CC BY
74
УДК 759.873.088.5:661.185
БАКТЕРІЇ РОДУ NOCARDIA ЯК ОБ’ЄКТИ БІОТЕХНОЛОГІЇ
Т. П. ПИРОГ, Д. І. ХОМ’ЯК, Н. А. ГРИЦЕНКО,
А. П. СОФІЛКАНИЧ, А. Д. КОНОН, Х. А. ПОКОРА
Національний університет харчових технологій, Київ, Україна E-mail: [email protected]
Отримано 26.03.2013
Наведено дані літератури та результати проведених авторами експериментів, що стосуються біотехнологічного потенціалу бактерій роду Nocardia. Розглянуто використання цих мікроорганізмів як деструкторів аліфатичних (октан, пентадеканол, ейкозан, октакозан, гексатриаконтан, пристан), ароматичних (фенол, октилбензен, фенатрен, антрацен), нітроароматичних (4-нітро-фенол), гетероциклічних (піридин, a-піколін) вуглеводнів. Показано перспективи застосування нокардій у процесах біотрансформації речовин (утворення даїдзену, ібупрофену, нікотинової кислоти) та синтезу деяких використовуваних на практиці метаболітів, зокрема антимікробних і цитотоксичних речовин (аяміцин, трансвалецин А, нокатіоцин, бразилібактин А, нокарацини та ін.), а також речовин з поверхнево-активними й емульгувальними властивостями.
Підсумовано експериментальні результати щодо оптимізації умов культивування ізольованого із забрудненого нафтою ґрунту штаму нафтоокиснювальних бактерій Nocardia vaccinii K-8 та інтенсифікації синтезу поверхнево-активних речовин на гліцеролі — побічному продукті виробництва біодизеля. Встановлено здатність штаму К-8 асимілювати деякі ароматичні сполуки (фенол, бензол, толуол, нафталін, гексахлорбензол, сульфанілова та N-фенілантранілова кислоти,
0,3-0,5%). Показано, що через 30 діб максимальний ступінь деструкції (94-98%) нафти (2,6 г/л) у воді спостерігався за оброблення суспензією клітин N. vaccinii K-8 (9,8107 КУО/мл), тимчасом як для очищення забрудненого нафтою ґрунту (20 г/кг) ефективнішим виявився препарат поверхнево-активних речовин (100-300 мл/кг) у вигляді постферментаційної культуральної рідини (деструкція 74-83% нафти). Встановлено, що поверхнево-активним речовинам (0,085-0,85 мг/мл) та іншим позаклітинним метаболітам штаму К-8 притаманна антимікробна дія щодо низки фітопатогенних бактерій родів Pseudomonas та Xanthomonas, кількість яких за присутності досліджуваних речовин знижувалась на 80-100%.
Ключові слова: бактерії роду Nocardia, деградація нафтових забруднень, біотрансформація, антибіотики, поверхнево-активні речовини.
Донедавна дані літератури щодо біотехнологічного потенціалу бактерій роду Иосатйіа були нечисленними, хоча перші повідомлення про можливість їх практичного застосування датуються 50-ми роками ХХ ст. Так, у 1956 р. Webley зі співавт. описав штами Иосатйіа ораса Т 16 і Иосатйіа ер. Р 2, здатні деградувати вуглеводневі сполуки С10-С16 [1]. У 60-70-х рр. ХХ ст. встановлено здатність представників роду Иосатйіа до деструкції циклоалканів та вуглеводнів складної будови [2-5], біотрансформації етилбензену в 1-фенілетанол та ацетофенон [6], а також з’явилися перші повідомлення про синтезовані нокардіями антибіотики [7].
Біохімічні властивості представників цього роду було узагальнено у 80-х рр. мину-
лого століття в монографії [8]. При цьому нокардії розглядали в основному як збудників захворювань у людей, тварин та рослин, а також як шкідників, здатних до біоруйну-вання підземних комунікацій [9]. На сьогодні рід Иосатйіа налічує 91 вид і є типовим родом родини Иосатйіасеае, до якої належать також роди Оотйопіа, МіїШіа і БЬетшапіа. Історію роду Иосатйіа докладно описано в роботі Уаввіи зі співавт. [10].
В останнє десятиліття з’явилась інформація стосовно синтезу представниками роду Иосатйіа антибіотиків, поверхнево-активних речовин (ПАР), про їхню здатність до деградації недоступних для більшості мікроорганізмів забрудників довкілля, зокрема таких, як поліциклічні ароматичні
вуглеводні, та можливість здійснення процесів біотрансформації [11-40]. В огляді підсумовано сучасні дані про використання бактерій роду Nocardia та їх метаболітів у біотехнології.
Використання представників
роду Nocardia для деградації нафтових забруднень
Нафта являє собою комплекс різних вуглеводнів (аліфатичних, аліциклічних, ароматичних) та інших сполук гетероциклічної і металоорганічної природи [5, 22]. Процеси видобутку, транспортування, перероблення нафти постійно супроводжуються аварійними викидами сировини у навколишнє середовище. На сьогодні вона є основним забруднювачем довкілля. Біоремедіація належить до пріоритетних методів очищення довкілля від забруднення нафтопродуктами. До потенційних переваг штамів роду Nocardia у деградації нафтових забруднень можна віднести: широкі катаболічні можливості, високу стійкість до несприятливих чинників зовнішнього середовища та здатність синтезувати ПАР [32, 41].
Деградація аліфатичних вуглеводнів. Нерозгалужені алкани є одним з найменш реакційноздатних класів органічних сполук. Проте, незважаючи на нерозчинність їх у воді, гідрофобність та високу частоту забруднення ними довкілля, вони є цілком придатним джерелом вуглецю для низки мікроорганізмів [42, 43]. Проблема природного забруднення нафтою також загострюється у зв’язку з наявністю у її складі розгалужених алканів. Останні є стійкішими до біодеградації, ніж лінійні алкани. Однією з причин стійкості може бути ускладнене споживання цих сполук у зв’язку з тим, що через розгалуженість вуглецевого ланцюга їм складно потрапити до клітини. Іншою причиною є те, що ці сполуки погано піддаються в-окисненню [12, 30].
Досліджено здатність мікроорганізмів, ізольованих із забрудненого внаслідок аварійного розливу нафти піщаного узбережжя Середземного моря, до деструкції вуглеводнів нафти [32]. У складі мікробного угруповання ідентифіковано п’ять видів, з яких один — представник роду Nocardia, два — Rhodo coccus і ще два — Gordonia. Вста нов ле -но, що штам Nocardia sp. SoB асимілював дизельне паливо, лінійні алкани (С12-С16), н-октан, октан, пентадеканол, проте не ароматичні сполуки, що можна пояснити відсутністю необхідних ензиматичних систем.
Ступінь деструкції ейкозану (С20), октакоза-ну (С28) та гексатриаконтану (С36), початкова концентрація яких становила 1 г/л, досягала 95-98% на 28-му добу за умов культивування в рідкому живильному середовищі [32]. У подальших дослідженнях встановлено, що біодеградація вуглеводнів штамом SoB у ґрунті залежала від його фізико-хіміч-них властивостей, а максимальний ступінь деструкції становив 75% на 28-му добу [14].
