имеет специфическую активность при средней редукции (R) количества микроорганизмов не менее чем на 5 lg для бактерий и 4 lg для грибов.
Размеры НЧ фиксировали с помощью проникающего электронного микроскопа (ПЭМ) (JOEL JEM-100C). Программу Image J (NlH)44 использовали для определения размера каждой НЧ на ПЭМ -снимках. Исходя из данных ПЭМ касательно среднего размера НЧ и концентрации металла Ag в растворе (0,0016 масс. %), расчетным путем установили, что концентрация наносеребра составила 2,65 • 1012 частиц/см3.
Результаты и обсуждение
Перед проведением исследования экспериментально был подобран адекватный нетоксичный для микроорганизмов инактиватор, нейтрализующий действие Ag в опыте после срока экспозиции. Использовали два инактиватора: 0,1% раствор сульфида натрия (Na2S) и комплексный нейтрализатор (твин-80, гистидин, лецитин, тиосульфат натрия, цистеин, фосфатный буфер с натрием хлоридом и пептоном pH 7,0).
Оба инактиватора эффективно нейтрализовали антимикробное действие опытных образцов, но в последующем использовали 0,1% Na2S как более простой и дешевый.
Большое внимание в наших исследованиях уделили поиску эффективного стабилизатора. Первоначально для стабилизации НЧ использовали ПАВ ДСН и полимер ПВП по отдельности. Но при изучении физикохимических параметров полученных коллоидов установили, что по мере хранения растворов размер НЧ Ag увеличивался (рис. 1). Поэтому использовали комбинацию двух веществ (рис. 2), что препятствовало агрегации НЧ, размер которых сохранялся на уровне 8-12 нм длительное время.
Результаты изучения антимикробных свойств коллоидного раствора НЧ Ag представлены в табл. 1. По
Таблица 1
Антимикробная активность коллоидных растворов НЧ Ag, стабилизированных бинарной смесью (lg R)*
Концен- трация НЧ Ag, % Экспозиция, ч Тест-штамм микроорганизмов
E. coli P. aeruginosa S. aureus C. albicans
0,0016 1 > 5,22 4,06 < 1,57 > 4,27
2 > 5,22 5,00 2,07 > 4,27
4 > 5,22 5,40 4,35 > 4,27
24 > 5,22 > 5,46 > 5,24 > 4,27
0,0008 1 4,07 3,71 < 1,57 > 4,27
2 5,11 4,35 < 1,57 > 4,27
4 > 5,22 5,35 2,72 > 4,27
24 > 5,22 > 5,46 > 5,24 > 4,27
0,0004 1 3,97 0,58 < 1,57 > 4,27
2 5,07 4,03 < 1,57 > 4,27
4 > 5,22 4,46 < 1,57 > 4,27
24 > 5,22 > 5,46 5,09 > 4,27
Исходное количе- 7,37 7,61 7,39 6,42
ство микроорганизмов, lg
Примечание. * - контрольные растворы не оказывали антимикробного действия за время наблюдения.
65
[игиена и санитария 6/2012
интенсивности антимикробной активности НЧ Ag в отношении тест-штаммов последние можно разделить на три группы: грамположительные (S. aureus), грамотрицательные (E. coli, P. aeruginosa) и дрожжеподобные грибы (С. albicans). Наиболее устойчивыми оказались S. aureus, наиболее чувствительными - грибы и C. albicans.
Результаты исследований антимикробного действия композита НЧ Ag/SiO2 представлены в табл. 2. Введение НЧ Ag в суспензию SiO2 несколько снизило активность Ag, что проявилось в увеличении времени экспозиции, изменился также характер взаимодействия НЧ с бактериальной клеткой. Повысилась устойчивость Е. coli к НЧ Ag, находящихся в комплексе с SiO2. В противоположность этому S. aureus проявили более высокую чувствительность.
Установили, что полученные химическим методом коллоидный раствор НЧ Ag и композит на его основе в матрице ВДК проявляли стабильный антимикробный эффект, который сохранялся в течение всего срока наблюдения - 24 мес, при этом реактивацию тест-штаммов не выявили.
