Изучение антибактериальной активности и иммуностимулирующего действия полифенольных соединений экстрактов Duschekia viridis Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ВИВЧЕННЯ АНТИБАКТЕРІАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ ТА ІМУНОСТИМУЛЮЮЧОЇ ДІЇ ПОЛІФЕНОЛЬНИХ СПОЛУК ЕКСТРАКТІВ DUSCHEKIA VIRIDIS

С.Ю. Біляєвська1, М.А. Кулагіна2, Т.П. Осолодченко1, О.В. Радько2, А.Г. Сербін2, О.В. Порт1 інститут мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України, Харків 2Національний фармацевтичний університет, Харків

РЕЗЮМЕ

Вивчена антибактеріальна активність та імуностимулююча дія поліфенольних сполук Duschekia viridis на музейних і клінічних штамів мікроорганізмів. Етилацетатний екстракт із стиглих суплідь володіє протимікробною дією по відношенню до широкого спектру мікроорганізмів та в подальшому може бути використований для отримання нового антибактеріального та імуностимулюючого препарату.

КЛЮЧОВІ СЛОВА: мікроорганізми, рослинні мулююча дія

Зростання стрімкими темпами процесів урбанізації, використання великої кількості продуктів хімії (фармацевтичні препарати, побутові речовини) та значний вплив фізичних факторів (електормагнітне та інше випромінювання) останнім часом привело до зростання алергічних процесів у людини при незначних захворюваннях. Тому лікарі частіше стали звертатися до ліків рослинного походження, які, по-перше, менш безпечні, по-друге, їх можна застосовувати у великих терапевтичних дозах та дуже тривалий час. При цьому забезпечується терапевтичний ефект та знижується ризик алергічного впливу.

Інтерес багатьох дослідників до антимікробних засобів рослинного походження виявив ряд антибіотиків, які дозволені для застосування в медицині. Синтетичні антибіотики, що зараз використовуються в клінічній практиці, можуть сприяти розвитку деяких побічних ефектів (алергічні реакції, пригнічуючий вплив на імунологічну реактивність організму, дизбіоз ротоглотки, кишкового тракту та ін.). Властивості рослинних антибіотиків підвищувати імунобіологічну реактивність організму та нормалізувати деякі них параметрах способу забезпечує одержання екстракту з вираженою антимікробною та протизапальною дією.

Робота виконана в рамках НДР Інституту мікробіології та імунології імені І.І. Мечникова АМН України “Вивчити показники імунологічної реактивності та визначити можливості імунокорекції у хворих на виразкову хворобу шлунка і дванадцятипалої кишки, асоційовану з Н.руїогі ”, № держреє-страції 0100 и000405.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Поставлене завдання вирішується таким чином, що літом та восени збирали кору, ли-

екстракти, антибактеріальна активність, імуности-

його фізіологічні функції обумовлюють значимість і перспективність пошуку антибіотичних препаратів серед рослин для потреб клінічної медицини [1, 2].

Серед численних представників лікарської флори в народній медицині здавна використовуються відвари й настої з різних частин рослин роду Вільха (Alnus g.). Вільха клейка розповсюджена на території України, Росії, Білорусії, країнах Європи, Азії, Америки. Відомо, що вільха клейка містить тритерпеноїди, дубильні речовини, органічні кислоти, цукрі та багато інших речовин. За даними літератури, біологічно активні речовини (поліфенольні сполуки, полісахаріди та ін.), які були вилучені з кори, листків, зелених та стиглих суплідь вільхи клейкої, мають протизапальну, антимікробну, репарати-вну, антиоксидантну дію та інші фармакологічні властивості [3, 4].