В інших дослідженнях виявлено високу здатність Nocardia cyriacigeorgica SBUG 1472, виділеного із забруднених нафтою зразків піску пустелі в Саудівській Аравії, до деградації широкого спектра вуглеводнів: н-алканів з довжиною ланцюга С6-С16, розгалужених алканів, зокрема пристану, а також ароматичних сполук [30]. Було встановлено залежність ефективності споживання н-алканів від довжини вуглеводневого ланцюга. Так, на С12-С16-сполуках ріст спостерігався вже з першої доби культивування, тимчасом як для коротших гомологів (С6-С12) — з третьої. Для визначення можливого шляху споживання алканів у безклітинних екстрактах, одержаних з клітин, вирощених на тетрадекані, аналізували проміжні продукти метаболізму. Наявність тетрадеканолу, тетрадеканової, додеканової і деканової кислот свідчить про функціонування в N. cyria-cigeorgica SBUG 1472 монотермінального шляху окиснення вуглеводнів [30].
Під час дослідження росту штаму SBUG 1472 на пристані (0,01%, об’ємна частка) було встановлено, що ступінь споживання становив 90% за 8 год, а за концентрації пристану 0,5% — понад 84% за 3 тижні. Результати свідчать про можливість використання цього штаму в процесах очищення довкілля від широкого спектра вуглеводнів, у тому числі й з розгалуженими ланцюгами [30].
У складі мікробних угруповань, ізольованих із забрудненого пристаном та нафтою ґрунту, ідентифіковано штами Nocardia coralline та Nocardia paraffinea, яким були притаманні такі властивості, як стійкість до арсену (III, V) і кадмію (за концентрації клітин не менше 4105 КУО/г) та здатність до утилізації широкого спектра аліфатичних і ароматичних вуглеводнів. Варто зазначити, що в деяких випадках за низьких концентрацій металів спостерігали стимуляцію деструкції вуглеводнів [11].
Деградація ароматичних вуглеводнів. До складу нафти входять ароматичні сполуки, наприклад бензен, а також поліциклічні ароматичні вуглеводні (ПАР), які є най-
більш екологічно небезпечними і надзвичайно стійкими до біодеструкції. Відомо, що представникам родини Иосатйіасеае притаманна здатність до деструкції ароматичних вуглеводнів [12, 18, 30, 35, 40]. Актуальним на сьогодні залишається вивчення особливостей метаболізму ароматичних субстратів у клітинах деструкторів, що дасть змогу регулювати метаболічні процеси та інтенсифікувати біоремедіацію [44].
Встановлено шляхи метаболізму октил-бензену (2-фенілоктану) в N. сутіасіцеотціса 8БиО 1472 за умов культивування штаму в рідкому живильному середовищі з 0,25 мл/л ароматичного субстрату [30]. Перетворення октилбензену розпочиналося з окиснення бічного ланцюга, при цьому як проміжний продукт було ідентифіковано 5-фенілгекса-нову кислоту, яка далі внаслідок в-окиснен-ня перетворювалася на 3-фенілбутират.
У роботі [40] описано термофільний штам (оптимальна для росту температура 50 °С), здатний рости на поліциклічних ароматичних вуглеводнях, ідентифікований як Nocaтdia Т8И1. Термофільні штами-дес-труктори ароматичних ксенобіотиків є перспективними для очищення води та ґрунту в регіонах зі спекотним кліматом. У ході досліджень було встановлено здатність штаму Т8И1 розкладати фенатрен і антрацен (0,5 г/л) на 90 та 25% відповідно за умов культивування в рідкому живильному середовищі упродовж семи діб. Різний ступінь деструкції цих ароматичних сполук пояснюється відмінністю в їхній хімічній будові та різною розчинністю у воді.
Лінійні алкілбензени (ЛАБ) з ароматичною структурою є також небезпечними забруднювачами довкілля. Було селекціоновано штам Nocaтdia ататае МБ-11, здатний використовувати ці сполуки як ростові субстрати [12]. Ступінь деградації ЛАБ з довжиною ланцюга С11-С14 та С10-С13 становив 70% на 96-ту год та 57% на 144-ту год культивування штаму МБ-11 відповідно [12].
У роботі [35] досліджено очищення фенолвмісних стічних вод у тарілчастому біореакторі іммобілізованими на скляних часточках клітинами Nocaтdia hydтocaтbo-noxydans ЫСГМ 2386. Слід зазначити, що іммобілізовані клітини виявили стійкість до вищих концентрацій фенолу (100 мг/л) порівняно із суспензійною культурою, для якої така концентрація була токсичною. Зниження кількості фенолу в стічних водах у результаті його асиміляції іммобілізованими клітинами штаму ЫС1М 2386 показано на рис. 1 [35].
У забруднених екосистемах часто наявні нітроароматичні сполуки — органічні речовини, що містять щонайменше одну нітро-групу, приєднану до ароматичного кільця (нітробензен, 3-нітронафтален, 3-нітробіфе-ніл, а також різноманітні нітрополіарома-тичні вуглеводні). На сьогодні відомо, що в клітинах мікроорганізмів-деструкторів на першому етапі катаболізму нітроароматич-них сполук відбувається відновлення ніт-рогрупи, після чого вони перетворюються на відповідні феноли, хінони або катехоли, з яких у подальшому утворюються інтерме-діати циклу трикарбонових кислот (ЦТК) [44].
Встановлено, що штам Nocaтdia ер. TW2 здатен рости на 4-нітрофенолі та здійснювати його перетворення за двома шляхами: 1,2,4-тригідроксибензоловим або гідрохіно-новим [18].
Час, год
Рис. 1. Біодеградація фенолу іммобілізованими клітинами N. hydrocarbonoxydans NCIM 2386 [35]
У результаті функціонування першого шляху 4-нітрофенол окиснюється через 4-нітрокатехол до 1,2,4-тригідроксибензолу. Про функціонування у клітинах другого шляху свідчить пряме окиснення 4-нітрофе-нолу за участю монооксигеназ до бензохіно-ну, який згодом відновлюється до гідрохінону. Далі, незалежно від шляху катаболізму 4-нітрофенолу, відбувається розрив ароматичного кільця, після чого як 1,2,4-тригід-роксибензол, так і гідрохінон перетворюються на малілацетат, який відновлюється до Р-кетоадипіну — попередника інтермедіа-тів ЦТК.
Деградація гетероциклічних сполук.
Поряд з аліфатичними й ароматичними вуглеводнями небезпеку для довкілля становлять також гетероциклічні сполуки, зокрема піридин та його похідні. Ці сполуки є стійкими до біодеструкції та добре розчинними у воді, тому часто ідентифікуються в забруд-
нених екосистемах, особливо у ґрунтових водах [45, 46].
У роботі [31] показано здатність штаму Nocaтdia ер. до росту на середовищі з піридином та а-піколіном (0,05-0,2 мг/л). Тривалість подвоєння біомаси Nocaтdia ер. за умов культивування на піридині й а-піко-ліні становила 8,25-16,9 та 6,9-9,05 діб відповідно. У процесі біодеградації піридину азот, що міститься у гетероциклі, перетворюється на аміак. За збільшенням концентрації амонійного азоту оцінювали ефективність споживання піридину. Згідно з теоретичними розрахунками було встановлено, що за умови 98%-ї деструкції піридину (200 мг/л) має утворитися 35,08 мг/л амонійного азоту. Проте експериментально показано, що за умов росту Nocaтdia ер. на піридині утворювалося 22 мг/л аміаку, що свідчить про деструкцію 61,5% субстрату.
Узагальнену інформацію стосовно біо-деструктивного потенціалу деяких представників роду Nocaтdia наведено в табл. 1.