Льняная ткань, импрегнированная НЧ Ag, обладала бактерицидными свойствами в отношении Е. coli и S. aureus: зона задержки роста составила 1-3 мм. Рост микроорганизмов под тканью отсутствовал в течение 14 сут наблюдения.
Белковая нагрузка несколько понизила антимикробную активность НЧ Ag, но даже в таких жестких условиях антимикробный эффект на уровне 4 lg был достигнут в отношении наиболее весомых возбудителей внутрибольничных инфекций - S. aureus, P. aeruginosa и С. albicans.
На схеме представлен разработанный нами алгоритм проведения исследования антимикробных свойств наноматериалов.
Таблица 2
Антимикробные свойства композита НЧ Ag/SiO2 (lg R)*
Объект и концентрация Экспозиция, ч Тест-штамм микроорганизмов
E. coli P. aeruginosa S. aureus C. albicans
НЧ Ag/SiO2 1 < 0,39 < 0,49 3,89 > 4,54
(0,0016 %) 2 < 0,39 3,27 5,14 > 4,54
4 3,58 > 5,07 > 5,17 > 4,54
24 > 5,06 > 5,07 > 5,17 > 4,54
НЧ Ag/SiO2 1 < 0,39 < 0,49 2,00 2,01
(0,0008%) 2 < 0,39 2,22 2,39 3,22
4 < 0,39 4,23 4,55 > 4,54
24 0,42 > 5,07 > 5,17 > 4,54
4 сут > 5,11 > 5,02 > 5,13 > 4,04
НЧ Ag/SiO2 1 < 0,39 < 0,49 < 1,50 < 0,87
(0,0004%) 2 < 0,39 < 0,49 < 1,50 1,22
4 < 0,39 2,02 2,81 3,20
24 < 0,39 4,56 4,79 > 4,54
4 сут > 5,11 > 5,02 > 5,13 > 4,04
Исходное количество 7,21 7,22 7,32 6,69
микроорганизмов, lg
Примечание. * - контрольный раствор SiO2 не оказывал антимикробного действия за время наблюдения.
Анализируя данные схемы, следует добавить следующее.
Для получения объективных сравнимых результатов разными исследователями наибольшее влияние на конечный результат, по нашему мнению, оказывают правильно подобранный нейтрализатор, стабилизатор, микробиологический метод определения антимикробной активности и тест-штаммы использованных микроорганизмов. Методы и штаммы должны быть стандартизированными и соответствовать европейским стандартам. Это же относится и к учету результатов, критерию их
оценки и достоверности.
Создание наноматериалов наряду с решением теоретических вопросов должно иметь практическую целесообразность. Примером могут служить разработки по использованию Ag. Данный выбор был обусловлен отсутствием токсического действия у него на клетки теплокровных, высокой антимикробной активностью, медленным процессом образования резистентных форм микроорганизмов и неисчерпанной возможностью создания на его основе разнообразных композиционных препаратов. Наряду с этим использование наносеребра в наших исследованиях было целесообразно потому, что в настоящее время и многие другие металлы предлагаются изобретателями как антимикробные средства. Поэтому считали, что особенности методического
Рис. 1. Изменение размера НЧ Ag по мере старения раствора.
а - свежеприготовленный раствор (масштаб 200 нм); б - раствору 4 мес (масштаб 100 нм), ПЭМ.
Рис. 2. Схематическое изображение взаимодействия комплекса ПВП и ДСН с ионами Ag и образование НЧ после восстановления тетрагидроборатом натрия.
66
подхода к изучению Ag, разработанные нами, можно использовать для исследования и других средств на основе НЧ металлов, владеющих антимикробными свойствами.
Аналогичные требования следует выдвигать и к композитам на основе НЧ. В данном случае был использован кремнезем, который отличается химической чистотой, биологической и термической стойкостью, небольшими размерами частиц (5-50 нм), большой удельной поверхностью (300 м2/г) и физиологической безвредностью. На основе ВДК созданы препараты, которые широко применяются в терапии для лечения многих заболеваний (сердечно-сосудистых, гинекологических, стоматологических, гематологических, нарушений водноэлектролитного обмена), а также в хирургии для лечения гнойновоспалительных процессов [11].
