CC BY
24ЭКОЛОГИЯ
УДК 577.11:577.345:582.6.9(571.56)
Изучение адаптивных возможностей ольхи кустарниковой, произрастающей в зоне повышенного естественного радиационного фона
А. Н. Журавская, И. А. Прокопьев, И. В. Воронов
Исследовано влияние повышенного естественного радиационного фона на изменение вариабельности физиолого-биохими-ческих характеристик (коэффициенты общей антиоксидантной защиты, репарации, общей активности и относительной устойчивости генома клеток) и радиоустойчивости семенного потомства ольхи кустарниковой. Установлено, что с ростом мощности экспозиционной дозы произрастания увеличивается вариабельность общей антиоксидантной защиты клеток. Показано, что произрастание растений при мощности экспозиционной дозы излучения в диапазоне от 18,2 до 25,0 пКл/(кг-с) привело к повышению вариабельности биохимических характеристик семенного потомства, что в сочетании с повышенным суммарным содержанием низкомолекулярных антиоксидантов в клетках явилось благоприятным фактором для формирования их высокой радиоустойчивости к острому облучению.
Influence of increased natural radiation background on variability of physiological and biochemical characteristics (quotients of general antioxidant protection, reparations and the general relative stability of cells" genome) and radiostability of seed brooding of Duschekia fruticosa was investigated. It was established that increase of exposition dose variability of cells causes growth of general antioxidant protection. It was shown that vegetation ofplants at doses range from 18,2 to 25,0 pC/(kg-s) led to increase variability of biochemical characteristics of seed brooding, that in combination with increased summary contains of low molecular antioxidants in cells were the congenial factor for formation of their high radiostability to an acute exposition.
Ключевые слова: ольха кустарниковая, адаптационный потенциал, радиоустойчивость, антиоксидантная защита.
Изучение биологического действия повышенного естественного радиационного фона (ПЕРФ) в последние годы приобретает особое значение в связи с интенсификацией антропогенных воздействий на ландшафты в районах месторождений полезных ископаемых, содержащих радиоактивные элементы. Актуальность этой проблемы обусловлена также тем, что ПЕРФ является источником малых доз радиации [1], биологические эффекты которых изучены недостаточно. Территория Республики Саха (Якутия) в этом отношении может быть природным полигоном для изучения действия малых доз радиации на организмы, так как в регионе имеются большие территории с близким залеганием к земной поверхности урановых руд, на которых хозяйственная деятельность человека привела к усилению радиационного фона.
По современным представлениям физиолого-биохи-мические радиоадаптации могут лежать в основе повышения радиоустойчивости растительных организмов, обитающих в условиях ПЕРФ [2]. В то же время известно, что важнейшим фактором обеспечения устойчивости биосистемы и ее способности к самоорганизации является ее структурная и функциональная гетерогенность (вариабельность) [3]. Также одной из причин клеточной гетерогенности является неоднозначность матричных
процессов (репликации, транскрипции, трансляции), которые могут осуществляться поливариантно [4].
Тем не менее, исследований, посвященных изучению влияния ПЕРФ, на уровне внутривидовой изменчивости (вариабельности) физиологических, биохимических и др. характеристик в популяциях растений, существующих в условиях криолитозоны, на их радиоустойчивость, очень мало [5, 6].
Цель данного исследования — выявить адаптивные возможности ольхи кустарниковой, произрастающей в зоне повышенного естественного радиационного фона, и радиоустойчивость ее семенного потомства.
Материал и методики
Ольха кустарниковая (Бш^екга А-иИсо^а (Кирг) Рои-2аг) — летне-зеленый листопадный древесный кустарник до 4 м высоты, растущий, как правило, в подлеске. Растет в хвойных и смешанных лесах, на гарях, вырубках, болотах, по берегам рек, на каменистых луговых склонах и россыпях практически во всех районах Якутии [7]. Семена ольхи кустарниковой, выросшей в условиях ПЕРФ в диапазоне мощностей экспозиционных доз хронического излучения от 3,8 до 53,5 пКл/(кг-с), были собраны в 2006 г. Мощность экспозиционной дозы у-излучения
ЖУРАВСКАЯ Алла Николаевна — д.б.н., в.н.с. ИБПК СО РАН; ПРОКОПЬЕВ Илья Андреевич — аспирант ИБПК СО РАН; ВОРОНОВ Иван Васильевич — к.б.н., ИБПК СО РАН.
