CC BY
104
Учредители:
Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН
(электронный журнал)
2012 * № 1
Оп-ііпе версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© Коллектив авторов, 2012 УДК 582.26
Н.В. Немцева, Е.А. Селиванова, Т.Н. Яценко-Степанова, М.Е. Игнатенко
ИЗУЧЕНИЕ АЛЬГОПЛАНКТОНА ВОДОЕМОВ С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ СОЛЕНОСТИ И ПОИСК НОВЫХ ШТАММОВ ВОДОРОСЛЕЙ ПРОДУЦЕНТОВ -БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Оренбург, Россия
Показано, что основу флористического разнообразия водорослей Соль-Илецких озер составляют отделы Chlorophyta, Cyanophyta и Bacillariophyta, являющиеся наиболее устойчивыми к засолению. На изменение численности альгопланктона большое влияние наряду с абиотическими факторами оказывают межвидовые конкурентные взаимоотношения и взаимоотношения в системе «хищник-жертва», складывающиеся между зоопланктоном и водорослями. Разработана схема выделения водоросли Dunaliella salina в культуре и оценен биотехнологический потенциал выделенного штамма.
Ключевые слова: альгопланктон, видовое богатство, динамика, доминантные виды, Dunaliella salina, штамм-продуцент.
N.V. Nemtseva, E.A. Selivanova, T.N. Yatsenko-Stepanova, M.E. Ignatenko
THE STUDY OF ALGAE PLANKTON АЛЬГОПЛАНКТОНА RESERVOIRS WITH DIFFERENT SALINITY LEVELS AND SEARCH FOR NEW STRAINS OF ALGAE -PRODUCERS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES
Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis UrB RAS, Orenburg, Russia
The main orders of algae diversity are Chlorophyta, Cyanophyta, Bacillariophyta in Salt-Iletsk' Lakes, because they are the most stable to increased salinity. The changes in the number of algae depend of abiotic factors, competitive relationships and "predator-prey" interspecific relationships between zooplankton and algae. The scheme of isolation of the algae Dunaliella salina was developed and high biotechnological capacity of this strain was shown.
Key words: algoplankton, species richness, dynamics, dominant species, Dunaliella sa-lina, strain-producer.
Введение
Высокоминерализованные водоемы привлекают внимание исследователей не только в плане оценки особенностей биоценотических взаимоотношений биоты, но как источники новых биотехнологически перспективных штаммов микроорганизмов с высоким адаптивным потенциалом. Многие исследователи сходятся во мнении о высокой ценности экзометаболитов микробного происхождения, являющихся биологически активными веществами, не только принимающих участие в формировании биоценотических связей в природных сообществах водоемов, но и играющих значительную роль в
жизнедеятельности человека [10, 4]. Некоторые одноклеточные зеленые водоросли, благодаря своей способности продуцировать метаболиты с ценными свойствами, в настоящее время уже используются в практике [15, 18].
На территории Оренбургской области находятся Соль-Илецкие озера, представляющие собой группу соленых континентальных водоемов, расположенных над поверхностью месторождения поваренной соли, возникшего в результате пересыхания древнего первичного океана. Эти озера активно используются в бальнеологических целях, тогда как в качестве объекта биотехнологического поиска их биоценозы изучены недостаточно [8].
