Вивчення дозо-часової залежності антимікробної дії наночасток срібла Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»



STUDY OF DOSE-AND-TIME DEPENDENCE OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY

OF SILVER NANOPARTICLES

Surmasheva O.V., Mikhienkova A.I., Korchak G.I., Antomonov M.Yu., Nikonova N.O.

Oliinyk Z.A., Romanenko L.I.

ВИВЧЕННЯ ДОЗО-ЧАСОВО1 ЗАЛЕЖНОСТ1 АНТИМ1КРОБНО1 Д11 НАНОЧАСТОК СР1БЛА

e-

СУРМАШЕВА О.В., М1Х1еНКОВА А.1., КОРЧАК Г.1., АНТОМОНОВ М.Ю., Н1КОНОВА Н.О., ОЛ1ЙНИК З.А., РОМАНЕНКО Л.1. ДУ "1нститут ппени та медичноТ екологií iM. О.М. Марзеева НАМН УкраТни",

м. КиТв

УДК 579.63: 661.163:006.032, 648.6, 615.28

станшм часом все бiльшу ува-гу привертають до себе нано-технологií та матерiали, отри-маш за Тх допомогою. Завдяки ункальним фiзико-хiмiчним i антимiкробним властивостям наноматерiали знаходять ши-роке використання у рiзних га-лузях народного господар-ства, у т.ч. у медицин^ Серед цих матерiалiв вагоме мюце посiдають наночастки металiв, зокрема наносрiбло, анти-мiкробнi властивостi якого були вiдомi ще з 80-х роюв XIX ст. [1, 2]. Даш св^овоТ лiтератури пiдтверджують бтьш високу бактерицидну активнiсть на-норозмiрних часток металу порiвняно з юнною формою. Ефекти, якi можна отримати завдяки застосуванню нано-часток, залежать вщ технологií

синтезу часток, 1хнього розми ру, хiмiчного походження ста-бiлiзатора, стiйкостi колоТдноТ системи, виду мiкроорганiзму, хiмiчного складу композици на Тх основi тощо.

Тому всебiчна оцiнка нано-технолопй та наноматерiалiв, у тому чист отримання анти-мiкробних препаратiв, вив-чення механiзмiв взаемодií мiкроорганiзмiв i наночасток е актуальними i перспективни-ми [3-6].

Для отримання бажаного результату необхщно мати комплексну характеристику уЫх складових засобу, що розробляеться, вщокремити найвагом^, спираючись на обГрунтований методичний пщхщ до вивчення наномате-рiалiв.

ИССЛЕДОВАНИЕ ДОЗО-ВРЕМЕННОЙ ЗАВИСИМОСТИ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА Сурмашева Е.В, Михиенкова А.И., Корчак Г.И., Антомонов М.Ю., Никонова Н.А., Олийник З.А., Романенко Л.И. Целью данной работы было изучение зависимости антимикробного эффекта наночастиц серебра от их концентрации и экспозиции с помощью математической модели.

Материалы и методы исследования.

Материалом для создания математической модели была серия исследований по изучению антимикробных свойств коллоидного раствора наночастиц серебра и композита на его основе в матрице высокодисперсного кремнезема. Перечисленные объекты были синтезированы сотрудниками Института химии поверхности им. А.А. Чуйко НАНУ путем фотохимического восстановления из раствора нитрата серебра в присутствии тетрагидробората натрия.

В качестве стабилизатора использовали смесь поверхностно-активного вещества додецилсульфата натрия и полимера — поливинилпирролидона. Средний размер частиц, который фиксировали с помощью пропускающей электронной микроскопии, был на уровне 8-12 нм; концентрацию наночастиц

определяли методом атомно-адсорбционной спектроскопии.