фиксировали по показаниям дозиметра СРП-68-01. Контролем служили семена растений, произрастающих в диапазоне от 0,7 до 1,6 пКл/(кг-с). Количество растений в каждой выборке составило п=20.
Семена проращивали в чашках Петри, на фильтрах при комнатной температуре (20—24оС), в световом режиме с длиной дня 16 ч. и ночи — 8 ч., по 50 штук в 4 по-вторностях. Критериями оценки адаптационного потенциала семенного потомства растений являлись: выживаемость проростков на 30 сутки наблюдения на стадии настоящего листа (%), митотическая активность мери-стематических клеток корней проростков (МИ, %), суммарное содержание низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО, мкг-экв /г ), активность антиоксидантных
у ^ кверц. пр' ^
ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и пероксида-зы (мкмоль/мин-г^); скорости включения 3Н-тимидина (фмоль/сут-г^) в молекулы ДНК в процессах реплика-тивного и репаративного синтеза и 14С-лейцина (пмоль/ сут-гпр) в синтезируемые белки клеток проростков.
Определение активности пероксидазы проводили по стандартной методике [8], активность СОД — по методу [9], суммарное содержание НМАО — по методу [10]. Активность функционирования белоксинтезирующих, ДНК-реплицирующих и репарирующих систем определяли с применением радиоиндикаторного метода [11].
Коэффициенты общей антиоксидантной защиты, ре-паративной способности, общей относительной устойчивости и активности генома клеток проростков рассчитывали, применяя комплексную цитолого-биохимическую методику [12].
Воздушно-сухие семена подвергали воздействию острого у-излучения от источника 60Со при мощности дозы 0,094 Гр/с, на установке типа «Исследователь» в диапазоне доз от 10 до 500 Гр, на биофизической станции г. Заречный Института экологии растений и животных УрО РАН (г. Екатеринбург).
Для выявления радиоустойчивости семенного потомства ольхи кустарниковой был применен анализ дозовых кривых выживаемости на стадии образования первого листа, так как на этой стадии начинают активно функционировать меристемы — критические ткани растений. Уровень радиоустойчивости семян характеризовали значением полулетальной дозы на 30 день наблюдения
(ЛДЖ0) [13].
Расчеты среднеарифметической, стандартной ошибки среднего и коэффициент вариации рассчитывались по [14]. Значимость отличия от контроля оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уит-ни (^-критерий Манна-Уитни) при уровне значимости /><0,05. При этом нормальность распределения признака проверялась по критерию Шапиро-Уилка [15]. Значение ЛД50/30 рассчитывалось методом пробит анализа, с использованием пакета Апа1у818ой, 8!а1Р1ш — программа статистического анализа, у.2007.
Результаты и обсуждение
Полученные физиологические и цитолого-биохи-мические характеристики 30-суточных проростков семенного потомства ольхи кустарниковой представлены в табл. 1. Видно, что с ростом мощности экспозиционных доз произрастания материнских растений в диапазоне от 0,7 до 53,5 пКл/(кг-с) митотическая активность корневой меристемы снижается на 50—70% по сравнению с контролем.
Активность процессов репликации и трансляции (по скорости включения 3Н-тимидина и 14С-лейцина) в клетках проростков статистически достоверно не изменилась, кроме групп растений, произраставших при мощности экспозиционных доз от 3,8 до 10,6 пКл/(кг-с), где отмечено значимое снижение на 62% активности трансляции белка относительно контроля.