Однак на території України є ще один рід Вільхи-Душекія зелена, яка розповсюджена в Карпатах, де екологічні умови значно кращі, ніж у промислових районах Східної України. Тому було зроблена спроба отримати речовину з Duschekia viridis, який шляхом спиртової екстракції суплідь при зада-стя та супліддя дерева. Водорозчинні фракції полісахаридів з листя, стиглих та зелених суплідь, етілацетатні та спиртові екстракти отримували шляхом екстрагування 70% етанолом або дистильваною водою протягом 13-15 годин при співвідношенні сировина -екстраген - 1:9- 1:11 з подальшою фільтрацією упареного екстракту і обробкою етилацетатом у співвідношенні 1:2. Всього було отримано 9 композицій:

1. Розчинна фракція полісахаридів кори Душекії зеленої;

2. ВРПС (водорозчинні полісахариди) зі стиглих суплідь;

3. ВРПС зелених суплідь;

4. Етілацетатний екстракт із стиглих суплідь;

5. 30% спиртовий екстракт із стиглих суплідь;

6. Водний екстракт із стиглих суплідь;

7. 50-% спиртовий екстракт із стиглих суплідь;

8. ПР із стиглих суплідь;

9. ПР з зелених суплідь.

Усі мали вигляд випареної речовини зелено-коричневого кольору. Препарати розчинювали у воді та 70о спирті і перевіряли на антибактеріальну активність по відношенню до штамів, які є збудниками запальних інфекцій. Антибактеріальну дію препаратів перевіряли відповідно до нормативних документів методом дифузії в агар та серійних розведень. Дослідна концентрація складала 1,0% розчин [5].

Прототипом є альтан, який являє собою екстракт з суплідь вільхи клейкої та є комплексом речовин поліфенольної природи -похідних елаготанінів. Механізм фармакологічної дії альтану пов'язаний зі спроможністю елагатанінів у малих дозах впливати на клітини мембрани й стан цитоплазми. Антиоксидантний ефект препарату зумовлено наявністю гідроксильних груп у молекулах елагатанінів, а також особливостями будови самих молекул. Відомо, що перспективу кожного антибактеріального препарату, впровадженого в систему охорони здоров'я, крім вираженої антибактеріальної активності, мікробіологічно визначають наявність етіоспе-цифічності чи широкого спектру дії щодо різних таксономічних груп мікроорганізмів; переважна чи обрана бактерицидна дія; наявність чи відсутність мінімально вираженої селективної дії на чутливість мікроорганізмів [6, 7, 8].

Одержані дані про фармакодинаміку та теоретичні відомості про властивості елаготанінів дозволили обґрунтувати доцільність застосування екстрактів душекії зеленої при хронічних захворюваннях шлуночко-кишко-вого тракту, санації носоглотки бактеріоно-вин, впливають на функціональні властивості

Т-лімфоцитів, головне місце займає реакція гіперчутливості повільного типу (ГПТ). Вона націлена на визначення здатності іму-номодулюючих засобів впливати на продукцію сенсибілізованими лімфоцитами медіаторів різнонаправленої дії.

Досліджена дія етілацетатного екстракту на формування реакції ГПТ у інтактних мишей, лінії СВА, вагою 16-18 г. Реакцію проводили, імунізуючи тварин в/в еритроцитами барана у дозі 2х105 клітин. Для визначення сенсибілізації, мишам на 5 добу, вводили

сіїв.

Дослідження по антибактеріальній активності проводили з використанням стандартних тест-штамів мікроорганізмів, які рекомендовані ВОЗ:

1. Staphylococcus aureus ATCC 25923;

2. Escherichia coli ATCC 25922;

3. Proteus vulgaris ATCC 4636;

4. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;

5. Candida albicans ATCC 885/653

Додаткові дослідження проводили по відношенню до музейних та клінічних штамів мікроорганізмів.

За даними літератури була встановлена імуномодулююча активність фракції водорозчинних полісахаридів, отриманих з різних частин вільхи клейкої. Тому ми вирішили вивчити вплив досліджуваної сполуки на клітинну ланку імунної відповіді. Вивчення дії імуномодуляторів на клітинну ланку імунної відповіді передбачає використання модельної системи, які дають нам уявлення про функціональну активність лімфоцитів Т-ряду; реакцію гіперчутливості повільного типу (ГПТ) та реакцію “трансплантат проти хазяїна” (РТПХ).