В результате наших исследований показана перспективность использования ВДК в сочетании с НЧ Ag, поскольку данный композит может выполнять не только дезинтоксикационную функцию, но и антимикробную. ВДК производят на Украине, он внесен в фармакопею, используется в клинической практике и свободно продается в аптечной сети не только Украины.
Результаты, полученные нами в процессе выполнения данных исследований, позволили обосновать методический подход к изучению антимикробных свойств наноматериалов, который состоит из последовательно построенных этапов (см. схему) и, на наш взгляд, может быть положен в основу выполнения подобных научных и практических заданий.
Литер атура
1. Крутяков Ю.А., Кудринский А.А., Оленин А.Ю. и др. // Успехи химии. - 2008. - Т 77, № 3. - С. 242-269.
2. Муха Ю., Еременко А., Смирнова Н. и др. // Химия, физика и технология поверхности: сб. науч. тр. - Киев, 2009. - Вып.
15. - С. 255-266.
3. Mukha I., Eremenko A., Korchak G. // Journal of Water Resource and Protection. - 2010. - Vol. 2, N 2. - P. 131-136.
4. Tian Ch., Mao B., Wang E. et al. // Nanotechnology. - 2007. -Vol. 18. - P. 285607-285614.
5. EN 12353:2006 Chemical desinfectants and antiseptics. Preservation of microbial strains used for the determination of bactericidal and fungicidal activity. - Brussels: European Committee for Standardization, 2006.
EN 13727:2003 Chemical desinfectants and antiseptics. Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity for instruments used in medical area. Test method and requirements.
- Brussels: European Committee for Standardization, 2006.
7. EN 13624:2003 Chemical desinfectants and antiseptics. Quantitative suspension test for the evaluation of fungicidal activity for instruments used in medical area. Test method and requirements.
- Brussels: European Committee for Standardization, 2003.
8. EN 14347:2005 Chemical desinfectants and antiseptics. Basic sporicidal activity. Test method and requirements. - Brussels: European Committee for Standardization, 2005.
9. Методы испытаний дезинфицирующих средств для оценки их безопасности и эффективности / НИИ дезинфектологии Минздрава России. - М., Министерство здравоохранения Российской Федерации, 1998.
10. МiхieнковаАЛ., КорчакГЛ., Сурмашева О.В. та тш. //Плена населених мгсць: зб. наук. праць. - Кив, 2011. - Вип. 57. - С. 378-385.
11. Вюник Biнницького Державного медичного ушверситету iм. М.1. Пирогова // Вшниця, 1999. - Т. 3, № 1.
Поступила 27.03.12
Схема
Алгоритм исследования антимикробной активности наноматериалов
№ п/п Название этапа
Наноматериалы должны проявлять антимикробную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов, не быть токсичными для теплокровных и быть экологически безопасными
1 Сведения относительно физико-химических свойств исходного материала
2 Метод получения НЧ, их размер и форма, концентрация в образце, который предоставляется на исследование
3 Подбор эффективного нейтрализатора антимикробного действия НЧ
4 Разработка стабилизатора, который соответствует следующим требованиям: обеспечивает длительную стабильность НЧ; не обладает антимикробной активностью; не снижает антимикробного действия НЧ; не токсичен для теплокровных
5 Выбор тест-микроорганизмов и метода исследования микробицидных свойств наноматериала
6 Определение микробицидных концентраций изучаемых образцов (исходный коллоидный раствор и композит на его основе), а также сроков сохранения антимикробного действия
7 Изучение антимикробного действия наноматериапов в условиях, проближенных к практическому применению
8 Изучение влияния наноматериалов на организм теплокровных животных и человека
9 Анализ полученных результатов
10 Рекомендации относительно применения наноматериалов в медицине и народном хозяйстве
6.
67
