CC BY
53
ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИВНОЙ СПОСОБНОСТИ LISTERIA MONOCYTOGENES К ЭРИТРОЦИТАМ ЧЕЛОВЕКА И БАРАНА
Серегина Наталья Владимировна
канд. биол. наук ,доцент медицинского института Тульского Государственного
Университета, РФ, г. Тула E-mail: seregina. [email protected] Саломатина Татьяна Владимировна
студент медицинского института Тульского ГосударственногоУниверситета,
РФ, г. Тула
E-mail: tanya.salomatina. [email protected]
STUDY OF ADHESIVE ABILITY LISTERIA MONOCYTOGENES TO HUMAN
ERYTHROCYTES AND SHEEP
Seregina Natalia Vladimirovna
candidate of Biological Science, accociate professor of the medical Institute Tula State
University, Russia Tula Salomatina Tatyana Vladimirovna Medical Institute student of the Tula State University, Russia Tula
АННОТАЦИЯ
Изучено влияние биологически активных веществ, входящих в состав ацетоновой и этанольной вытяжек шунгитовой породы на адгезивную способность Listeria monocytogenes. Доказано уменьшение бактериальной адгезии под влиянием биологически-активных веществ, идентифицированных в растворах вытяжек.
ABSTRACT
The influence of biologically active substances included in the aceton and ethanol extracts of shungite rock on adhesion ability Listeria monocytogenes. Proven reduction of bacterial adhesion under the influence of biologically active substances, identified in solutions extracts.
Ключевые слова: адгезия; Listeria monocytogenes; экстракты шунгита. Keywords: adhesion; Listeria monocytogenes; extracts of shungite.
Установление взаимоотношений между бактериальным патогеном и эукариотической клеткой при формировании межклеточных контактов на ранних этапах инфекционного процесса рассматривается нами как наиболее важное звено в ходе патогенетических событий и определяет дальнейшее течение заболевания. Именно на этой стадии растворы биологически активных составляющих шунгитовой породы активно действуют на условно-патогенные бактерии рода Listeria monocytogenes. Изучение механизмов, обеспечивающих прикрепление (адгезию) бактерий к клеткам-мишеням, является эффективной предпосылкой создания профилактических антиадгезивных препаратов на основе шунгита, направленных на снижение или предотвращение колонизации тканей хозяина. Микробиологи активно изучают влияние природных биополимеров, органических и неорганических веществ, на адгезию бактерий [1, c. 34—39].
Известно, что для подавления бактериальной адгезии применяются два разных подхода. Первый связан с блокированием лигандов бактерий, второй — с блокированием рецепторов клеток хозяина. Предотвращение или снижение адгезии с помощью конкурентного ингибирования веществами, содержащими структурные аналоги адгезинов или клеточных рецепторов, является перспективным направлением в системе профилактики инфекционных заболеваний.
Цель: Изучить влияние веществ, входящих в состав вытяжек, полученных из шунгитовой породы, на адгезивную способность условно-патогенных бактерий.
Методы: в качестве тест-объектов взяты: музейный штамм Listeria monocytogenes I серогруппы ATCC 54180 и 24 клинических штамма, выделенных от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями.
Испытуемые бактерии обрабатывались ацетоновым и этанольным экстрактами органического вещества шунгитовой породы. Вытяжки были получены последовательной экстракцией обогащенной шунгитовой породы органическими растворителями с постепенно возрастающей
полярностью [7, с. 1—34]. Работа по изучению влияния растворов вытяжек шунгита на вирулентные свойства бактерий выполнена на базе Городской централизованной диагностической бактериологической лаборатории (ГЦДБЛ) при ГУЗ Городская больница № 1 города Тулы и кафедре санитарно-гигиенических и профилактических дисциплин медицинского института Тульского государственного университета. В работе использовалась клинические методы исследования, включающие микроскопические, бактериологические, статистические методы. Для изучения адгезивного процесса микроорганизмов нами были использованы методические рекомендации [4, 5, 6], а также доступная и информативная методика В.И. Брилиса, Т.А. Брилене, Х.П. Ленцнера [2, с. 210— 212]. Эритроциты можно получить в необходимых количествах, к тому же они имеют на своей поверхности гликофорин — вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезинов микробов. Эритроциты могут быть универсальной моделью для изучения адгезии. Схема исследования адгезивности бактерий включала два метода. Экспресс-метод предназначен для быстрого и одновременного определения адгезивных свойств большого числа штаммов бактерий. Это качественный метод. Развернутый предназначен для количественной оценки адгезивных свойств с помощью следующих показателей:
• СПА (средний показатель адгезии). Под ним понимается среднее количество микробов, прикрепившихся к 1 эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения. Интерпретация СПА представлена в табл. 1.
Таблица 1.
_Интерпретация среднего показателя адгезии_
Адгезивность Средний показатель адгезии
Нулевая 0—1,0
Низкая 1,01—2,0
Средняя 2,01—4,0
Высокая
Свыше 4
• К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе). Это процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы.
• ИАМ (индекс адгезивности микроорганизма). Это среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле:
Микроорганизм считают неадгезивным при ИАМ^ 1,75; низкоадгезивным — от 1,76 до 2,5; сред неадгезивным — от 2,51 до 4,0; высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.
Для чистоты эксперимента клеточным субстратом служили нативные эритроциты человека O (I) Rh (+) группы крови и эритроциты барана, так как учитавалась различная способность бактерий к адгезии. Кровь брали от здорового барана в возрасте не менее 1—5 лет в стерильный флакон с бусами и встряхивали в течение 10—15 минут для отделения фибрина, удаляли сыворотку, эритроцитарную массу центрифугировали со скоростью 1000 об/мин., эритроциты отмывали физиологическим раствором для получения прозрачного надосадка. У человека брали кровь в день постановки реакции.