Біосинтез використовуваних на практиці метаболітів
У сучасній літературі бактерії роду Nocaтdia розглядають як продуценти ПАР [47], речовин з антимікробною активністю та здатністю до пригнічення розвитку клітин злоякісних пухлин [15-17, 19-21, 22-24, 26-29, 33, 36, 37, 39]. Окрім того, клітини нокардій, а також їхні ензиматичні системи можуть бути використані для
проведення реакцій біотрансформації [13,
25, 34, 38].
Використання представників роду Nocar-dia у процесах біотрансформації. У роботі [13] показано можливість застосування цитохрому Р 154, виділеного з Nocaтdia faт-сіпіса ІЕМ10152, для здійснення трансформації ізофлавоноїду формонетину (100 мкМ) у частіше застосовувані продукти — даїдзен (естрогенподібна сполука з протипухлинною активністю) та 3/,4/,7-тригідроксіізо-флавон (антиоксидант) (рис. 2). Встановлено, що ефективність перетворення формонетину на даїдзен та 3/,4/,7-тригідроксіізофлавон становить 2,09% та 3,62% відповідно.
Уперше показано, що клітини Nocaтdia сотаїїіпа Б-276 можуть бути використані у процесі дерацемізації ібупрофену [25]. Клітини штаму Б-276 у фосфатному буфері (0,1 М, рН 7,0) ефективно гідролізували ібу-профену нітрил до ібупрофену аміду, який далі перетворювався на ібупрофен з ефективністю 99%. У роботі [38] описано ензим цис-епокси-сукцинатгідролазу (КФ 3.3.2.3) бактерій Nocaтdia іаПатісаш, що бере участь у трансформації цис-епоксисукцинату в Ь(+)-тарта-рову кислоту. Nocaтdia цІоЬетиІа NHB-2 розглядають як продуцент нікотинової кислоти, яка утворюється з 3-ціанопіридину за участю високоактивної нітрилази (ензим нітриламі-ногідролаза, КФ 3.5.5.1, 6,67 од/мг АСБ, 18,7 од/мл). Показано, що з додаванням досліджуваного ензиму (10 од/мл) відбувалася повна трансформація 300 мМ 3-ціанопіриди-ну в нікотинову кислоту упродовж 1 год [34].
Таблиця 1. Деградація ксенобіотиків вуглеводневої природи мікроорганізмами роду Nocardia
Штам Сполука, що піддається деградації Початкова концентрація, г/л Спосіб культивування Тривалість, год Ефективність, % Літера- тура
Nocaтdia ТЯН1 Фенатрен Антрацен 0,5 0,5 У колбах на качалці 168 168 90 25 [40]
Nocaтdia ер. Піридин а-Піколін 0,1 0,1 У колбах на качалці 168 168 61,5 53 [31]
Nocaтdia ер. ЯоБ Ейкозан (С20) Октакозан (С28) Гексатриаконтан (С36) 1 1 1 У пробірках з рідким середовищем 672 672 672 98,9 99,0 95,2 [32]
N. сутіасіцеотціса явио 1472 Пристан 0,1 5 У колбах на качалці 8 504 90 84 [30]
N. ататае МБ-11 Лінійні алкілбензени С11-С14 С10-С13 10 10 У колбах на качалці 96 144 70 57 [12]
N. hydrocarbonoxy-dans ^ІМ 2386 Фенол 0,1 Іммобілізовані клітини 48 99,9 [35]
Nocaтdia ораса Т 16 Фенілалкани 0,1 У колбах на качалці 40 67 [1]
3', 4', 7-тригідроксіізофлавон
Рис. 2. Схема трансформації формонетину цитохромом P 154, виділеним з N. farcinica IFM10152 [13]
Представники роду Nocardia як продуценти антимікробних та цитотоксичних речовин. Однією з глобальних проблем сьогодення є виникнення мультирезистентних форм патогенних мікроорганізмів, стійких до більшості використовуваних на практиці антибіотичних речовин. Актуальним є пошук сучасних ефективних антимікробних сполук, зокрема синтезованих рідкісними та патогенними представниками актиноміцетів [48]. Так, велику кількість метаболітів з антибіотичними властивостями було виявлено у представників роду Nocardia [28].
У роботі [22] описано штам Nocardia levis MK-VL 113, що синтезував біс-(2-етилгек-сил)-фталат та біс-(5-етилгептил)-фталат. Цим сполукам була притаманна антимікробна дія щодо низки бактерій, дріжджів та грибів, причому більшу активність виявляв біс-(2-етилгексил)-фталат. Найчутливіши-ми до дії цих метаболітів були Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermis — серед бактерій, Candida albicans, Epidermophyton floccosum — серед дріжджів таAspergillus niger, Fusarium oxys-porum — серед мікроміцетів. Мінімальні інгібуючі концентрації (МІК) біс-(2-етилгек-сил)-фталату при цьому становили 30-50, 40-50, 50-70 мкг/мл, відповідно. Хоча є досить багато даних про біосинтез біс-(2-етилгексил)-фталату мікроорганізмами, для роду Nocardia здатність синтезувати цю сполуку було показано вперше, як і здатність мікроорганізмів продукувати біс-(5-етил-гептил)-фталат [22].
У роботі [15] повідомляється про синтез штамом Nocardia sp. ALAA 2000 хризофано-лу 8-метилового ефіру, асфоделін-4,7-біхри-зофанолу, юстицидину Б та нової біологічно активної сполуки аяміцину (1,1-дихлоро-4-етил-5-(4-нітрофеніл)-гексан-2-он), особливість структури якої полягає в наявності одночасно як дихлор-, так і нітрогруп (рис. 3).
Рис. 3. Кристалічна будова аяміцину [15]
Було проведено масштабування процесу культивування штаму ALAA 2000 на біотех-нологічне обладнання. Утворення метаболітів починалося на 3-тю добу культивування і досягало максимуму на 7-му. Синтезованому Nocardia sp. ALAA 2000 аяміцину (0,1-0,5 мг/мл) була притаманна антимікробна активність щодо широкого спектра мікроорганізмів (Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus cereus ATCC 9634, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Micrococcus luteus ATCC 9341, Mycobacterium smegmatis ATCC 607, Corynebacterium xerosis NRRL B-1397, Rhodotorula acuta, Pichia angusta, Candida albicans) [15].
Патогенний для людини мікроорганізм Nocardia brasiliensis [16, 21, 36, 37] утворює велику групу речовин з антимікробними властивостями. Так, бразилібактин А є най-відомішим антибіотиком, що синтезується N. brasiliensis IFM 0995; за хімічною будовою це — індоловий алкалоїд [37]. Встановлено антимікробну активність бразилібактину А щодо Micrococcus luteus та Staphylococcus aureus (МІК 0,73 і 4,5 мг/мл, відповідно), потенційну цитотоксичність щодо клітин лейкозу мишей L1210 та раку шкіри людей KB (загибель 50% клітин за концентрації (СД50) 0,02 і 0,04 мкг/мл), а також здатність посилювати каспазну активність (0,3-3 мкМ) в клітинах лінії HL60.
Описано штам N. brasiliensis IFM 0667 — продуцент нокарацинів A, B, C та бразиліхі-нону D [36]. Показано, що компоненти А, B та D пригнічували розвиток грампозитив-них бактерій, зокрема кислотостійких Nocardia asteroides (MIK 3,13, 1,56 і 1,56 мкг/мл відповідно), Gordonia bronchialis (MIK 0,39, 0,78 і 0,78 мкг/мл відповідно) та Mycobacterium smegmatis (MIK 6,25, 6,25 і 12,5 мкг/мл відповідно). Нокарацинам A, B, C була притаманна цитотоксична дія in vitro щодо клітин промієлоцитарного лейкозу
людини HL-60 (СД50 0,91, 0,51 і 0,60 мкг/мл відповідно), а бразиліхінону D — щодо клітин лейкозу мишей L1210 (СД50 11 мкг/мл) та раку шкіри людей (СД50 20 мкг/мл) [36].