Полученные результаты по изучению антимикробного действия растворов наночастиц серебра, сроков его сохранения, а также зависимости эффективности от происхождения стабилизаторов и белковой нагрузки были изучены и опубликованы ранее. Была выявлена динамика процессов увеличения антимикробной активности изучаемых объектов и предложена математическая модель, алгоритм построения которой состоял из нескольких этапов. Табличные данные сравнивали с разработанной моделью с помощью статистического пакета "STATISTICA 6.0", благодаря которому были рассчитаны значения математических параметров, использованные в дальнейшем для детального изучения полученных результатов. Созданная математическая модель продемонстрировала зависимость антимикробного действия наночастиц серебра от их концентрации и экспозиции, что не противоречит общепринятому в биологии правилу "доза — время — эффект". Ключевые слова: антимикробная активность, наночастицысеребра, высокодисперсный кремнезем, математическая модель, зависимость "доза — время — эффект".

© Сурмашева О.В., MixieHKOBa А.1., Корчак Г.1., Антомонов М.Ю., Шконова Н.О., Олйник З.А., Романенко Л.1. СТАТТЯ, 2012.

О

STUDY OF DOSE-AND-TIME DEPENDENCE OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SILVER NANOPARTICLES

Surmasheva O.V., Mikhienkova A.I., Korchak G.I., Antomonov M.Yu., Nikonova N.O., OliinykZ.A., Romanenko L.I.

Study of antimicrobial effect dependence of silver nanoparticles upon their concentration and exposure with a help of the mathematical model was an objective of a given work. Materials and methods of the study. A run of the investigations for the study of antimicrobial properties of the colloid solution of silver nanopar-ticles and composite on its base in the matrix of highly dispersive silica was a material for the creation of mathematical model. The mentioned objects were synthesized by the specialists of A.A. Chuiko Institute for Surface Chemistry, NASU, by means of photochemical reduction from the solution of silver nitrate at the presence of sodium tetrahydroborate. A mixture of the surface-active substance — sodium dodecyl sulphate and polymer — polyvinylpyrrolidone was used as a stabilizer. Average particle size, fixed with the help of transmissing electronic

microscopy, was at the level of 8-12 nm; nanopar-ticle concentrations were determined by the method of atomic-and-adsorptive spectroscopy. The obtained results of the antimicrobial effect study of silver nanoparticle solutions, terms of its preservation, and also a dependence of the efficiency upon the origin of stabilizers and protein loading were studied and published earlier. A dynamics of the process of the increase of antimicrobial activity of studied objects was revealed and a mathematical model, algorithm of its creation included several stages. The table data were compared with the developed model with the help of STATISTICA 6.0 statistical packet. The meanings of the mathematical parameters used in further for a detail study of the obtained results were calculated owing to it. Created mathematical model has demonstrated a dependence of antimicrobial effect of silver nanoparticles from their concentration and exposure. It doesn't contradict a general dose-time-effect biological rule. Keywords: antimicrobial activity, silver nano-particles, highly dispersed silica, mathematical model, dose — time — effect dependence.

Комплекс результат, отри-маних нами у ходi вивчення антимкробноУ активност на-ночасток срiбла, дозволив обфунтувати методичний пщ-хщ до проведення подiбних дослщжень i представити алгоритм Ух виконання у наступ-них публка^ях [7, 8].

Метою даноУ роботи було вивчення залежност антимкробноУ дм наночасток сри бла вщ Ух концентраци та три-валост експозицп за допомо-гою математичноУ модель

Матерiали i методи до-слщження. Матерiалом для створення математичноУ мо-делi служила серiя дослщжень з вивчення антимкробних властивостей колоУдного роз-чину наночасток срiбла (НЧ Ag) та композиту на його ос-новi з використанням су-спензiУ високодисперсного кремнезему (ВДК), на поверх-нi якого було адсорбовано наносрiбло. Перелiченi об'ек-ти дослщження були синтезо-ванi спiвробiтниками 1нститу-ту хiмiУ поверхнi iм. О.О. Чуйка НАНУ шляхом фотохiмiчного вщновлення у присутностi тетрагiдроборату натрiю (NaBH4) з нiтрату срiбла (AgNO3). В якост стабУшзато-ра використовували сумш поверхнево-активноУ речови-ни додецилсульфату натрiю (ДСН) та пехшмеру — ncmiBi-шлгпролщону (ПВП). Отрима-

45 Environment & Health № 4 2012

ний колоУд срiбла мав серед-нiй po3Mip часток, який фксу-вали за допомогою пропу-скаючоУ електронноУ мкро-скопiï (ПЕМ) на рiвнi 8-12 нм; концентрацю наночасток виз-начали методом атомно-ад-сорбцмно'У спектроскопiï.