Listeria monocytogenes выращивали на 5 % кровяном агаре и хромогенном селективном агаре по Оттавиани-Агости (Chromocult Listeria Selective Agar, base acc. Ottaviani and Agosti) [8, c. 74—85]. Время инкубации составляло 18—24 часа, при температуре 37 0С. Строго соблюдали температурный режим, так как при понижении температуры инкубации синтез адгезинов подавляется. Поскольку Listeria monocytogenes является психрофильным микробом, после инкубации и
роста на кровяном и хромогенном агаре в термостате, чашки с посевами помещались в холодильник, так как температура 6—8 0С усиливает адгезивные свойства листерий, что способствует более активному связыванию с эритроцитами человека и барана [3, c. 20—23].
С помощью прибора денситометра (ATB Densitometer) фирмы Bio Merieux (Франция), готовили взвесь эритроцитов в физиологическом растворе 108 клеток/мл -0,5 MF и взвеси бактерий 109клеток/мл MF. Прибор позволяет автоматически установить оптический стандарт мутности по шкале Mac Farland, определить концентрацию бактериальных взвесей табл. 2.
Таблица 2.
Интерпретация эквивалентов стандартов Мак Фарланда (MF)
Стандарт Концентрация (*106) Оптическая плотность при 550 нм
0,5 150 0,125
4 1200 1,0
Взвесь бактериальных культур, 1 мкл Д-маннозы, эритроциты барана или человека по капле наносили на обезжиренное предметное стекло, смешивали, инкубировали при температуре 37 0С в течение 30 минут. Готовые мазки высушивали при комнатной температуре, фиксировали в 96 0этиловом спирте и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимзе. Изучение адгезии вели при помощи светового микроскопа CETI. Для того, чтобы изображение было полностью и в точности передано на экран компьютера применяли цифровую камеру-окуляр для микроскопа (модель ДСМ 3 МПикс., USB 2.0.) фирмы «Shangrao Tele View Optical Instruments Co., Ltd.
Результаты: количественные характеристики изучения адгезивных свойств бактерий представлены в табл. 3.
Таблица 3.
Результаты изучения адгезивной активности бактерий, под воздействием растворов вытяжек шунгитовой породы (клеточный субстрат — эритроциты
Наименование Показатели адгезии
СПА КУЭ (%) ИАМ
Listeria monocytogenes
До обработки вытяжками (контроль) 3,71 84,5 4,39
После обработки 1 % ацетоновой вытяжкой 1,63 75,0 2,17
После обработки 3 % ацетоновой вытяжкой 1,17 60,1 1,94
После обработки 1 % этанольной вытяжкой 1,42 67,3 2,10
После обработки 3 % этанольной вытяжкой 2,03 71,8 2,82
Таблица 4.
Клеточный субстрат — эритроциты человека О (I) Rh (+)
Наименование Показатели адгезии
СПА КУЭ (%) ИАМ
Listeria monocytogenes
До обработки вытяжками (контроль) 3,99 88,5 4,50
После обработки 1 % ацетоновой вытяжкой 1,65 76,9 2,14
После обработки 3 % ацетоновой вытяжкой 1,96 80,3 2,44
После обработки 1 % этанольной вытяжкой 2,07 73,2 2,82
После обработки 3 % этанольной вытяжкой 2,39 74,1 3,22
Выводы: Анализ приведенных данных показавает, что контрольные штаммы Listeria monocytogenes до обработки 1 % и 3 % ацетоновой и этанольной вытяжкой имеют средний показатель адгезии (СПА<4). Принимая во внимание другой количественный показатель — индекс адгезивности (ИАМ), можно сделать вывод о том, что до обработки 1 % и 3 % ацетоновой и этанольной вытяжкой все контрольные бактерии считались высокоадгезивными. По нашему мнению, это обусловлено тем, что листерия имеет нефимбриальные адгезины. С помощью адгезинов бактерии осуществляют выбор субстрата, чувствительного к дальнейшему поражению токсином или ферментами. Эксперимент демонстрирует уменьшение значений СПА, КУЭ, ИАМ у всех видов испытуемых бактерий, при воздействии растворов вытяжек.
Изучение механизмов, обеспечивающих прикрепление (адгезию) бактерий к клеткам-мишеням, является эффективной предпосылкой для создания профилактических антиадгезивных препаратов на основе шунгита, направленных на снижение или предотвращение колонизации тканей хозяина и получения высокоэффективных антибактериальных препаратов типа антисептиков.
Список литературы:
1. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // ЖМЭИ. — 1999. — № 5. — С. 34—39.
2. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. // Лабораторное дело. — 1986. — № 4. — С. 210—212.
3. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий. // ЖМЭИ. — 2006. — № 3. — С. 20—23.
4. Методические рекомендации № 28-6/7 «Выявление гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных свойств энтеробактерий». М., 1987.
5. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М.,1980.
6. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям и ведению тест-культур при работе бактериологических лабораторий. Тула, 2000.
7. Прокопченков Д.В. Системный анализ биологической активности шунгитовой породы на основе ее вещественного состава. Автореферат дисс. канд. биол. наук, Тула, 2008.
8. Честнова Т.В., Григорьев Ю.И. Современные проблемы листериоза: распространенность, эпидемиология, бактериологическая диагностика. Изд-во Тул ГУ, 2002. — 85 с.
