CC BY
98
УДК 602.6:58
ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЮПИНА УЗКОЛИСТНОГО (Lupinus angustifolius L.) in vitro
А.А. Балакина1, Ю.В. Кунина2, А.А. Терентьев1, Е.А. Калашникова2
Лаборатория молекулярной биологии. Институт проблем химической физики РАН, Российская Федерация, 142432, г. Черноголовка, просп. Академика Семенова, 1, stasya. balakina@gmai l.com.
2 Кафедра генетики и биотехнологии. Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.
Российская федерация, 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, kalashni kova@timacad. ru.
В статье обсуждается вопрос о влиянии регуляторов роста на активность ферментов антиоксидантной системы в растениях люпина узколистного на разных этапах клонального микроразмножения. Показано присутствие 7 изоформ супероксиддисмутазы и одной изоформы каталазы в микрорастениях люпина узколистного. Установлено, что изоферментный состав супероксиддисмутазы и активность отдельных изоформ изменяются в процессе культивирования in vitro.
Ил. 3. Библиогр. 11 назв.
Ключевые слова: люпин узколистный, регуляторы роста растений, супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ), аскорбатпероксидаза (АПО), in vitro.
RESEARCH OF THE ANTIOXIDANT ENZYMES ACTIVITY AT VARIOUS IN VITRO CULTIVATION STAGES OF NARROW-LEAVED LUPIN (Lupinus angustifolius L.)
A.A. Balakina 1, Yu. V. Kunina 2, A. A. Terentev 1, E. A. Kalashnikova2
Institute of Problems of Chemical Physics RAS,
1, Ak. Semenov Ave., Chernogolovka, 142432, Russia, stasya.balakina@gmail.com.
2Russian State Agrarian University - MTAA named after K.A. Timiryaze,
49, Timiryazevskaya St., Moscow, 127550, Russia, kalashnikova@timacad.ru.
The growth regulators influence on the antioxidant enzymes activity in narrow-leaved lupin plants at different stages of clonal micropropagation is discussed. The presence of seven superoxide dismutase isoforms and of one catalase isoform in microplants was shown. It was found that the superoxide dismutase isozyme and individual isoforms activity vary during in vitro cultivation.
3 figures. 11 sources.
Keywords: narrow-leaved lupin, growth regulators, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), in vitro.
ВВЕДЕНИЕ
Растительный белок является важным источником незаменимых аминокислот для питания человека и животных. В качестве основного источника растительного белка в мировом сельском хозяйстве используется соя (Glycine max L.) благодаря сравнительно высокой урожайности и содержанию белка (до 50%) во многом аналогичного животному. Однако широкому распространению этой культуры на территории Российской Федерации препятствуют ее некоторые не достатки: теплолюбивость, требовательность к условиям возделывания, низкая устойчивость к
болезням и вредителям. Заменой сое в нашей стране может стать люпин узколистный ^^п^ angustifolius L.), содержащий в семенах до 50% белка и до 12% масла. Эта культура менее требовательна к плодородию почв и климатическим условиям, за что получила название «северная соя». Другим преимуществом люпина является более низкое по сравнению с другими зернобобовыми (в 10 раз меньше, чем у гороха, и в 100 раз меньше, чем у сои) содержание ингибиторов трипсина.
Селекционная работа направлена на получение скороспелых, низкоалкалоидных, высоко-
урожайных сортов люпина со сбалансированным аминокислотным составом, устойчивых к болезням и вредителям, а также пригодных к технологическим операциям. Однако селекционный процесс длителен по времени, поскольку наследование ряда сельскохозяйственно-ценных признаков носит полигенный характер. Одним из путей ускорения селекционного процесса является сочетание методов классической селекции с биотехнологией.