У роботі [29] досліджено тіопептидний антибіотик нокардитіацин, синтезований штамом Nocardia pseudobrasiliensis IFM 0757, що був високоефективним проти рифампі-цинрезистентних штамів Mycobacterium tuberculosis у концентрації 0,025-1,56 мкг/мл.
Leet зі спіавт. [23] описали тіазолілпеп-тидні антибіотики нокатіацини І-ІІІ та дослідили їхню антимікробну активність щодо грампозитивних бактерій in vitro та in vivo. Нокатіацини І-ІІІ ефективно діяли на представників родів Staphylococcus, Strep to -coccus, Enterococcus та Moraxella, у тому числі й на мультирезистентні патогенні штами Staphylococcus aureus (МІК 0,003-0,007 мкг/мл), Enterococcus faecium (0,015-0,03 мкг/мл), Streptococcus pneumoniae (0,0005-0,002 мкг/мл). Показано ефективність цих антибіотиків у організмі мишей щодо Staphylococcus aureus [24].
У роботі [16] встановлено антимікробну активність супернатанта культуральної рідини N. brasiliensis щодо патогенних для риб мікроорганізмів Vibrio damsela. Методом дифузії в агар встановлено, що максимальний діаметр зони затримки росту тест-культури був 17 мм за додавання 50 мкл супернатанту.
Досліджено антибіотик феназин, синтезований штамом Nocardia dassonvillei BM-17, виділеним з Північно-Льодовитого океану. Встановлено, що цій сполуці притаманна сильна антифунгальна активність щодо Candida albicans (МІК 64 мкг/мл), а також цитотоксичність щодо онкологічно трансформованих клітин HepG2, A549, HCT-116 та COC1 [17]. Nocardia sp., також виділені зі зразків морської води, були здатні до синтезу п’яти нових ліпопептидів, названих пеп-тидоліпінами B-F [39]. Компоненти B та Е чинили помірну антибактеріальну дію щодо метицилінрезистентного та метицилінчут-ливого штамів Staphylococcus aureus. Сильна антимікробна активність щодо мети-цилінрезистентного стафілокока притаманна також антибіотику наргеніцину А1, синтезованому Nocardia sp. CS682 [26, 27]. Окрім того, цей антибіотик за присутності 1,25-дигідроксивітаміну D3 або ретинолової кислоти пригнічував проліферацію та стимулював диференціацію клітин лейкозу HL-60 [33].
У роботі [20] описано антибіотик транс-валенцин А, що є комплексом цинку з органічною кислотою, яка містить фенол як
замісник, та синтезується патогенним штамом Nocardia transvalensis IFM 10065. Трансваленцин А виявляв антимікробну дію щодо грибів Trichophyton mentagrophytes IFM 10489, Paecilomyces variotii IFM 40913 і Cryptococcus neoformans ATCC 92112 (МІК 16,0, 2,0 та 4,0 мкг/мл відповідно) і бактерій Micrococcus luteus IFM 2066 (МІК 16,0 мкг/мл) [19].
Узагальнену інформацію щодо здатності представників роду Nocardia синтезувати антибіотичні речовини наведено в табл. 2.
Біосинтез ПАР
Окрім антибіотиків, представники роду Nocardia є продуцентами ПАР, однак у літературі дані про їх синтез обмежені. Так, у 2000 р. з’явилося перше повідомлення про здатність Nocardia sp. L-417 синтезувати ПАР на гідрофобних субстратах [47]. За хімічною природою ПАР штаму L-417 представлені сумішшю жирних кислот, які знижували поверхневий натяг води до 28 мН/м, виявляли високу емульгувальну активність, а значення критичної концентрації міцеле-утворення становило 20 мг/л. Також ПАР Nocardia sp. L-417 були стійкими в широкому діапазоні рН (2-12) і не втрачали своїх властивостей під час кип’ятіння упродовж 3 год.
У сучасних оглядах літератури, присвячених мікробним ПАР, є інформація про здатність бактерій роду Nocardia синтезувати поверхнево-активні гліколіпіди, у тому числі трегалозоміколати [49]. При цьому автори послуговуються інформацією кінця 80-х рр. ХХ ст., коли в літературі було описано штам Nocardia erythropolis — продуцент трегалозоміколатів. Однак дещо пізніше штам Nocardia erythropolis був рекласифіко-ваний як Rhodococcus erythropolis.
Таким чином, дослідження синтезу метаболітів представниками роду Nocardia та можливості їх застосування для очищення довкілля від ксенобіотиків, а також для створення альтернативних антимікробних препаратів є актуальним завданням сьогодення.
Біотехнологічний потенціал Nocardia vaccinii K-8
У попередніх дослідженнях із забруднених нафтою зразків ґрунту нами було ізольовано штам нафтоокиснювальних бактерій, ідентифікований як Nocardia vaccinii K-8, та встановлено його здатність до асиміляції вуглеводневих субстратів (нафта,
Таблиця 2. Антибіотичні речовини, синтезовані деякими бактеріями роду Nocardia
Штам Біологічно активна сполука Антимікробна дія щодо Літера- тура
Nocardia levis MK-VL 113 Біс-(2-етилгексил)фталат, біс-(5-етилгептил)фталат S. aureus, B. cereus, S. epidermidis, C. albicans, E. floccosum, A. niger, F. oxysporum [22]
Nocardia sp. ALAA 2000 Аяміцин (1,1-дихлоро-4-етил-5-(4-нітрофеніл)-гексан-2-он) E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 10145, B. subtilis ATCC 6051, B. cereus ATCC 9634, S. aureus ATCC 6538, M. luteus ATCC 9341, M. smegmatis ATCC 607, C. xerosis NRRL B-1397, R. acuta, P. angusta, C. albicans [15]
Nocardia transvalensis IFM 10065 Трансвалецин А T. mentagrophytes IFM 10489, P. variotii IFM 40913, C. neoformans ATCC 92112 M. luteus IFM 2066 [19, 20]
Nocardia sp. ATCC 202099 Нокатіоцин представників родів Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus та Moraxella, у тому числі й мультирезистентних [23, 24]
Nocardia brasiliensis IFM 0995 Бразилібактин А M. luteus, S. aureus [37]
Nocardia brasiliensis IFM 0667 Нокарацин A, B Бразиліхінон D кислотостійких бактерій N. asteroides, G. bronchialis, M. smegmatis [36]
Nocardia brasiliensis Не ідентифіковано патогену V. damsela [16]
Nocardia pseudobrasilien-sis IFM 0757 Нокардитіацин (тіопептид) рифампіцинрезистентного штаму M. tuberculosis [29]
Nocardia sp. CS682 Наргеніцин А1 метицилінрезистентного штаму S. aureus [26, 27]
Nocardia sp. Пептидоліпін B, Е (ліпопептид) метицилінрезистентного та метицилінчутливого штамів S. aureus [39]
Nocardia dassonvillei BM-17 Феназин C. albicans [17]
рідкі парафіни, гексадекан), причому ступінь утилізації цих гідрофобних сполук підвищувався за умови іммобілізації бактеріальних клітин [50].