Реакція «трансплантат проти хазяїна» дає можливість оцінити дію досліджуваної речовини на ефекторну здатність Т-лімфоцитів в реакції трансплантаційного імунітету.

У попередніх серіях дослідів визначали дозу введення батьківських лімфоцитів, які викликають 50% пригнічення росту ендогенних колонієутворюючих клітин (КУК) в селезінці мишей F1. Ця доза складала 0,8 х 106 та була використована в подальших дослідах. Мишей (CBAxC57BL)Fi випромінювали в дозі 5 Гр і вводили в/в 0,8х106 в 0,5 мл клітин лімфатичних вузлів мишей СВА. 1% розчин етілацетатного екстракту стиглих суплідь вводили реципієнтам підшкірно відразу після трансплантації.

Серед модельних систем, які вивчають імунотропні властивості препаратів та речо-

1х108 клітин (ЕБ) в 0,5 мл фізіологічного розчину у подушечку задньої лапи (дозволяюча ін'єкція). У контрольну лапу вводили фізіологічний розчин у тому ж об'ємі.

Місцеву запальну реакцію оцінювали через 24 години по різниці ваги досліджуваної (Ро) і контрольної (Рк) лап. Індекс реакції (ІР) вираховували для кожної миші за формулою:

P - P

ID =-°------K -100%,

Pk

где ІР - індекс реакції;

Р0 - вага досліджуваної лапи;

Рк - вага контрольної лапи.

Контролем були інтактні не імунізовані миші, які отримували допустиму дозу антигена. Вплив екстракту на ГПГ оцінювали по зсуванню індекса реакції [9].

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

У дослідах було показано, що поліфенольні сполуки, які отримані з екстрактів ду-шекії зеленої, найбільш вираженою антибактеріальною дією володіють етілацетатний, спиртовий та водний екстракти стиглих суплідь. Діаметри зон затримки росту по відношенню до стафілококів, кишкової палички, протею та палички синьо-зеленого гною

складали на рівні 18-27 мм, що вказувало на виражену або високу протимікробну активність. Найбільшу активність розчини показали по відношенню до стафілококів (25-27 мм), чутливість спостерігалась у грамнегати-вних бактерій (18-25 мм). Крім цього, встановлена слабка протигрибкова дія (14-16 мм). Достовірно вище діаметри зон затримки росту спостерігались у етлацетатного екстракту стиглих суплідь. У порівнянні з контрольним препаратом - альтаном, за виключенням стафілокока та кандиди, по відношенню до грамнегативної флори у екстрактів зони затримки були вище. Дані надані в табл. 1.

Таблиця 1

Антибактеріальна активность різних сполук душекії зеленої по відношенню до штамів різних мікроорганізмів

Сполуки S.aureus ATCC 25923 E.coli ATCC 25922 P.vulgaris ATCC 4636 P.aeruginosa ATCC 27853 C.albicans ATCC 885/653

Діаметр зони затримки росту в мм M±m

Розчинна фракція полісахаридів кори Душекії зеленої 14±0,1 12±0,2 11±0,1 ріст ріст

ВРПС (водорозчинні полісахариди) зі стиглих суплідь 14±0,1 15±0,1 16±0,2 13±0,1 ріст

ВРПС зелених суплідь 15±0,2 16±0,2 17±0,3 13±0,1 ріст

Етілацетатний екстракт із стиглих суплідь 27±0,5 25±0,3 24±0,6 22±0,4 15±0,2

30-% спиртовий екстракт із стиглих суплідь 24±0,4 22±0,3 21±0,5 19±0,2 14±0,1

Водний екстракт із стиглих суплідь 25±0,7 21±0,5 20±0,4 20±0,4 14±0,2

50-% спиртовий екстракт із стиглих суплідь 25±0,5 23±0,4 21±0,2 18±0,3 14±0,2

ПР із стиглих суплідь 15±0,2 18±0,3 16±0,2 14±0,1 ріст

ПР з зелених суплідь 15±0,2 17±0,2 12±0,1 ріст ріст

Контроль-альтан 25±0,5 21±0,3 14±0,1 12±0,1 14±0,2

Примітка: р< 0,05

З метою поглибленого вивчення антибактеріальних властивостей розчинів наступним етапом наших досліджень було визначено мінімально-прігнічуючу (МПК) та мінімальну бактерицидну концентрацію (МБК) методом серійних розведень в бульйоні. Встановлено, що середнє арифметичне значення МПК розчинів з кори, зелених суплідь та дилась у межах від 0,2 до 1,5 млг/мл (для розчинів з стиглих суплідь - 0,5 млг/мл, для інших - 0,8-1,5 млг/мл, для альтану - 0,6 млг/мл).