Получение новых форм люпина узколистного с использованием методов современной биотехнологии невозможно без подбора оптимальных условий клонального микроразмножения. Одной из основных проблем при получении рас-тений-регенерантов in vitro является высокая восприимчивость растений к условиям культивирования, а также экзогенным фитогормонам. В процессе клонального микроразмножения часто происходит формирование растений с нарушенной морфологией, анатомией и физиологией. Одной из причин подобных изменений является окислительный стресс, происходящий при нарушении равновесия между образованием активных форм кислорода (АФК) в клетках и их разрушением под действием антиоксидантной системы (АОС) [1, 2, 3]. Поэтому исследование взаимосвязи активности ферментов антиокси-дантной системы с морфогенезом растений и условиями их культивирования in vitro является актуальной задачей.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали сорта и образцы люпина узколистного: Ладный (РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, НПО «Подмосковье»); Деко (образец НПО «Подмосковье»); Куршавель (БелНИИЗБК); Миртан (БелНИИЗБк). Семенной материал предоставлен кафедрой селекции и семеноводства полевых культур РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева. Все питательные среды содержали макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга [4] и витамины по прописи Гамборга [5] с добавлением 0,8% агара (Bacto-Agar). Среды для индукции морфогенеза и микроразмножения содержали сахарозу в концентрации 87,64 мМ, а для укоренения в концентрации 58,43 мМ. В качестве регуляторов роста использовали 6-бензиламинопурин, 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и индолил-3-масляную кислоту (ИМК) в концентрациях от 1,13 до 6,75 мкМ. Питательные среды доводили до рН 5,7 и автоклавировали в течение 20 минут при температуре 120 0С. Растения культивировали при интенсивности света 3,000 люкс, 16-часовом фотопериоде и температуре 24 ± 1 0С. Продол-
жительность пассажа составляла 14 сут.
Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли путем измерения ингибирования фотохимического восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) с использованием модифицированного метода Beaushamp & Fridovich [6]. Поглощение образовавшегося формазана измеряли при 560 нм. За одну единицу активности супероксиддисмутазы (Ед) принимали количество фермента, необходимое для 50% ингибирования фотовосстановления НСТ.
Активность каталазы (КАТ) определяли согласно методике Aebi & Lester по снижению поглощения перекиси водорода при 240 нм [7]. Активность фермента рассчитывали с использованием коэффициента экстинции перекиси водорода (40 М-1 см-1) и выражали как мМ Н2О2/минмг белка.
Активность аскорбатпероксидазы (АПО) определяли модифицированным методом Nakano & Asada по снижению поглощения аскор-бата (АК) при 290 нм [8]. Активность фермента рассчитывали с использованием коэффициента экстинции восстановленного аскорбата (2,8 мМ-1см-1) и выражали как мкМ АК/минмг белка.
Разделение изоформ супероксиддисмутазы и каталазы проводили методом нативного электрофореза в 12% и 8% полиакриламидных гелях соответственно. Электродный буфер (рН 8,8) содержал 50 мМ Трис-HCl, 300 мМ глицина и 1,8 мМ ЭДТА. В каждую лунку наносили 100 или 50 мкг белка для идентификации СОД и 20 мкг белка для КАТ. Электрофорез проводили при температуре 4°С и 200 V в течение 2 ч.
Визуализацию изоферментов супероксид-дисмутазы проводили модифицированным методом Beaushamp & Fridovich с использованием НСТ [6]. После электрофореза гели промывали 10 мин 50 мМ РВ (рН 7,8) с добавлением 1 мМ ЭДТА, а затем выдерживали 45 мин в темноте в окрашивающем растворе, содержащем 50 мМ РВ (рН 7,8), 0,25 мМ НСТ, 28 мкМ рибофлавина, 0,2% TEMED. Затем гели промывали дистиллированной водой и освещали люминесцентной лампой в 50 мМ РВ при температуре 20-25 °С до проявления полос СОД. Идентификацию изо-форм проводили путем обработки гелей 5 мМ перекисью водорода в течение 30 мин (ингиби-рование C^Zn-СОД и Fe-СОД).
Визуализацию изоформ каталазы проводили модифицированным методом Chandlee & Scandalios (1983). После электрофореза гели промывали дистиллированной водой в течение 45 мин, а затем 10 мин обрабатывали 0,01% раствором перекиси водорода. Окрашивание гелей проводили в течение 10 мин в растворе, содержащем 1% FeCl3 и 1% K3Fe(CN)6 [9].