На першому етапі встановлено можливість синтезу метаболітів з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями за умов росту N. ьассіпіі К-8 на гідрофільних (глюкоза, етанол) і гідрофобних (гексадекан, рідкі парафіни) субстратах. Підібрано оптимальні умови культивування на середовищі з глюкозою та етанолом (концентрація субстратів 1%, тривалість культивування 120-168 год, наявність у середовищі іонів заліза та дріжджового автолізату), які дали змогу збільшити показники синтезу ПАР майже утричі.
Подальші дослідження були спрямовані на пошук шляхів інтенсифікації синтезу ПАР під час культивування N. ьассіпіі К-8 на гліцеролі [51, 52]. Вибір такого субстрату зумовлений тим, що на сьогодні у світі досить гостро постала проблема утилізації гліцеролу — побічного продукту, утворюваного у величезних кількостях під час виробництва біодизеля з рослинної і тваринної сировини [53-55]. Найперспективнішим
шляхом вирішення цієї проблеми вважають використання гліцеролу як ростового субстрату в біотехнологічних виробництвах практично цінних продуктів. Використання однофакторних експериментів і математичних методів планування для оптимізації складу живильного середовища (0,5 г/л NaNOз, 0,3 г/л дріжджового екстракту і 1,5% гліцеролу) уможливило підвищення синтезу ПАР N. иассіпіі К-8 у 4 рази [52]. За хімічним складом ПАР, синтезовані N. ьассіпіі К-8 на гліцеролі, є комплексом нейтральних, гліко- та аміноліпідів. Нейтральні ліпіди представлені міколовими кислотами та п-алкановими кислотами, гліколіпіди — трега-лозодіацелатами та трегалозоміколатами [52].
Отже, одержані нами результати є одними з перших даних, що свідчать про здатність представників роду Nocaтdia синтезувати незвичайні за хімічним складом ПАР на гліцеролвмісному середовищі.
Виходячи з хімічної природи ПАР ми припустили, що можна підвищити ефективність процесу їх біосинтезу внесенням у середовище цитрату натрію — регулятора синтезу ліпідів і С4-дикарбонових кислот — попередників глюконеогенезу, що функціо-
нує за вирощування бактерій на невуглевод-них субстратах. Показано, що одночасне внесення в середовище з гліцеролом 0,2% фумарату і 0,2% цитрату на початку стаціонарної фази росту штаму К-8 супроводжувалося підвищенням на 40% кількості синтезованих ПАР порівняно з культивуванням бактерій на середовищі без органічних кислот [52].
Наступними дослідженнями встановлено здатність N. ьассіпіі К-8 рости на таких ароматичних сполуках (0,3-0,5%), як фенол, бензол, толуол, нафталін, гексахлорбензол, сульфанілова та ^фенілантранілова кислота. При цьому під час послідовних пересівів N. ьассіпіі К-8 на цих субстратах спостерігали не лише стабільний ріст штаму К-8, а й підвищення концентрації біомаси в середньому на 30-40% (табл. 3). У деяких випадках асиміляція сполук ароматичної природи штамом К-8 супроводжувалася синтезом ПАР. Враховуючи стабільний ріст N. ьассі-піі К-8 на зазначених субстратах, можна вважати досліджуваний штам ефекивним для очищення довкілля від ксенобіотиків ароматичної природи.
Практичне використання позаклітинних метаболітів N. vaccinii К-8
Серед продуктів мікробного синтезу, широко застосовуваних у різних галузях промисловості та в природоохоронних технологіях для очищення довкілля від ксено-біотиків, що вкрай актуально на тлі сучасної екологічної кризи, є мікробні ПАР, у тому числі й синтезовані представниками роду Nocaтdia [47, 49]. Однією з основних переваг мікробних ПАР перед синтетичними аналогами є їхня біодеградабельність. Разом з тим біологічна деструкція ПАР може бути суттєвою перешкодою для їх ефективного практичного використання. Наші експерименти показали, що мікроорганізми різних таксономічних груп (бактерії, гриби і дріжджі) здатні асимілювати ПАР N. ьассіпіі К-8 як єдине джерело вуглецю та енергії, а штам К-8 не спроможний використовувати власні ПАР як джерело вуглецевого живлення. Застосування як біоциду формаліну в концентрації 0,5% дає змогу подовжити до 30 діб термін зберігання ПАР N. ьассіпіі К-8 без суттєвої втрати їх поверхнево-активних властивостей.
Таблиця 3. Ріст Nocardia vaccinii К-8 на ароматичних сполуках
Ароматичні сполуки Концентрація, % (об’ємна частка) Біомаса (г/л) за умови послідовних пересівів
1 2 3
Фенол 0,3 0,2±0,01 0,25±0,01 0,3±0,01
0,5 0,25±0,01 0,35±0,01 0,45±0,02
Бензол 0,3 0,18±0,01 0,2±0,01 0,2±0,01
0,5 0,25±0,01 0,3±0,01 0,35±0,01
Толуол 0,3 0,17±0,01 0,2±0,01 0,2±0,01
0,5 0,2±0,01 0,25±0,01 0,3±0,01
Нафталін 0,3 0,2±0,01 0,23±0,01 0,25±0,01
0,5 0,25±0,01 0,3±0,01 0,4±0,02
^фенілантранілова кислота 0,3 0,2±0,01 0,22±0,01 0,25±0,01
0,5 0,25±0,01 0,25±0,01 0,3±0,01
Сульфанілова кислота 0,3 0,15±0,01 0,15±0,01 0,17±0,01
0,5 0,16±0,01 0,18±0,01 0,2±0,01
Гексахлорбензол 0,3 0,2±0,01 0,25±0,01 0,25 ±0,01
0,5 0,3±0,01 0,3±0,01 0,35±0,01
Примітка: як інокулят для послідовних пересівів використовували культуру із середини експоненційної фази росту в кількості 10% від об’єму середовища.
Показано можливість використання клітин N. ьассіпіі К-8 та їх метаболітів для очищення води, ґрунту і піску від нафти. Досить високих результатів біодеградації нафти у воді було досягнено із застосуванням іммобілізованих клітин N. ьассіпіі К-8 на керамзиті на спеціально сконструйованій установці (рис. 4). За продуктивності 0,68 л/год ефективність установки за концентрації нафти 100 мг/л становила близько 99% і знижувалася до 90% з підвищенням концентрації нафти до 250 мг/л [50]. Установка працювала з високою продуктивністю упродовж 30 діб з періодичним внесенням діамо-нійсульфату в концентрації 0,01%.
Наші подальші дослідження показали можливість очищення забрудненої нафтою води (2,6 г/л) за присутності клітин N. ьассі-піі К-8. Так, через 30 діб у разі використання суспензії клітин N. ьассіпіі К-8 (9,8107 КУО/мл) ступінь деструкції нафти досягав 94-98% (рис. 5).
Використання як препаратів ПАР супернатанта і нативної культуральної рідини супроводжувалося розкладанням 60-67% нафти через 30 діб.
Інтенсифікація деструкції нафти за присутності препаратів N. ьассіпіі К-8 пов’язана з активацією природної нафтоокиснюваль-ної мікрофлори ПАР. Так, контроль природної мікрофлори води, проведений упродовж експерименту, показав збільшення загальної кількості мікроорганізмів (навіть на порядки) в усіх зразках, оброблених препаратами штаму К-8 (зокрема й суспензією клітин).