У дослідах in vitro була вивчена антимікробна активність різноманітних сполук, отриманих різними способами екстрактів з кори, листя та суплідь душекії зеленої. Було встановлено, що етілацетатні та спиртові екстракти з стиглих суплідь володіють високою антибактеріальною дією по відношенню до штамів мікроорганізмів, які є збудниками гнійно-запальних процесів.

У подальшому ми вирішили розширити спектр мікроорганізмів і перевірити дію еті-

листя складало на рівні 0,5 млг/мл і цей показник достовірно не відрізнявся для різних штамів мікроорганізмів, за виключенням палички синьо-зеленого гною та протею - 1,0 млг/мл. МПК для екстрактів із стиглих суплідь складало 0,2-0,35 млг/мл. Для контрольного препарату - 0,35 млг/мл.

Також було встановлено, що МБК знахо-лацетатного та спиртових екстрактів на патогенні штами, які викликають інфекційні захворювання (дифтерію, сальмонелез, дизентерію).

Для визначення антибактеріальної дії досліджуваних речовин по відношенню до патогенних штамів (сальмонела, шигела, коринебактерія дифтерії) - збудників інфекційних захворювань, проводили методом дифузії в агар та серійних розведень. У дослід брали тільки музейні штами. Було встановлено, що спиртові екстракти поліфенольних сполук душекії зеленої володіють антимікробною дією по відношенню до штамів дифтерії, сальмонел та шигели. Діаметри зон

затримки росту складали по відношенню до негативної флори (сальмонела і шигела) 17-дифтерії 20-22 мм, по відношенню до грам- 19 мм. Дані надані в табл. 2.

Таблиця 2

Антибактеріальна активність екстрактів стиглих суплідь по відношенню до мікроорганізмів,

що викликають інфекційні захворювання

Мікроорганізми Діаметри зон затримки росту в мм М±м

Етілацетатний екстракт із стиглих суплідь 30% спиртовий екстракт із стиглих суплідь Водний екстракт із стиглих суплідь 50% спиртовий екстракт із стиглих суплідь

Shigella flexneri 170 21±0,4 17±0,2 17±0,1 18±0,3

Salmonella paratyphy A 290 20±0,3 18±0,2 17±0,1 18±0,1

Salmonella paratyphy B 42 18±0,1 15±0,3 16±0,1 17±0,3

SalmonellatTyphimurium 144 19±0,1 16±0,2 16±0,1 18±0,2

Enterobacter aerogenes 418 23±0,4 18±0,2 16±0,1 17±0,1

Corynebacterium diphtheria mitis 6 23±0,4 20±0,3 18±0,1 19±0,2

Corynebacterium diphtheria gravis 14 24±0,5 20±0,3 18±0,2 19±0,2

Примітка: р< 0,05

З метою поглибленого вивчення антибактеріальної активності було вирішено провести досліди на клінічних штамах мікроорганізмів, які виділялись від хворих з різними гнійно-запальними процесами (стафілококи, кишкова паличка та паличка синьо-зеленого гною, кандиди, протей, стрептококи). Однак ми не змогли отримати клінічні штами патогенних бактерій (дифтерії, сальмонели, ши-гели) за відсутністю їх або по запобіганню порушень санітарно-епідемічного режиму.