Рашше вже було вивчено ан-тимiкробну активнiсть коло'|'д-ного розчину НЧ Ag та композиту на його основi — НЧ Ag/SiO2, а також визначено строки ïï зберкання. Крiм того, було продемонстровано за-лежнiсть антимкробноУ дм вiд

походження стабiлiзатора та величини бткового наванта-ження, що знайшло вщобра-ження у попередшх публка-цiях [9, 10].

У ходi експериментального дослiдження й аналiзу даних було виявлено динамiку про-цесiв зростання антимкроб-ноï активност вивчених об'eктiв. Тому було виршено на основi отриманих резуль-талв розробити математич-ну модель, алгоритм побудо-ви якоï складався з таких етатв:

ÈÎ

W

СО

О

Приклад залежностi

Рисунок 1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Експозицт, год.

□ в^^р вихiдних табличних даних;

□ побудова графкв за ви-хiдними фактичними даними динамки процеав;

□ вибiр математичноТ модел^

□ розрахунок параметрiв математичноТ модел^

□ аналiз отриманих результат.

У ходi вивчення фактичних даних було обрано результа-ти визначення антимкробноТ активностi дослiдних зразкiв, в яких прослщковувалися ди-

намiка процесу i залежнiсть "час — ефект". Цi данi викори-стали для побудови графкв, приклад яких показано на рис. 1.

Вказаний графк (рис. 1) було побудовано за результатами вивчення антимкробноТ дм щодо Staphylococcus aureus (S. аureus,) стаб^зова-ного бiнарною сумiшшю 0,0016% колоТдного розчину НЧ срiбла [9].

Пюля аналiзу отриманих гра-фкв, побудованих за обрани-ми даними, виходячи з логки процесу та рiзновидiв гра-фiкiв, в якост моделi було за-стосовано таку математичну функцю:

у = утах(1 - exp (- ktn), де утах — гранично допустима кiлькiсть мiкроорганiзмiв у кон-тролi культури, яка знаходить-ся на рiвнi 7,7 lg; k — показник (характеристика) швидкост процесу; n — показник вигину кривоТ (характеристика нели нiйностi процесу); t — час.

Рисунок 2

Модель динамки зростання антимкробноТ активност на прикладi 0,0016% колоТдного розчину НЧ срiбла, стабiлiзованого бiнарною сумiшшю, у вiдношеннi S. aureus

4

v >

О) 3

о. 3

а.

со

о

0 2

4 6

10 12 14 Експозищя,

16 год.

18 20 22 24 26

Аналiзуючи первинш графи ки, подiбнi до графка на рис. 1, та вказану функцiю, розрахо-вували математичнi параме-три для усiх обраних результа-тiв i побудували кривi, як мали плавний вигляд. Зокрема, залежнють, представлена на рис. 1, пюля вказаноТ обробки мала iнший вигляд (рис. 2).

За допомогою статистичного пакету "STATISTICA 6.0" обранi табличнi данi порiвнювали з розробленою моделлю дина-мiки зростання антимiкробноí активность У результатi математичноТ обробки було розра-ховано значення наступних па-раметрiв, за якими характери-зували отриманi данi: k i його вiрогiднiсть pk; n i його вiрогi-днiсть pn; R — коефщент коре-ляцп даних; F — адекватнють усiеí модель Крiм вказаного, використана математична модель дозволила розрахувати критичний час (t*) подолання необхщного логарифму редук-цií R на рiвнi 5,0 lg (табл. 2-6).

Облк отриманих даних роз-починали з аналiзу показникiв F i R. Перший характеризуе адекватнють дослщних результат побудованiй моделi зростання антимiкробноí ак-тивностi (рис. 2), другий — Тхню кореляцiю. Значення по-казниюв швидкостi процесу (k) зростання антимкробноТ дм дослiдних зразкiв та критичний час (t*) для подолання межi у 5,0 lg перебувае у зво-ротно-пропорцiйнiй залежно-стк при збiльшеннi k зменшу-еться час для досягнення необхщного ефекту i навпаки.