В связи с вышеизложенным, целью работы явилось изучение видового разнообразия, структуры и динамики альгопланктона Соль-Илецких озер, различающихся по уровню солености, и отбор культур водорослей продуцентов биологически активных веществ.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили планктонные пробы из оз. Развал, Дунино, Малое Городское (Соль-Илецкий район, Оренбургская область) в течение 2004-2007 гг. Вода всех исследованных водоемов относится к хлоридно-натриевому типу. Озеро Развал - водоем техно-карстового происхождения. Среднегодовая глубина составляет 15 м. Характеризуется высоким содержанием солей, преимущественно хлорида натрия, вплоть до формирования насыщенного и пересыщенного раствора. Озеро Дунино карстового происхождения, его отличительной гидрохимической особенностью является высокая соленость, достигающая 170 г/л, и значительное содержание магния и кальция. Жесткость воды в данном озере на порядок выше, чем в остальных. Глубина озера - 13 м. Озеро Малое Городское, максимальная глубина которого достигает 15 м, имеет карстовое происхождение. Общее содержание солей находиться в пределах 10-26 г/л. Кривые сезонных колебаний уровня солености в поверхностных слоях вод данных водоемов сходны и характеризуются летним нарастанием и снижением в холодное время года.
Поверхностные пробы воды отбирали с помощью батометра Руттнера с глубины 50 см. После фиксации формалином пробы концентрировали седи-ментационным методом до конечного объема 10 мл [7]. Численность водорослей определяли путем подсчета в камере Нажотта при световой микроскопии (микроскоп Axsiostar plus. Carl Zeiss). Идентификацию водорослей
проводили в соответствии с определителями [6, 9, 12, 19]. При оценке структуры альгоценозов каждого водоема учитывали: число видов, и их встречаемость. Доминирование водорослей оценивали с учетом их встречаемости и численности, в соответствии с индексом Палия-Ковнацки [14].
Лабораторное культивирование водорослевой культуры Dunaliella salina осуществляли с использованием соответствующих сред ОПС, Ben-Amotz и стерильной природной воды с добавлением нитратов и фосфатов. Водоросли культивировали при температуре +20.. .+25°С в непрерывном режиме освещения люминесцентными лампами (5000 лк) с ежедневным перемешиванием в течение 16 ч. Пересевы осуществляли с периодичностью 1 раз в 2 месяца. Антиоксидантную активность клеточного экстракта водоросли Dunaliella salina определяли в соответствии с методикой, предложенной Р.Р. Фахрутдиновым [13]. Антиоксидантные свойства клеточного экстракта водоросли D. salina оценивали по его способности тормозить процессы перекис-ного окисления липидов, о скорости которых судили по интенсивности хе-милюминесценции, с помощью хемилюминомера ХЛ-003. Антагонистическую активность экстрактов исследуемых микроорганизмов определяли фотометрическим методом [2].
Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью Exel 7,0 for Windows XP.
Результаты и обсуждение
В исследованных водоемах за весь период наблюдения обнаружено 50 видов водорослей, относящихся к 7 отделам. Наиболее часто встречались водоросли отдела Chlorophyta (38 %). Это объясняется присутствием в данном таксоне широко распространенных галофильных видов водорослей рода Dunaliella. Реже обнаруживали представителей отделов Cyanophyta, Bacillariophyta, Dinophyta, Cryptophyta и Euglenophyta: 25%, 24 %, 6 %, 4 % и 3 %, соответственно. Золотистые водоросли встречались эпизодически, что свидетельствует об их низкой приспособленности к условиям нарастающей минерализации.
Только представители двух отделов Chlorophyta и Bacillariophyta встречались во всех исследуемых озерах, что объясняется их широкой экологической валентностью, способствующей выживанию в условиях широкого диапазона солености, с одной стороны, и поступлением с прилегающих тер-
риторий в результате почвенных привносов, с другой.
В солоноватых и соленых водоемах наиболее разнообразно были представлены отделы Cyanophyta и Chlorophyta. Меньшим видовым разнообразием отличался отдел Bacillariophyta, влючавший 10 видов. Отделы Euglenophyta и Dinophyta насчитывали по 3 вида. Отделы Cryptophyta и Chrysophyta были представлены лишь одним видом.