Вивчення антибактеріальної активності досліджуваних препаратів по відношенню до клінічних штамів показало, що ці сполуки володіють чутливістю до отриманих бактерій. Діаметри зон затримки росту складали 13-20 мм і відрізнялись за цими показниками від стандартних. Однак у етілацитатного та спиртових екстрактів ці показники відрізнялись на 2-3 мм і не впливали на загальні результати дослідів (табл. 3).

Таблиця 3

Антибактеріальна активність препаратів по відношенню до клінічних штамів мікроорганізмів,

виділених від хворих із запальними процесами

Мікроорганізми Діаметри зон затримки росту в мм М±м

Етілацетатний екстракт із стиглих суплідь 30% спиртовий екстракт із стиглих суплідь Водний екстракт із стиглих суплідь 50% спиртовий екстракт із стиглих суплідь

S. aureus 20±0,5 16±0,2 15±0,1 15±0,1

E.coli 18±0,2 15±0,1 12±0,1 17±0,2

P.vulgaris 17±0,1 15±0,2 14±0,1 14±0,1

P. aeruginosa 15±0,1 13±0,1 14±0,1 14±0,1

C.albicans 14±0,1 13±0,1 14±0,1 15±0,1

S.pyogenes 19±0,1 15±0,1 17±0,1 16±0,2

Примітка: р< 0,05

Вивчення імуномодулюючої дії свідчать, дозі знижувало число ендогенних КУК до

що сублетальне випромінювання приводило 4,4±0,48, т.е. інгибіція складала 56,5%.

до появи в селезінці 10,1±0,8 КУК, а введення батьківських лімфоцитів у відповідній

Таблиця 4

Вплив етілацетатного екстракту на реакцію «трансплантат проти хазяїна»

Речовина Доза речовини, мг/кг Доза лімф. клітин (х106) Середнє число КУК на селезінку сублетально опромінюваних мишей (М+т) Індекс інактивації КУК (%) Вірогідність інгибіції (Р)

- - - 10,1±0,08 - -

- - 0,8 4,4±0,48 56,5 -

Етілацетатний екстракт стиг- 0,1 0,8 4,6±0,81 54,7 <0,05

лих суплідь

Т-активін 0,1 0,8 6,0±0,54 40,6 <0,05

Іншими словами, ці дані характеризують проти ендогенних КУК. Введення етілацета-

активність трансплантованих лімфоцитів тного екстракту і Т-активіна одночасно з

трансплантацією батьківських лімфоцитів суттєво не впливало на число ендогенних КУК, що свідчить про відсутність впливу на пересаджені клітини (табл. 4).

Етілацетатний екстракт у досліджуваній дозі не чинив будь-якої дії на активність трансплантованих лімфоцитів і не впливав на ступінь реакції "трансплантат проти хазяїна".

Як свідчать надані дані табл. 5, при індукції ГПГ у сенсибілізованих тварин інтенси-

вність реакції складала 24,7% (2-а група). Після введення розчину етілацетатного екстракту стиглих суплідь ІР дорівнювався до 34,2%. Усе вищесказане свідчить про підвищення активності формування ГПГ під впливом екстракту.

Оскільки ГПГ формується відповідно лі-мфоцитами-ефекторами, можна зробити висновок, що досліджуваний етілацетатний екстракт є стимулятором клітинної ланки імунітету.

Таблиця 5

Вплив розчину екстракту на реакції ГПГ, індуковану ЕБ у інтактних мишей

Група Етілацетатний екстракт стиглих суплідь Доза мг/кг Число тварин І Р, % Р

Контроль - 1 (тілько дозволяюча доза) - - 21 8,80±0,89 -

Контроль - 2 (сенсибілізована + дозволяюча доза*) - - 18 24,70±2,68 -

Контроль - 3 (сенсибізизуюча дозволяюча доза) Pозчин екстракту 18 34,20±3,83 <0,05

* - за 100% прийнята інтенсивність ГПТ в 2-ій групі; P - по відношенню до групи 2.

ВИСНОВКИ

1. Отримані поліфенольні сполуки з різних частин рослин душекії зеленої володіють антибактеріальною активністю.