Встановлено, що ступінь очищення забрудненого ґрунту (20 г/кг ґрунту) після оброблення препаратами ПАР N. ьассіпіі К-8 у вигляді супернатанта і нативної культу-ральної рідини в концентрації 100-300 мл/кг ґрунту на 30-ту добу спостереження становив 55-85% (табл. 4).
Наступні експерименти показали, що нативній культуральній рідині N. ьассіпіі К-8 притаманні високі нафтовідмивальні властивості. Так, за присутності препаратів ПАР N. ьассіпіі К-8 (30 мл) відмивання піску від нафти (0,1 мл нафти/1 г піску) становило 90%.
Позаклітинні метаболіти представників роду Nocardia багато науковців розглядають як альтернативу синтетичним антимікроб-
Рис. 4. Схема установки для очищення води від нафтопродуктів іммобілізованими мікроорганізмами:
1 — колонка з керамзитом; 2 — перистальтичний насос; 3 — колба із забрудненою водою; 4 — колба з очищеною водою; 5 — мікрокомпресор
Таблиця 4. Ступінь деструкції нафти у ґрунті ПАР N. vaccinii К-8
ПАР Концентрація ПАР, мл/кг ґрунту Концентрація залишкової нафти в пробі, г/кг ґрунту Ступінь деструкції нафти, %
Культуральна рідина 100 5,3 ± 0,16 74 ± 2,3
200 5,9 ± 0,18 71 ± 2,1
300 3,4 ± 0,10 83,5 ± 2,5
Супернатант 100 9,2 ± 0,28 55 ± 1,7
200 7,9 ± 0,24 61,2 ± 1,8
300 5,6 ± 0,17 72,7 ± 2,2
Контроль 0 20,4 ± 0,32 0
Контроль
Рис. 5. Зміна структури нафтової плівки після оброблення суспензією клітин N. vaccinii К-8
ним препаратам [15-17, 19-21, 22-24, 26-29, 33, 36, 37, 39]. Наші експерименти показали, що за присутності ПАР N. vaccinii K-8 (0,085-0,85 мг/мл) кількість клітин фітопатогенних бактерій Pectobacterium carotovorum УКМ В-1095, Pseudomonas syringae pv. coronafaciens УКМ В-1154, Pseudomonas syringae УКМ В-1027, Pseudomonas corrugate 9070, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens УКМ В-1015, Pseudomonas savastanoi pv. glycinea 8571, Xanthomonas campestris pv. campestris УКМ В-1049, Xanthomonas vesicatoria 7790, Xanthomonas translucens pv. translucens 7696 зменшувалась на 80-98%. Слід зазначити, що не тільки ПАР штаму К-8, а й іншим позаклітинним метаболітам, що містяться у водній фазі після екстракції ПАР сумішшю метанолу і хлороформу, притаманні антимікробні властивості. Причому в цьому разі спостерігали 100%-ну загибель усіх досліджуваних фітопатогенних бактерій.
Таким чином, дані літератури і результати експериментів авторів свідчать про можливість використання бактерій роду
Иосагйіа для деструкції аліфатичних, ароматичних та гетероциклічних ксенобіотиків, таких як лінійні алкани (С12-С16), н-октан, пентадеканол, ейкозан (С20), октакозан (С28), гексатриаконтан (С36), пристан, октил-бензен, фенатрен, антрацен, фенол, нітро-бензен, 3-нітронафтален, 3-нітробіфеніл, 4-нітрофенол, піридин, а-піколін тощо.
За допомогою клітин нокардій та їхніх ензиматичних систем можуть бути здійснені процеси біотрансформації ізофлавоноїду фор-монетину у даїдзен та 3',4',7-тригідроксіізоф-лавон, цис-епоксисукцинату в Ь(+)-тартарову кислоту, 3-ціанопіридину в нікотинову кислоту, а також дерацемізація ібупрофену.
Представники роду Иосатйіа також є продуцентами ПАР та низки сполук з антимікробною і цитотоксичною дією щодо клітин злоякісних пухлин (бразилі-бактин А, нокарацин А, В, С, бразиліхінон Б, наргеніцин Аг тощо). Отримані результати свідчать про наявність у бактерій цього роду значного біотехнологічного потенціалу, що уможливлює використання їх у промисловості, екологічній та медичній галузях.
ЛІТЕРАТУРА
1. Webley D. M., Duff R. B., Farmer V. C. Evidence for p-oxidation in the metabolism of saturated aliphatic hydrocarbons by soil species of Nocardia // Nature. — 1956. — V. 178. — P.1467-1468.
2. Розанова Е. П. Использование углеводородов микроорганизмами // Успехи микро-биол. — 1967. — № 4. — С. 61-96.
3. Cain R. B. The microbial metabolism of nitro-aromatic compounds // J. Gen. Microbiol. — 1958. — V. 19, N 1. — P. 1-14.
4. Norris D. B., Trudgill P. W. The purification and properties of cyclohexanone oxygenase from Nocardia globerula CL 1 // Biochem. J. — 1972. — V. 130, N 1. — P 30.
5. Sariaslani F. S., Harper D. B., Higgins I. J. Microbial degradation of hydrocarbons. Catabolism of 1-phenylalkanes by Nocardia salmonicolor // Ibid. — 1974. — V. 140, N 1. — P. 31-45.
6. Cox D. P., Goldsmith C. D. Microbial conversion of ethylbenzene to 1-phenethanol and ace-tophenone by Nocardia tartaricans ATCC 31190 // Appl. Environ. Microbiol. — 1979. — V. 38, N 3. — P. 514-520.
7. Celmer W. D., Chmurny G. N., Moppett C. E. et al. Structure of natural antibiotic CP-47,444 // J. Am. Chem. Soc. — 1980. — V. 102, N 12. — P. 4203-4209.
8. Нестеренко О. А., Квасников Е. И., Ногина Т. М. Нокардиоподобные и коринепо-добные бактерии. — К.: Наук. думка, 1985. — 336 с.
9. Orchard V. The ecology of Nocardia and related taxa / Actynomycetes. Stuttgard. — New York: Fisher, 1981. — P. 167-180.
10. Yassin A. F., Straubler B., Schumann P. et al. Nocardia puris sp. Nov // Int. J. Syst. Bacteriol. — 2003. — V. 53, N5. — P. 1595-1599.
11. Ali N., Dashti N., Al-Mailem D. et al. Indigenous soil bacteria with the combined potential for hydrocarbon consumption and heavy metal resistance // Environ. Sci. Pollut. Res. Int. — 2012. — V. 19, N 3. — P. 812-820.
12. Bhatia M., Singh D. H. Biodegradation of comercial linear alkyl benzenes by Nocardia amarae // J. Biosci. — 1996. — V. 21, N 4. — P. 487-496.
13. Choi K.-Y., Park H.-Y., Kim B.-G. Characterization of bi-functional CYP154 from Nocardia farcinica IFM10152 in the O-deal-kylationand ortho-hydroxylation of formo-nonetin // Enz. Microb. Technol. — 2010. — V. 47, N 7. — P. 327-334.
14. De Pasquale C., Palazzolo E., Lo Piccolo L. et al. Degradation of long-chain n-alkanes in soil microcosms by two actinobacteria // J. Environ. Sci. Health. A. Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. — 2012. — V. 47, N 3. — P. 374-381.
15. El-Gendy M. M.A., Hawas W. U., Jaspars M. Novel bioactive metabolites from a marine derived bacterium Nocardia sp. ALAA 2000 // J. Antibiot. — 2008. — V. 61, N 6. — P. 379-386.