Видовое и таксономическое богатство альгопланктона снижалось по мере увеличения солености водоема. В озере Малое Г ородское обнаруживали, в среднем, 13 видов в одной пробе. Менее богатым по сравнению с предыдущим водоемом оказалось озеро Дунино, здесь, в среднем в одной пробе, обнаруживали 5 видов, принадлежащих 3 отделам: Chlorophyta, Cyanophyta и Bacillariophyta. Озеро Развал характеризовалось наименьшим видовым богатством водорослей, в среднем 2 вида в одной пробе, относящихся к отделам Chlorophyta и Bacillariophyta.
Таким образом, таксономическое и видовое богатство водорослей, находясь в обратной зависимости от уровня солености, убывало в ряду Малое Городское > Дунино > Развал. Полученные данные демонстрируют лимитирующее влияние среды, что согласуется с данными других исследователей для ряда аналогичных водоемов [16, 21]. По мере снижения солености в исследуемых водоемах наиболее интенсивно увеличивалось разнообразие сине-зеленых и диатомовых водорослей, являющихся типичными морскими формами. Подобное явление характерно и для других соленых водоемов [3].
Отмечены различия в сезонной динамике видового богатства водорослей в Соль-Илецких озерах (рис. 1).
В озере Малое Городское число видов зарегистрированных летнеосенний период было в 4 раза больше, чем зимой и весной, что закономерно связано с изменением светового и температурного режимов. Видовое богатство достигало в этом озере максимума к сентябрю (рис. 1). В озере Дунино кривая количества видов водорослей достигала максимума к первой половине лета с последующим снижением до 1-4 видов в пробе в августе. С учетом совпадающего по времени нарастания минерализации полученные данные демонстрируют не только влияние света и температуры, но и действие уровня солености. Видовое богатство озера Развал отличалось наименьшим раз-
нообразием, что определялось лимитирующими условиями экстремальной солености. Отмечено незначительное увеличение количества видов за счет появления диатомовых водорослей, которое здесь регистрировали весной, во время сильного разбавления рапы ливневыми и паводковыми стоками.
■ оз. Развал ■ оз. Дунино Поз. М.Городское
Рис. 1. Сезонная динамика видового богатства водорослей в Соль-Илецких озерах.
Сезонная динамика численности водорослей каждого из обследованных водоемов характеризовалась индивидуальными особенностями. Так, в солоноватом озере Малое Г ородское отмечено нарастание численности водорослей с наступлением весны с последующей стабилизацией в летний период и «скачок» численности до уровня «цветения» в сентябре. Для озера Дунино была характерна другая закономерность: численность водорослей увеличивалась зимой и весной, а в летние месяцы уменьшалась, что, вероятно, связано с активным «выеданием» водорослей жаброногими рачками Artemia salina, активно развивавшимися в этот период. Наблюдаемая нами картина согласуется с экспериментальными данными, свидетельствующими о способности Artemia salina быстро снижать биомассу фитопланктона [17]. В ги-пергалинном озере Развал, где из-за высокой концентрации соли отсутствовали альгофаги, способные ограничивать численность водорослей, летом на-
блюдалось массовое развитие водорослей, тогда как зимой количество водорослей плавно снижалось, достигая минимальных значений весной.
Таким образом, была выявлена зависимость динамики численности водорослей от сезона и солености воды. Самая высокая численность альго-
о
планктона - 6,0*10 клеток/л была зарегистрирована в озере с наименьшей соленостью - Малом Г ородском, тогда как минимальная - в озере Развал -5,6*106 клеток/л.
Каждое озеро характеризовалось специфическим составом доминирующих видов водорослей, определяющих уникальность сообщества. В соответствии с индексом Палия-Ковнацки, к доминирующим видам в озере Развал были отнесены Dunaliella salina и Dunaliella viridis. Для озера Дунино D. viridis оказалась доминантом, а D. salina - субдоминантом, остальные виды вошли в группу сопутствующих. В озере Малое Городское 3 вида: OscШatoria suЫШssma, Prorocentrum Бр., Carteria salina были отнесены к доминирующим, а остальные виды - к сопутсвующим.