2. Етілацетатний екстракт із стиглих суплідь душекії зеленої проявив високі антибактеріальні властивості по відношенню до широкого спектру мікроорганізмів різних таксономічних груп у порівнянні з препаратом альтан, який був отриманий із вільхи клейкої та випускається фармацевтичною промисловістю.

ЛІТЕРАТУРА

1.

3. Етілацетатний екстракт не чинив будь-якої дії на активність трансплантованих лімфоцитів і не впливав на ступінь реакції “трансплантант проти хазяїна”, а також є стимулятором клітинної ланки імунітету.

Проведені досліди вказують, що етілаце-татний екстракт, отриманий із стиглих суплідь душекії зеленої, володіє антибактеріальною та імуностимулюючою активність і в подальшому може бути використований при розробці антибактеріального та імуностиму-люючого препарату.

Машковський М.Д. “Лекарственные средства” в 2-х томах, Т. 2. Изд. перераб., исправл. и дополн. - ООО” Новая Волна”. - 2002. - С. 398.

2. Кьосев П. А. Полный справочник лекарственных растений. -М.:ЭКСМО-ПРЕСС.- 2001. - 992 с.

3. Радько Е.В., Кулагина М.А., Самура Б.А., и др. // Сб. Лекарства-человеку. - 2001. - Т. XVI. - №12. - С.419-425.

4. Данилова О.І., Щелкунов Л.Ф., Дудкін М.С. // Сб. Лекарства-человеку - 2002. - Т. XVIII. - №3. -С.13-15.

5. Мазулин Г.В., Герасимов В.Н., Мазулин А.В. // Сб. Лекарства-человеку. - 2002. - Т. XVIII.- №3.-С. 37-39.

6. Данилова О.І., Денісюк Н.А., Решта С.П., та ін. // Сб. Лекарства-человеку. - 2002. - Т. XVIII. - №3.7. С. 10-12.

8. Доля І.С., Стець В.П., Мозуль В.І., та ін. // Сб. Лекарства-человеку. - 2001. - Т. XVI. - № 1-2. - С. 167-174.

9. Патент 56771, Україна, МПКИ А61К35/78 “Спосіб отримання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу”. Заявл. 15.05.2003 Бюл. № 5.

10. Беляевская С.Ю., Осолодченко Т.П., Батрак Е.А., и др. // Експериментальна і клінічна медицина. -2004. - № 4. - С. 75-79.

ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПОЛИФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЭКСТРАКТОВ DUSCHEKIA VIRIDIS

С.Ю. Беляевская1, М.А. Кулагина2, Т.П. Осолодченко1, Е.В. Радько2, А.Г. Сербин2, Е.В. Порт1 Институт микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова АМН Украины, Харьков

РЕЗЮМЕ

Изучена антибактериальная активность и иммуностимулирующее действие полифенольных соединений Duschekia viridis на музейные и клинические штаммы микроорганизмов. Этилацетатный экстракт из зрелых соплодий обладает противомикробным действием в отношении широкого спектра микроорганизмов и в дальнейшем может быть использован для получения нового антибактериального и иммуностимулирующего препарата.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микроорганизмы, растительные экстракты, антибактериальная активность, иммуностимулирующее действие

THE STUDING ANTIBACTERIAL AND IMMUNOPOTENTIAL ACTIVITY POLYPHENOL SUBSTAINTES OF EXTRAKTIS DUSCHEKIA VIRIDIS

S. Yu. Belyaebskya1, M.A. Kulagina2, T.P. Osolodchenko1, E. V. Radko2, A. G. Serbin2, E. V. Port1

^.I. Mechnikov Institute of Microbiology and Immunology of AMS of Ukraine, Kharkov

2University of Pharmacology of National, Kharkov

SUMMARY

Antibacterial and immunopotential activity of polyphenolic substaites from Duschekia viridis in museums's and clinical strains of microorganisms was studies. Ethylacetac extractis of ripe blossoms has antimicrobial activity to wide spectrum of microorganisms and in future can be used for introduction of new antibacterial and immunopotential drug.

KEY WORDS: microorganisms, extract’s of plants, antibacterial and immunopotential activity