На вщмшу вiд загальноприй-нятого рiвня достовiрностi 95,0% у мiкробiологií ще 1987 року було доведено, що для саштарно-мкробюлопчних до-слщжень прийнятою е до-стовiрнiсть результатiв на рiвнi 90,0%.

Вплив стабiлiзаторiв на антимiкробну активнiсть зразкiв

Таблиця 1

Назва зразка та концентращя Математичн параметри

k pk n pn R F t*

0,0016% НЧ Ag ДСН - S. aureus 0,67 0,46 0,53 0,17 0,83 4,47 2,31

0,0016% НЧ Ag ДСН + ПВП - S. aureus 0,22 0,01 0,80 0,01 0,99 77,51 7,00

0,0016% НЧ Ag ДСН + ПВП - P. aeruginosa 0,69 0,10 0,56 0,02 0,98 57,77 2,13

8

7

6

5

2

8

Цей пiдхiд для оцЫки отри-маних даних знайшов вщобра-ження також в европейських стандартах [11], за методиками i положеннями яких було проведено експериментальш дослщження i здiйснено роз-рахунки результатiв. Тому yci результати, як описано у пу-блiкацiях, мають рiвень досто-вiрностi, щонайменше, 90,0%, i вiрогiднiсть помилки перебу-вае у межах р<0,1.

Виходячи з отриманих ре-зультатiв щодо впливу хiмiч-ного походження стаб^за-тора на антимкробну актив-нiсть колоУдних розчинiв НЧ Ag (табл. 1) можна сказати, що необхiдний lg R 5,0 у випадку використання для стабгшзацп тгпьки ДСН було досягнуто за коротший час контакту (2,31 год.), але показники F i R були на невисокому рiвнi, також мала мюце велика вiрогi-днють помилки (р=0,17). Вод-ночас математичш параметри з облiку результатiв протими кробного ефекту колоУду на-носрiбла, стабiлiзованого би нарною сумiшшю, на моделi S. aureus i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) мали висок показники F i R, як до-стовiрно (р=0,01 та р=0,02 вщ-повiдно) свiдчать про досяг-нення необхiдноi редукцii за 7,00 год. та 2,13 год. контакту вщповщно.

Визначення впливу концен-трацiй колоУдного розчину НЧ срiбла за математичними па-

раметрами на бактерицидну властивють Ух проведено на моделi чутливостi P. aeruginosa (табл. 2).

Як видно з даних табл. 2, зменшення концентрацп НЧ срiбла з 0,0016% до 0,0004% призводило до пролонгацii часу експозици t* з 2,13 год. до 5,41 год. для отримання lg R 5,0, що не суперечить загальноприйнятм у бiологii залежностi "доза — час — ефект".

Така саме залежнють анти-мiкробного ефекту вщ концен-трацii та тривалост експозицii прослiдковувалася i пiд час вивчення композиту НЧ срiбла у матриц ВДК (табл. 3 i 4).

При аналiзi математичних параметрiв (табл. 3 i 4) при-вертае увагу той факт, що ан-тимiкробний ефект композиту НЧ Ag/SiO2 у базовiй концентрацп' (0,0016%) щодо бакте-рiй (P. aeruginosa i S. aureus) досягався за 5,25 год. та 1,4 год. вщповщно, хоча таю дан не е достовiрними (р=0,19 та р=0,16 вiдповiдно), i показники F i R замалк

Всупереч цьому при вико-ристанш робочих розчинiв суспензii спостерiгалося по-ступове зростання анти-мкробно'У дii композиту з пли-ном часу, причому чим бть-шим було розбавлення, тим меншою вiрогiднiсть похибки. Так, при застосуванш композиту НЧ Ag/SiO2 у концентрацп 0,0008% щодо P. aerugino-

sa i S. aureus значення р=0,03 та р=0,01 вщповщно; 0,0004% — р=0,004 та р=0,002 вщ-повiдно. Найбiльш адекватнi за показником R результати було отримано при вивченш найменшо! концентрацii композиту за наносрiблом (0,0004%) щодо грамнегатив-но! та грампозитивноi мкро-флори. Такi данi можуть свщ-чити на користь того, що при використанш ще менших кон-центрацiй НЧ срiбла у матриц дiоксиду кремнiю i подовжен-ш експозицii будуть отриманi достовiрнi результати з анти-мiкробноi активностi.