Рис. 1. Схема клонального микроразмножения люпина узколистного:
А - получение проростков люпина in vitro; Б - изолирование первичных эксплантов; В - индукция побегообразования из пазушных почек; Г - культивирование микропобегов в присутствии 6-БАП; Д - культивирование микропобегов в присутствии 6 -БАП и ИМК; Е - размножение мериклонов; Ж - укоренение микропобегов в присутствии ИМК; З - адаптация укоренившихся микрорастений к условиям ex vitro; И - высадка адаптированных растений в открытый или закрытый грунт
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
В результате поведенных ранее исследований нами был усовершенствован протокол клонального микроразмножения люпина узколистного, который включал в себя следующие этапы, приведенные на рис.1:
1. Получение первичных экплантов из проростков люпина. Для изолирования первичных эксплантов оптимальным является использование 3-7-ми суточных проростков люпина узколистного. Культуральная среда для получения проростков содержит ЛА концентрации макро- и микроэлементов по прописи МС, ЛА концентрации витаминов по прописи В5, 29,2 мкМ сахарозы и 0,8% агара. В качестве первичного экспланта следует использовать семядоли с сегментом зародышевой оси и пазушной почкой.
2. Индукция побегообразования из почек на первичном экспланте. Для регенерации побегов из пазушных почек оптимальной является агаризованная культуральная среда на основе макро- и микросолей среды МС, витаминов
среды В5 с добавлением 87,6 мМ сахарозы, 142 мкМ аскорбата, 1,13 мкМ кинетина или 2,25 мкМ 6-БАП в качестве регуляторов роста. Исполь-зование данного протокола обеспечивает эффективность регенерации в среднем от 87 до 93%.
3. Клональное микроразмножение. Для получения максимального коэффициента размножения микропобеги следует культивировать на питательной среде на основе макро- и микросолей среды МС, витаминов среды В5 с добавлением 87,6 мМ сахарозы, 142 мкМ аскорбата и 2,25 мкМ 6-БАП в течение одного пассажа. Чтобы избежать негативного влияния 6-БАП на морфологию побегов в течение следующих пассажей микрорастения культивируют на аналогичной культуральной среде, но с добавлением 4,5 мкМ ИМК. Такой подход обеспечивает получение от 4000 до 10 000 мериклонов с одного первичного экспланта за 6 циклов культивирования.
4. Укоренение микропобегов. Для индукции ризогенеза оптимальным является использование питательной среды, содержащей лА концентрации макроэлементов по прописи МС, микроэлементы по прописи МС, витамины по прописи В5, 142 мкМ аскорбата, 58,4 мкМ сахарозы и 4,5 мкМ ИМК.
5. Адаптация микрорастений к условиям ex vitro. Растения в течение суток следует выдержать в воде при 100% влажности воздуха, а затем перенести в автоклавированную смесь торфа и песка в соотношении 1:1. В первые две недели микрорастения выращивают в условиях 100% влажности и пониженной освещенности. После того, как у растений образуются новые листья, влажность постепенно снижают, а освещенность увеличивают. Использование такого подхода обеспечивает получение от 40 до 80% фертильных жизнеспособных растений.
Дальнейшие исследования были направлены на изучение активностей ферментов АОС на различных этапах культивирования микрорастений люпина узколистного. Для анализа были выбраны ключевые ферменты системы защиты растений от окислительного стресса: супероксиддисмутаза, каталаза и аскорбат-пероксидаза. Активность ферментов оценивали на следующих этапах: регенерация побегов, микроразмножение, индукция корнеобразования и адаптация к условиям ex vitro.
Исследования показали, что изучаемые генотипы различались по изменению активности ферментов АОС на различных этапах микроразмно-жения. Так, на этапе регенерации между исследованными генотипами отсутс -твовали существенные различия по активности каталазы; на этапе микроразмножения наибольшая активность отмечена у сорта Миртан, а в процессе укоренения наибольшую активность КАТ проявил сорт Деко. Между другими сортами существенные различия не выявлены. При адаптации микрорастений к условиям ex vitro наибольшая активность отмечена у сорта Миртан, а наименьшая у сорта Куршавель. Сорта Деко и Ладный существенно не отличались по данному показателю.
На этапе регенерации наибольшую активность АПО наблюдали у сортов Деко и Куршавель, а между сортами Миртан и Ладный существенные различия не выявлены. На этапе укоренения наоборот наименьшая активность отмечена у сортов Деко и Куршавель, а наибольшая у сортов Миртан и Ладный. При адаптации микрорастений к условиям ex vitro наименьшую активность каталазы показал сорт Куршавель, а наибольшую — сорт Миртан.