Отмечено, что в гипергалинных водоемах структура альгосообщества более стабильна, по сравнению с мезогалинным озером Малое Городское, где доминирующие комплексы значительно изменялись в течение года. В Малом Городском доминирующими по численности водорослями зимой оказались Chlamydomonas Бр. (СЫогорЬу1а) и Synechocystis salina Wisl. (СуапорИу1а), составившие 70 и 25 % соответственно от общего количества, весной доминировали Carteria salina Wisl. (СЫогорИуа) - 63 % и OscШatoria suЫШssma К^. (СуапорИуа) - 23 %. В первой половине лета наблюдалось цветение водорослей Prorocentrum Бр. (Dinophyta), доля которых составила 78,5 %, а в августе и с наступлением осени в массовом количестве развивались сине-зеленые водоросли OscШatoria suЫШssma К^. (74-95,5 %). В целом, видовой состав альгопланктона в Соль-Илецких озерах сходен с солеными и солоноватыми водоемами других территорий [3].
В озере Развал водоросли рода Dunaliella были представлены двумя видами: D. salina и D. viridis. Летом преобладала D. salina, а к осени увеличивалась численность D. viridis, достигая 40%, подобное соотношение сохранялось зимой. Весной при общем снижении численности водорослей, отмечалось преобладание D. viridis. Являясь постоянным обитателем озера Развал, D. salina периодически летом (июль-август) давала вспышки массового
развития, когда численность достигала 11,8х106 клеток/л, вызывая «цветение» воды, приобретающей бурый оттенок.
Оценка сезонной динамики численности двух видов водорослей рода Dunaliella в оз. Развал показала, что при снижении солености наблюдалось преимущественное развитии D. viridis, тогда как в условиях большей солености преобладали водоросли D. salina, что свидетельствует об антагонистических взаимоотношениях этих видов. Факт конкуренции между данными видами доказан экспериментально: при низкой солености D. viridis оказывает выраженное антагонистическое воздействие на D. salina [20], что следует принимать во внимание при их совместном выращивании. Поскольку водоросли Dunaliella, используются как источники ценных метаболитов, штамм
D. salina, обитающий в озере Развал, представляет практический интерес. С учетом штаммовой вариабельности биотехнологического потенциала водорослей данного вида [22] необходимо изучение каждого нового изолята.
Поэтому дальнейшее внимание было сконцентрировано на новом штамме водоросли D. salina, депонированном нами в Коллекции одноклеточных водорослей (IPPAS) под регистрационным номером IPPAS 295. Для получения чистой культуры водоросли была разработана схема выделения с учетом исходной численности клеток в образце (рис. 2).
Анализ биологических особенностей экстракта водоросли D. salina, выращенной в оптимальных условиях показал, что экстракт дуналиеллы, проявляет антиоксидантные свойства. Антиоксидантную активность экстракта дуналиеллы сравнивали с активностью препаратов «Биоастин» и Ретинол» (табл.). Добавление клеточного экстракта водоросли к стандартной хемилю-минесцентной системе снижало интенсивность свечения стандартной хеми-люминесцентной системы на 40%.
Исходя из представленных в таблице 1 результатов, уровень антиокси-дантной активности исследуемой культуры сопоставим с препаратом «Биоас-тин», содержащем вытяжку из водоросли Haematococcus pluvialis. Антиок-сидантное действие водоросли D. salina было подтверждено в эксперименте in vivo, о чем судили по снижению интенсивности процессов перекисного окисления липидов в сыворотке крови экспериментальных животных [11].
Рис. 2. Схема получения аксенических культур водорослей рода Випаїіеііа.