Також математична обробка результалв показала суттеву рiзницю у чутливостi мкроор-ганiзмiв залежно вiд Ухньо'У ви-дово! приналежностi. Так, представники грампозитив-но! мiкрофлори були чутливи шими за представникiв грам-негативно! мiкрофлори до дii НЧ Ag/SiO2 у середньому в 1,5 рази.

Таблиця 2

Вплив концентрацп НЧ ср1бла на його антимкробну активнють (на модел1 P. aeruginosa)

Назва зразка та концентращя Математичн параметри

k Pk n Pn R F t*

0,0016% НЧ Ag ДСН + ПВП 0,69 0,10 0,56 0,02 0,98 57,77 2,13

0,0008% НЧ Ag ДСН + ПВП 0,58 0,04 0,619 0,01 0,99 94,3 2,61

0,0004% НЧ Ag ДСН + ПВП 0,16 0,08 1,13 0,07 0,93 12,31 5,41

Таблиця 3

Вплив концентрацп НЧ ср1бла у матриц! ВДК на антимкробну активнють

(на моделi P. aeruginosa)

Назва зразка та концентра^я Математичн параметри

k Pk n Pn R F t*

0,0016% НЧ Ag/SiO2 0,18 0,21 1,06 0,19 0,82 3,96 5,25

0,0008% НЧ Ag/SiO2 0,15 0,04 0,76 0,03 0,91 13,89 12,94

0,0004% НЧ Ag/SiO2 0,06 0,002 0,85 0,004 0,98 65,92 29,24

47 Environment & Health № 4 2012

Статистична обробка результат та побудова моделi показали нелшмнють процесу вiдмирання мiкроорганiзмiв. Основна ix кiлькiсть гинула у першi години експозици, тоб-то антимiкробнiй gii пiдлягала спершу найбiльш чутлива ча-стина популяцii. Залежно вiд виду мкрооргашзму анти-мiкробний ефект був на рiвнi 3,0-5,0 lg R. Вщмирання за-лишково! частини мкрофло-ри, найбiльш стiйкоi до gii за-собу, було пролонговано у ча-сi, вимiрюваному днями. Зп-дно з розробленою моделлю теоретично таю стмю форми мiкроорганiзмiв можуть зу-стрiчатися за виxiдноi ix кгпь-костi на рiвнi 7,0-8,0 lg. Ця особливють обумовила рiзну швидкiсть антимiкробноi дii, як наслщок, графiки мали вигляд нелiнiйноi залежностк

Таким чином, отриманi ре-зультати i розроблена на ix ос-новi математична модель про-демонстрували ч^ку залеж-нiсть антимiкробноi дм НЧ сри бла як у коло'щному розчинi, так i у виглядi композиту, вiд концентрацii наночасток та ви-користаноi у досл^ тривало-стi експозицii. Крiм вказаного, було розраховано критичний час подолання необхщного за европейськими стандартами логарифма редукцп, який пе-ребувае на рiвнi 5,0 lg R. Таю дан дозволяють спрогнозува-

ти для подальшо! роботи ймо-вiрний час для отримання 5,0 lg R при зменшенш концентра-ци НЧ срiбла нижче 0,0004%.

Все вищевикладене не супе-речить загальноприйнятiй у бюлогп залежностi "доза — час — ефект", який подтвердила застосована математична модель обробки отриманих результалв. Запропоновану модель також можна викори-стовувати для оцшки анти-мiкробниx ефектiв, що спричи-няють наночастки срiбла, в iншиx концентра^ях та за iншиx експозицiй.

Л1ТЕРАТУРА

1. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы / Ю.А. Крутяков, А.А. Кудринский, А.Ю. Оленин и др. // Успехи химии. — 2008.

— Т. 77, № 3. — С. 242-269.