Наименьшая активность СОД на этапе микроразмножения была выявлена у сорта Миртан. На этапе укоренения наименьшую
активность СОД наблюдали у сорта Деко, а наибольшую - у сорта Ладный. В процессе адаптации наименьшая активность супероксид -дисмутазы отмечена у сорта Ладный.
У всех исследованных генотипов наименьшую активность каталазы наблюдали в процессе клонального микроразмножения при культивировании микрорастений в присутствии 6-БАП. По-видимому, такое снижение активности фермента способствует увеличению концентрации перекиси водорода в тканях экспланта.
В то же время, у исследованных сортов люпина в процессе образования побегов наблюдали максимальную активность АПО, которая, как и каталаза, участвует в разрушении Н2О2.
Снижение активности аскорбатпероксидазы, которое показано на этапе укоренения, соответствует литературным данным [10]. Ранее было доказано, что накопление перекиси водорода в тканях растений под действием ИМК является необходимым условием корнеоб-разования и осуществляется по ИМК-АПО-зависимому механизму.
Следует также отметить, что у всех исследованных генотипов при культивировании in vitro на фоне снижения активности АПО наблюдается увеличение активности КАТ и наоборот. При этом в изменении активности СОД никаких общих закономерностей не выявлено.
У сорта Миртан в процессе адаптации наблюдается увеличение активностей СОД и КАТ, а также самый высокий уровень активности АПО по сравнению с другими сортами. По-видимому, увеличение активности антиокси-дантных ферментов является следствием стресса, вызванного переносом микрорастений в условия ex vitro, поскольку у данного сорта выявлена наименьшая адаптационная способность.
Наши дальнейшие исследования были направлены на изучение изменений в изо-ферментном составе каталазы и супероксид -дисмутазы на различных этапах клонального микроразмножения люпина узколистного. В качестве объекта в экспериментах использовали сорт Куршавель.
Образцы для изоферментного анализа были получены следующим образом: регенерацию побегов из верхушечных и пазушных почек индуцировали в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП, на этапе микроразмножения растения культивировали в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК, укоренение индуцировали в присутствии 4,5 мкМ ИМК, адаптацию проводили согласно вышеописанной методике. Выделение белка из тканей растений осуществляли после 14 сут культивирования на питательной среде соответствующего состава.
При анализе изоферментного состава каталазы на всех этапах культивирования в листьях люпина узколистного выявлена одна изоформа, что соответствует литературным данным [11].
Наименьшую активность изоформы КАТ1 наблюдали на этапе микроразмножения (рис. 2). Полученные нами данные, согласуются с проведенными ранее исследованиями активности каталазы в растениях сорта Куршавель.
Анализ белковых профилей выявил 7 изоформ супероксиддисмутазы, что соответствует полученным нами ранее данным. Однако, на различных этапах культивирования изоферментный состав СОД изменялся. Например, в листьях регенерантов и побегов на этапе микроразмножения выявлены только 4 изоформы: 1, 3, 6 и 7. При пересадке микрорастений на культуральную среду для укоренения наблюдали появление дополнительной изоформы Мп-СОД (изоформа 2). У растений после адаптации показано присутствие 6 изоформ: 2, 3, 4, 5, 6 и 7 (рис. 3).
Различия в изоферментном составе и активности СОД между регенерантами, полученными из пазушных и верхушечных почек не были выявлены.
Как видно из рис. 3, активность изоформ супероксиддисмутазы изменялась в процессе кло-нального микроразмножения. Так, активность изоформы 1 (Мп-СОД) была максимальной на
12 3 4 6 6
J
Рис. 2. Изменение изоферментного состава каталазы в процессе культивирования люпина узколистного in vitro:
1 - побеги на этапе микроразмножения; 2 - побеги на первичном экспланте из пазушных почек;
3 - побеги на первичном экспланте из верхушечных почек;
4 - микрорастение на этапе укоренения; 5 - микрорастение перед адаптацией; 6 - микрорастение после адаптации
этапах микроразмножения и ризогенеза, а у укорененных растений снижалась. У адаптированных ex vitro растений данная изоформа не была обнаружена. Таким образом, можно предположить, что выявленная нами в микропобегах люпина узколистного высокая активность Mn-СОД является следствием защиты от окислительного стресса при культивировании растений в условиях in vitro. Увеличение активности Mn-СОД на этапах микроразмножения и ризогенеза, вероятно, связано с процессами морфогенеза (побего-и корнеобразование).