Таблица. Сравнительная характеристика антиоксидантной активности различных препаратов
Спонтанная Свето- Быстрая Максимальная
светимость сумма вспышка светимость
Сыворотка 0,71 4,60 0,89 1,14
Биоастин 0,37 1,53 0,37 0,37
Экстракт D. salina 0,37 1,17 0,42 0,37
Ретинол 0,22 0,73 0,42 0,36
в
При оценке межмикробных взаимодействий установлено, что по отношению к некоторым условно-патогенным бактериям живые клетки водоросли и экстракты клеток оказывали различное влияние. При сокультивирова-нии живой водоросли с E. coli графики изменения численности кишечной палочки как в опытной, так и в контрольной пробе, соответствовали S-образным кривым. Начиная с 5 ч, количество E. coli в опыте в присутствии живых клеток водоросли почти на порядок было выше, чем в контроле; такое соотношение сохранялось вплоть до 15 ч. К концу первых суток численность кишечной палочки в контроле критически падала до нуля. В ассоциации с D. salina количество E. coli сокращалось постепенно вплоть до полной гибели бактерий к 44 ч. Таким образом, период выживания бактерий в присутствии клеток дуналиеллы увеличился почти в два раза по сравнению с контролем. Наблюдаемый протективный эффект со стороны дуналиеллы по отношению к условно-патогенным бактериям можно объяснить выделением в среду живыми галофильными водорослями осмопротекторных веществ, способствующих удлинению сроков выживания негалофилов в условиях повышенной солености. Экстракт клеток D. salina оказывал противоположный эффект на
E. coli, укорачивая сроки ее выживания и способствуя более быстрой элиминации. Уже через 5 часов концентрация эшерихий снижалась почти на порядок по сравнению с контролем и на два порядка по сравнению с ассоциацией бактерий с живыми водорослями. Срок выживания E. свИ в среде с экстрактом водоросли составил 19 часов. Одновременно выявлена антагонистическая активность клеточного экстракта культуры D. salina в отношении условно-патогенных бактерий Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, выражающаяся в снижении роста этих бактериальных культур на 60 и 15%, соответственно. Ускорение очищения среды от энтеробактерий в присутствии экстракта водоросли, возможно, связано с действием бактерицидных веществ, выделяющихся в среду при разрушении клеток водорослей и, вероятно, связано с бактерицидным действием белково-хлорофилльного комплекса, обнаруженным рядом исследователей у зеленых водорослей, в том числе у водорослей родов Dunaliella и Haematococcus [5].
Полученные данные свидетельствуют в пользу практической перспективности выделенного штамма D. salina IPPAS 295, обладающего антиокси-дантной и антагонистической активностью, как в экологии для самоочище-
ния водоема, так и в медицине в качестве источника биологически активных веществ.
В результате проведенных исследований показано, что основу флористического разнообразия водорослей Соль-Илецких озер составляют отделы CЫorophyta, Cyanophyta и Bacillariophyta, являющиеся наиболее устойчивыми к засолению. Динамика видового богатства водорослей в исследуемых соленых водоемах нарастает по мере уменьшения солености. На изменение численности альгопланктона большое влияние наряду с абиотическими факторами оказывают межвидовые конкурентные отношения. Особое значение для продуктивности озер со средним и низким уровнем солености имеют взаимодействия в системе «хищник-жертва», складывающиеся между зоопланктоном и водорослями. Показано, что в гипергалинных Соль-Илецких озерах присутствует водоросль D. за/та, обладающая высоким биотехнологическим потенциалом, поддающаяся лабораторному культивированию. Разработана схема выделения и установлены оптимальные параметры поддержания данной водоросли в культуре, способствующие максимальной интенсивности роста. Разработанная технология культивирования нового штамма водоросли D. salina в совокупности с уникальными биологическими свойствами культуры определяют перспективность ее применения в биотехнологии.
Работа выполнена по гранту № 12-П-4-1039 программы Президиума РАН «Биоразнообразие» и инициативному проекту УрО РАН (№ 12-И-4-2034).
ЛИТЕРАТУРА
1. Блюмина Л.С. Биология соленых Соль-Илецких озер: Автореф. канд. биол. наук, М., 1958. 17 с.
2. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Забирова Т.М., Иванов Ю.Б. Бюлл. эксп. биол. 2000. 130 (7): 80-82.
3. Горбулин О.С., Догадина Т.В., Косик Е.Л. Водоросли техногенных соленых озер Донбасса. Вестник ХНАУ. Сер1я «Бюлопя». Харюв, 2003. 5: 80-93.
4. Ефимов А.А., Белова Т.П., Ефимова М.В. Обоснование использования синезеленых водорослей для выделения хлорофилла и фикобилипротеинов как пищевых красителей и биологически активных веществ. Успехи современного естествознания. 2007. 11: 7780.
5. Максимова И.В., Сидорова О.А. Светозависимый антибактериальный эффект водорослей и его экологическое значение (обзор). Гидробиологический журнал. 1986. 22 (6): 3-
11.
6. Масюк Н.П. Морфология, систематика, экология, географическое распространение рода ВипаМеПа Теоё. и перспективы практического использования. Киев: Наукова думка, 1973. 244 с.
7. Методика изучения биогеоценозов внутренних водоемов./ Под ред. Ф.Д. Мордухай-Болтовского. М.: Наука, 1975. 240 с.
8. Немцева Н.В., Плотников А.О., Яценко-Степанова Т.Н., Селиванова Е.А., Шабанов С.В. Планктонные сообщества уникальных гипергалинных мезогалинных озер Оренбуржья. Вестник ОГУ. 2005. 5: 35-40.
9. Определитель пресноводных водорослей СССР. Т. 1-14. / Под ред. М. М. Голлербаха. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1951-I986.
10. Сакевич А.И. Экзометаболиты пресноводных водорослей. Киев: Наук. думка. 1985. 200 с.
11. Селиванова Е.А., Немцева Н.В., Плотников А.О., Красиков С.И., Шарапова Н.В. Влияние водоросли Dunaliella salina на антиоксидантную активность сыворотки крови экспериментальных животных. Медицинская наука и образование Урала. 2011. 1: 86-88.
12. Царенко П.М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Украинской ССР. Киев: Наукова думка, 1990. 208 с.
13. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995. 54 с.
14. Шитиков В.К., Розенберг Г.С., Зинченко Т.Д. Количественная гидроэкология: методы системной идентификации. Тольятти: ИЭВБ РАН, 2003. 463 с.
15. Ben-Amotz A., Avron M. Glycerol and beta carotene metabolism in the halotolerant alga Dunaliella: A model system for biosolar energy conversion. Trends Biochem. Sci. 1981. 6: 297-299.
16. Borowitzka L.J. The microflora. Hydrobiologia. 1981. 81: 33-46.
17. Jones A.G., Ewing C.M., Melvin M.V. Biotechnology of solar saltfields. Hydrobiologia, 1981. 82: 391-406.
18. Kay R.A., Barton L.L. Microalgae as food and supplement. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1991. 30 (6): 555-573.
19. Komarek J., Anagnostidis K. Cyanoprocaryota. 1. Teil. Chroococcales. Susswasserflora Mitteleuropa. 19/1 - Jena: Ficher Verland. 1999. 548 p.
20. Moulton T.P., Sommer T.R., Burford M.A. et al. Competition between Dunaliella species at high salinity. Hydrobiologia. 1987. 151-152: 107-116.
21. Post F.J., Borowitzka L.J., Borowitzka M.A. et al. The Protozoa of a Western Australian hypersaline lagoon. Hydrobiologia. 1983. 105: 95-114.
22. Tafreshi A. H., Shariat M. Dunaliella biotechnology: methods and applications. J. of Applied Microbiology. 2009. 107: 14-35.
Поступила 11.01.2012
(Контактная информация: Немцева Наталия Вячеславовна - д.м.н., профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел/факс (3532) 77-54-17; E-mail: nemtsevanv@rambler.ru)