16. El-Sersy N. A., Abou-Elela M. G. Antagonistic effect of marine Nocardia brasiliensis against the sh pathogen Vibrio damsela: Ap pli cation of Plackett-Burman experimental design to evaluate factors affecting the production of the antibacterial agent // Int. J. Oceans Oceanogr. — 2006. — V. 1, N 1. — P. 141-150.
17. Gao X., Lu Y., Xing Y. et al. A novel anticancer and antifungus phenazine derivative from a marine actinomycete BM-17 // Microbiol. Res. — 2012. — V. 167, N 10. — P. 616-622.
18. Hanne L. F., Kirk L. L., Appel S. M. et al. Degradation and induction speci city in acti-nomycetes that degrade p-nitrophenol // Appl. Environ. Microbiol. — 1993. — V. 59, N 10. — P. 3505-3508.
19. Hoshino Y., Mukai A., Yazawa K. et al. Transvalencin A, a thiazolidine zinc complex antibiotic produced by a clinical isolate of Nocardia transvalensis I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological activities
// J. Antibiot. (Tokyo). — 2004. — V. 57, N 12.— P. 797-802.
20. Hoshino Y., Mukai A., Yazawa K. et al. Transvalencin A, a thiazolidine zinc complex antibiotic produced by a clinical isolate of Nocardia transvalensis II. Structure elucidation // Ibid (Tokyo). — 2004. — V. 57, N 12. — P.803-807.
21. Imai T., Yazawa K., Tanaka Y. et al. Productivity of antimicrobial substances in pathogenic actinomycetes Nocardia brasiliensis // Microbiol. Cult. Coll. — 1997. — V. 13. — P. 103-108.
22. Kavitha A., Prabhakar P., Vijayalakshmi M. et al. Production of bioactive metabolites by Nocardia levis MK-VL 113// Lett. Appl. Microbiol. — 2009. — V. 49, N 4. — P. 484-490.
23. Leet J. E., Li W., Ax H.A. et al. Nocathiacins, new thiazolyl peptide antibiotics from Nocardia sp.II. Isolation, characterization,and structure determination // J. Antibiot. (Tokyo). — 2003. — V. 56, N 3. — P. 232-242.
24. Li W., Left J. E., Ax H.A. et al. Nocathiacins, new thiazolyl peptide antibiotics from Nocardia sp. I. Taxonomy, fermentation and biological activities // Ibid (Tokyo). — 2003. — V. 56, N 3. — P. 226-231.
25. Lievano R., Purez H. I., Manjarrez N. et al. Hydrolysis of ibuprofen nitrile and ibupro-fen amide and deracemisation of ibuprofen using Nocardia corallina B-276 // Molecules. — 2012. — V. 17, N 3. — P. 3148-3154.
26. Maharjan S., Koju D., Lee H. C. et al. Metabolic engineering of Nocardia sp. CS682 for enhanced production of nargenicin A1 // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2012. — V. 166, N 3. — P. 805-817.
27. Maharjan S., Aryal N., Bhattarai S. et al. Biosynthesis of the nargenicin A1 pyrrole moiety from Nocardia sp. CS682 // Ibid. — 2012. — V. 93, N 2. — P. 687-696.
28. Mikami Y. Biological work on medically important Nocardia species // Actinomyce-tologica. — 2007. — V. 21. — P. 46-51.
29. Mukai A., Fukai T., Hoshino Ya. et al. Nocardithiocin, a novel thiopeptide antibiotic, produced by pathogenic Nocardia pseu-dobrasiliensis IFM 0757 // J. Antibiot. — 2009. — V. 62, N 11. — P. 613-619.
30. Nhi-Cong L. T., Mikolasch A., Awe S. et al. Oxidation of aliphatic, branched chain, and aromatic hydrocarbons by Nocardia cyriaci-georgica isolated from oil-polluted sand samples collected in the Saudi Arabian Desert // J. Bas. Microbiol. — 2010. — V.
50, N 3. — P. 241-253.
31. Padoley K. V., Mudliar S. N., Pandey R. A. Microbial degradation of pyridine and a-picoline using a strain of the genera Pseudo -monas and Nocardia sp. // Bioproc. Bios. Eng. — 2009. — V. 32, N 4. — P. 501-510.
32. Quatrini P., Scaglionel G., De Pasquale C. et al. Isolation of Gram-positive n-alkane degraders from a hydrocarbon-contaminated Mediterranean shoreline // J. Appl. Microbiol. — 2008. — V. 104, N 1. — P. 251-259.
33. Seung H. K., Yoo J. C., Kim T. S. Nargenicin enhances 1,25-dihydroxyvitamin D3- and all-trans retinoic acid-induced leukemia cell differentiation via PKCbI/MAPK pathways // Biochem. Pharmacol. — 2009. — V. 77, N 11. — P. 1694-1701.
34. Sharma N. N., Sharma M., Bhalla T. C. An improved nitrilase-mediated bioprocess for synthesis of nicotinic acid from 3-cyanopyri-dine with hyperinduced Nocardia globerula NHB-2 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. —
2011. — V. 38, N 9. — P. 1235-1243.
35. Shetty K. V., Verma D. K., Srinikethan G. Modelling and simulation of steady-state phenol degradation in a pulsed plate bioreactor with immobilized cells of Nocardia hydrocarbono-xydans // Bioproc. Bios. Eng. — 2011. — V. 34, N 1. — P. 45-56.
36. Tsuda M., Nemoto A., Komaki H. et al. Nocarasins A-C and brasiliquinone D, new metabolites from the actinomycete Nocardia brasiliensis // J. Nat. Prod. — 1999. — V. 62, N 7. — P. 1640-1642.
37. Tsuda M., Yamakawa M., Oka S. et al. Brasi-libactin A, a cytotoxic compound from acti-nomycete Nocardia brasiliensis // Ibid. — 2005. — V. 68, N 3. — P. 462-464.
38. Vasu V., Kumaresan J., Babu M. G. et al. Active site analysis of cis-epoxysuccinate hydrolase from Nocardia tartaricans using homology modeling and site-directed mutagenesis // Appl. Microbiol. Biotechnol. —
2012. — V. 93, N 6. — P. 2377-2386.
39. Wyche T. P., Hou Y., Vazquez-Rivera E. et al. Peptidolipins B-F, antibacterial lipopeptides from an ascidian-derived Nocardia sp. // J. Nat. Prod. — 2012. — V. 75, N 4. — P. 735-740.
40. Zeinali M., Vossough M., Ardestani S. K. Characterization of a moderate thermophilic Nocardia species able to grow on polycyclic aromatic hydrocarbons // Lett. Appl. Microbiol. — 2007. — V. 45, N 6. — P. 622-628.
41. Chikere C. B., Chikere B. O., Okpokwasili G. C. Bioreactor-based bioremediation of hydrocarbon-polluted Niger Delta marine sediment, Nigeria // 3 Biotech. — 2012. — V. 2, N 1. — P. 53-66.
42. Bouchez N. M., Rakatozafy H., Marchal R. et al. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of substrate uptake // J. Appl. Microbiol. — 1999. — V. 86, N 3. — P. 421-428.
43. Coimbra C. D., Ru no R. D., Luna J. M. et al. Studies of the cell surface properties of Candida species and relation to the producti-
on of biosurfactants for environmental applications // Curr. Microbiol. — 2009. — V. 58,N 3.— P. 245-251.