Изоформа Mn-СОД 2 проявила активность только на этапе ризогенеза и также обнаружена у адаптированных растений. Активность изоформы 3 увеличивается в процессе побегообразования, затем снижается при индукции ризогнеза. Максимальную активность данной изоформы наблюдали у адаптированных к условиям ex vitro микрорастений люпина. Изоформы 4 и 5 обнаружены только у адаптированных растений люпина. Изоформа 6 показала наибольшую активность в процессе культивирования микрорастений in vitro. У растений со сформированной корневой системой и у адаптированных растений к условиям ex vitro активность данной изоформы снижалась. Активность изоформы 7 существенно не изменялась в процессе культивирования микрорастений in vitro и при их последующей адаптации.
А Б В Г Д Е
Рис. 3. Изменение изоферментного состава СОД в процессе культивирования люпина узколистного in vitro:
А - побеги из пазушных почек на первичном экспланте; Б - побеги из верхушечных почек на первичном экспланте; В - побеги на этапе микроразмножения; Г - микрорастение на этапе укоренения; Д - микрорастение перед адаптацией; Е- микрорастение после адаптации; 1-7 - изоформы супероксиддисмутазы
Обнаруженные нами различия по активности и изоферментному составу СОД между сортами люпина узколистного при одинаковых условиях in vitro показывают, что реакция данных сортов на изменения условий культивирования, например, гормонального состава среды, также будет различной.
В заключении следует отметить, что существенные различия между сортами люпина в активности ферментов АОС могут обуславливать и различную их способность к побегообра-
зованию и ризогенезу в культуре in vitro. Таким образом, выявление взаимосвязи между накоплением перекиси водорода в тканях люпина, активностью ферментов АОС и морфогенными процессами может решить серьезную задачу по созданию высокоэффективных универсальных методик кло-нального микроразмножения и трансформации люпина узколистного.
1. Cutler A, Saleem M., Wang H. Cereal protoplast recalcitrance // In Vitro Cell Dev Biol. 1991. Vol. 27. P. 104-111.
2. An assessment of possible factors contributing to recalcitrance of plant protoplasts. In: Morphogenesis in plants: molecular approaches / Roubelakis-Angelakis K.A [et. al.] // New York: Plenum Publishing. 1993. P. 201-219.
3. Papadakis AK., Siminis C.I., Roubelakis-Angelakis K.A Reduced activity of antioxidant machinery is correlated with suppression of totipotency in plant protoplasts // Plant Physiol. 2001. Vol. 12. P. 434-444.
4. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant 1962. Vol.15. P. 473-497.
5. Gamborg O., Miller R., Ojima K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. // Exp. Cell Res. 1968. Vol. 50. P. 151-158.
6. Beaushamp C.O., Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and assay applicable to acrylamide gel // Anal. Biochem. 1971. Vol. 44.
СКИЙ СПИСОК
P. 276-287.
7. Aebi H., Lester P. Catalase in vitro. Meth // Ensymol. 1984. Vol. 30. P. 121-126.
8. Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts // Plant Cell Physiol. 1981. Vol. 22. P. 267-280.
9. Chandlee J.M., Scandalios J.G.. Gene expression during early kernel development in Zea mays // Dev Genet. 1983. Vol. 4. P. 99-115.
10. Li S., Xue L., Xu S., Feng H., An L. Hydrogen peroxide acts as a signal molecule in the adventitious root formation of mung bean seedlings // Environ. Exp. Bot. 2009. Vol. 65. P. 63-71.
11. Racchi M.L., Bagnoli F., Balla I., Danti S. Differential activity of catalase and superoxide dismutase in seedlings and in vitro micropropogated oak (Quercus robur L.) // Plant Cell Reports. 2001. Vol. 20. P. 169-174.
Поступило в редакцию 24 апреля 2012 г