2. Препарати срiбла: вчора, сьогодш i завтра / О.Б. Щербаков, Г.1. Корчак, О.В. Сурмашева та н // Фармацевтичний журнал. — 2006. — № 5. — С. 55-67.

3. Sondy I. Silver nanopartic-les as antimicrobial agent: a case study on E.coli as a model for Gram-negative bacteria / I. Sondy, B. Salopek-Sondy // Colloid Interface Sci. — 2004. — № 275. — P. 177-182.

4. The bactericidal effect of silver nanoparticles / J.R. Morones, J.L. Elechiguerra, A. Camacho et al. // Nanotechnology.

— 2005. — Vol. 16, № 10. — P. 2346.

5. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes / G. A. Martinez, Nino-Martinez, Martinez-Gutierrez et al. // J. of Nanopar-ticle Research. — 2008. — Vol. 10, № 8. — P. 1343-1348.

6. Aruna Jyothi Kora. Assessment of antibacterial activity of silver nanoparticles on Pseudomonas aeruginosa and its mechanism of action / Aruna Jy-

othi Kora, J. Arunachalam // World J. of Microbiology and Biotechnology. — 2011. — Vol. 27, № 5. — P. 1209-1216.

7. AnropMTM MeToguHHoro nigxogy go BM3HaHeHHq aHTM-Mkpo6Hoi aKTMBHoCTi HaHOMa-Tepia.iB i KoMno3M^M Ha ix oc-HoBi / CypMaweBa O.B., Kop-HaK r.l., MixieHKoBa A.I., HkoHo-Ba H.O. // CyHacHi npo6.eMM enigeMio.norii, Mkpo6io.norii, ri-rieHM Ta Ty6epKy.bo3y: 36. Te3. gon. HayK.-npaKT. koh$. (^bBiB, 17-18 TpaBHq 2012 p.). — ^bBiB, 2012. — Bun. 9. — C. 229-233.

8. M3yHeHMe aHTM6aKTe-pMa.bHbix cbomctb HaHoMaTe-pua.oB: o6ocHoBaHMe MeTogu-HecKoro nogxoga / E.B. CypMaweBa, r.M. KopHaK, A.M. Mm-xMeHKoBa, H.A. HMKoHoBa, .n.M. PoMaHeHKo // MaTep. XI Bcepoc. Cte3ga mrneHMCTOB m caH. BpaHeM PO (MocKBa, 2012). — M., 2012. — T. II. — C. 255-257.

9. MMXMeHKoBa A.M. HaHoHa-ctm^i cepe6pa: xapaKTepMCTM-Ka m CTa6M.bHocTb aHTM-MMKpo6Horo geMCTBMq ko..o-MgHbx pacTBopoB / A.M. Mm-xMeHKoBa, lO.n. Myxa // floBKi.-.q Ta 3gopoB'q. — 2011. — № 1. — C. 55-59.

10. CepgraK A.M. HaHoHacTM-цb cepe6pa: xapaKTepMCTMKa m CTa6M.bHocTb aHTMMMKpo6Horo geMCTBMa KoMno3M^M Ha ocHoBe BbcoKogucnepcHoro KpeMHe3eMa / A.M. CepgraK, A.M. MMXMeHKoBa // floBKi..q Ta 3gopoB'q. — 2011. — № 3. — C.8-11.

11. EN 13727:2003 Chemical disinfectants and antiseptics — Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants for instruments used in the medical area — Test method and requirements (phase 2, step 1). — Brussels: European Committee for Standardization, 2003. — 36 p.

HagiMwna go pega^ii 05.08.2012.

Ta6nu^ 4

Вплив концентрацп НЧ ср1бла у матриц! ВДК на антимкробну актившсть

(на модел1 S. aureus)

Назва зразка та концентращя Математичнi параметри

k pk n pn R F t*

0,0016% НЧ Ag/SiO2 0,90 0,79 0,45 0,16 0,84 4,97 1,4

0,0008%НЧ Ag/SiO2 0,33 0,03 0,56 0,01 0,95 28,41 8,16

0,0004% НЧ Ag/SiO2 0,18 0,001 0,58 0,002 0,99 103,11 20,36