44. Kaiser J. P., Feng Y., Bollag J. M. Microbial metabolism of pyridine, quinoline, acridine and their derivatives under aerobic and anaerobic conditions // Microbiol. Rev. — 1996. — V. 60, N 3. — P. 483-498.
45. Kaiser J. P., Feng Y., Bollag J. M. Microbial metabolism of pyridine, quinoline, acridine and their derivatives under aerobic and anaerobic conditions // Ibid. — 1996. — V. 60, N 3. — P. 483-498.
46. Rhee S. K., Lee K. Y., Chung J. C. et al. Degradation of pyridine of Nocardioides sp. strain OS4 isolated from the oxic zone of a spent shale column // Can. J. Microbiol. — 1997. — V. 43, N 1-3. — P. 205-209.
47. Kim S.H., Lim E.J., Lee S.O. et al. Puri cation and characterization of biosurfactants from Nocardia sp. L-417 // Biotechnol. Appl. Bio-chem. — 2000. — V. 31, N 3. — P. 249-253.
48. Hayakawa M. Studies on the isolation and distribution of rare actinomycetes in soil // Actinomycetologica. — 2008. — V. 22, N 1. — P. 12-19.
49. Banat I., Franzetti A., Gandolfi I. et al. Mic -robial biosurfactants production, applications and future potential // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2010. V. 87, N 2. — P. 427-444.
50. Пирог Т. П., Шевчук Т. А., Волошина И. Н. и др. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикл. биохим. микробиол. — 2005. — Т. 41, № 1. — С. 58-63.
51. Пирог Т. П., Ігнатенко С. В. Мікробні поверхнево-активні речовини: проблеми промислового виробництва // Біотехноло-гія. — 2008. — Т. 1, № 4. — С. 29-38.
52. Пирог Т. П., Гриценко Н. А., Хомяк Д. И. и др. Оптимизация синтеза поверхностноактивных веществ Nocardia vaccinii K-8 при биоконверсии отходов производства биодизеля // Микробиол. журнал. — 2011. — Т. 73, № 4. — С. 15-24.
53. Ciesielski S., Pokoj T., Klimiuk E. Cultiva -tion-dependent and independent characterization of microbial community producing polyhydroxyalkanoates from raw glycerol // J. Microbiol. Biotechnol. — 2010. V. 20, N5. — P. 853 861.
54. Da Silva G., Mack M., Contiero J. Glycerol: A promising and abundant carbon source for industrial microbiology // Biotechnol. Adv. — 2009. — V. 27, N 1. — P. 30-39.
55. Yazdani S., Gonzalez R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic viability for the biofuels industry // Curr. Opin. Bio-technol. — 2007. — V. 18, N 3. — P. 213-219.
БАКТЕРИИ РОДА NOCАRDIA КАК ОБЪЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Т. П. Пирог, Д. И. Хомяк, Н. А. Гриценко,
А П. Софилканич, А. Д. Конон, К. А. Покора
Национальный университет пищевых технологий, Киев, Украина
E-mail: [email protected]
Приведены данные литературы и результаты осуществленных авторами экспериментов о биотехнологическом потенциале бактерий рода Nocardia. Рассмотрено использование этих микроорганизмов как деструкторов алифатических (октан, пентадеканол, эйкозан, октакозан, гексатриаконтан, пристан), ароматических (фенол, октилбензен, фенатрен, антрацен), нитроароматических (4-нитрофенол), гетероциклических (пиридин, а-пиколин) углеводородов. Показаны перспективы использования нокардий в процессах биотрансформации веществ (образование даидзена, ибупрофе-на, никотиновой кислоты) и синтеза некоторых применяемых на практике метаболитов, в частности антимикробных и цитотоксических веществ (аямицин, трансвалецин А, нокатио-цин, бразилибактин А, нокарацины и др.), а также веществ с поверхностно-активными и эмульгирующими свойствами.
Обобщены экспериментальные результаты относительно оптимизации условий культивирования изолированного из загрязненной нефтью почвы штамма нефтеокисляющих бактерий Nocardia vaccinii K-8 и интенсификации синтеза поверхностно-активных веществ на глицероле — побочном продукте производства биодизеля. Установлена способность штамма К-8 ассимилировать некоторые ароматические соединения (фенол, бензол, толуол, нафталин, гексахлорбензол, сульфаниловая и N-фени-лантраниловая кислоты, 0,3-0,5%). Показано, что через 30 сут максимальная степень деструкции (94-98%) нефти (2,6 г/л) в воде наблюдалась при обработке суспензией клеток N. vaccinii K-8 (9,8107 КОЕ/мл), в то время как для очистки загрязненной нефтью почвы (20 г/кг) эффективным оказался препарат поверхностно-активных веществ (100-300 мл/кг) в виде постферментационной культуральной жидкости (деструкция 74-83% нефти). Установлено, что поверхностно-активные вещества (0,085-0,85 мг/мл) и другие внеклеточные метаболиты штамма К-8 проявляют антимикробное действие против ряда фитопатогенных бактерий родов Pseudomonas и Xanthomonas, количество которых в присутствии исследуемых препаратов снижалось на 80-100%.
Ключевые слова: бактерии рода Nocardia, деградация нефтяных загрязнений, биотрансформация, антибиотики, поверхностно-активные вещества.
BACTERIA OF NOCАRDIA GENUS AS OBJECT OF BIOTECHNOLOGY
T. P. Pirog, D. I. Khomyak, N. A. Grytsenko,
A. P. Sofilkanych, А. D. Konon, K. A. Pokora
National University of Food Technologies, Kyiv, Ukraine
E-mail: [email protected]
The literature and own experimental data, concerning biotechnological potential of bacteria of Nocаrdia genus are given. The use of these microorganisms as destructors of aliphatic (octane, pentadecanol, eicosane, octacosane, hexatria-contane, pristane), aromatic (phenol, octylben-zene, phenanthrene, anthracene), nitroaromatic (4-nitrophenol), heterocyclic (pyridine, a-picoline) hydrocarbons is described. The prospects of use of Nocаrdia in processes of substances bio-transformation (production of daidzein, ibuprofen, nicotinic acid) and synthesis of some valuable metabolites, in particular antimicrobial and cytotoxic substances (ayamycin, transvalencin А, nocathiacin, brasilibactin A, nocaracins etc.) as well as substances with surface-active and emulsifying properties are discussed.
The own experimental data concerning optimization of cultivation conditions and intensification of surfactant synthesis on glycerol (byproduct of biodiesel production) by oil oxidizing bacteria strain Nocardia vaccinii K-8, that was isolated from oil polluted samples of soil are presented. The ability of strain K-8 to assimilate some aromatic compounds (phenol, benzene, toluene, naphthalene, hexachlorbenzene, sulfa-nilic acid and N-phenylanthranilic acid, 0.3-0.5%) was determined. It was shown that the highest oil destruction degree (94-98%) in polluted water (2.6 g/L) was achieved in the case of treatment with suspension of N. vaccinii K-8 cells (9.8x107 CFU/mL) after 30 days, while surfactant preparation of post fermentative cultural liquid (100-300 mL/kg) was more effective for remediation (destruction of 74-83% of oil) of oil polluted soil (20 g/kg). It was determined that surfactants (0.085-0.85 mg/mL) and other exocellular metabolites of strain К-8 possess antimicrobial activity against some phytopathogen bacteria of Pseudomonas and Xanthomonas strains. In this connection the quantity of living cells decreased by 80-100% after the treatment with the investigated preparations.
Key words: bacteria of Nocаrdia genus, destruction of oil pollution, biotransformation, antibiotics, surfactants.