Таблица 1
Физиологические и цитолого-биохимические характеристики проростков семенного потомства ольхи кустарниковой,
выросшей в условиях разного ПЕРФ
у-фон, пКл/ (кг-с) Митоти-ческий индекс, % Скорость включения 14С-лейцина, пмоль/ (гпр-сут) Скорость включения Н3-тимидина фмоль/ (гпР-сУт) Содержание низкомолекулярных анти-оксидантов мкг-экв /г кверц. пр Активность пероксида-зы, мкмоль/ (мин-гпр) Активность супероксид-дисмутазы, мкмоль/ (мин-гп) Выживаемость проростков, %
0,7—1,6 1,3±0,2 3,2±0,7 4,1±0,6 3,8±0,5 1,4±0,3 2,1±0,1 37,1±2,6
3,8—10,6 0,4±0,1* 1,2±0,2* 3,5±0,6 4,8±1,1 0,4±0,1* 0,4±0,1* 9,9±0,9*
18,2—25,0 0,7±0,1* 1,7±0,4 3,0±0,4 7,6±1,7* 0,8±0,1* 0,6±0,1* 15,5±3,2*
32,4—39,2 0,6±0,3* 2,2±0,8 5,1±1,1 4,7±1,7 0,4±0,1* 0,9±0,1* 17,6±2,7*
46,7—53,5 0,6±0,1* 2,1±0,9 4,2±0,7 5,3±0,6* 0,4±0,1* 1,6±0,3 23,1±2,5*
* — различия статистически значимы по сравнению с контролем р<0,05 (и — критерий Манна-Уитни)
Известно, что общая противорадикальная и противо-перекисная защита клетки складывается из активности ферментов окислительно-восстановительных реакций и содержания низкомолекулярных антиоксидантов различной природы [2]. НМАО представлены, прежде всего, веществами группы витамина Е, а также стероидными гормонами, серосодержащими аминокислотами, аскорбиновой кислотой, витаминами группы А, К и Р, убихиноном
и другими соединениями. Общая противорадикальная и противоперекисная защита клетки складывается из активности ферментов окислительно-восстановительных реакций и содержания низкомолекулярных антиоксидан-тов различной природы. Приоритетность той или иной из этих систем при защите от неблагоприятных факторов существования, в том числе от лучевого поражения, определяется, с одной стороны, видовыми особенностя-
ИЗУЧЕНИЕ АДАПТИВНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОЛЬХИ КУСТАРНИКОВОЙ
ми растения, а с другой — сочетанием стресс-факторов, действующих на организм в конкретных условиях, их прооксидантной и радикалоинициирующей активностью [13].
В наших исследованиях содержание НМАО в клетках проростков семенного потомства изменялось не линейно (табл. 1). По мере роста мощности у-излучения, отмечено статистически достоверное увеличение содержания НМАО в клетках у групп растений, произрастающих при мощности экспозиционных доз от 18,2 до 25,0 пКл/ (кг-с) (7,6±1,7 мкг-эквкверц/гпр) и от 46,7 до 53,5 пКл/(кг-с) (5,3±0,6 мкг-экв /г ) соответственно. Активность
4 ' ' кверц. пр'
ферментов антиоксидантной защиты супероксиддисму-тазы и пероксидазы, с ростом мощности у-излучения изменялась следующим образом: активность пероксидазы падала в 2—6 раз; активность СОД снижалась на 80% в диапазоне мощности экспозиционных доз от 3,8 до 10,6 пКл/(кг-с). С последующим ростом экспозиционной дозы произрастания растений происходила постепенная активация супероксиддисмутазы. А при мощности экспозиционных доз от 46,7 до 53,5 пКл/(кг-с) активность СОД в клетках составляла 1,6±0,3 мкмоль/(мин-гпр), что статистически достоверно не отличалось от контроля.
Выживаемость проростков семенного потомства ольхи кустарниковой также уменьшалась по мере роста ПЕРФ, при этом была установлена положительная корреляция (г=0,98; />=0,004) между активностью СОД и выживаемостью проростков в зависимости от мощности экспозиционной дозы произрастания материнских растений (табл. 1; рис. 1). То есть, чем выше активность СОД в клетках проростков, тем больше их выживаемость, что можно рассматривать как адаптивную реакцию растений к хроническому радиационному стрессу [16].
Дополнительное воздействие на семена растений у-квантами 60Со в диапазоне доз от 10 до 500 Гр позволило выявить скрытый их адаптационный потенциал и построить дозовые кривые выживаемости семенного потомства ольхи кустарниковой. Видно, что произрастание материнских растений в условиях более высоких ПЕРФ ведет к увеличению устойчивости к острому облучению их семенного потомства (рис. 2). Максимальное значение по показателю ЛД50/30 (287,5±20,0 Гр) имеют проростки растений, выросшие из семян, созревших при мощности экспозиционных доз у-излучения от 18,2 до 25,0 пКл/ (кг-с), что более чем в 10 раз выше значения контроля (см. табл. 2).
Следует отметить, что длительное произрастание ма-
Рис. 1. Выживаемость проростков и активность СОД в клетках ольхи кустарниковой в зависимости от уровня ПЕРФ места произрастания материнских растений
Рис. 2. Выживаемость проростков семенного потомства ольхи кустарниковой в зависимости от уровня ПЕРФ произрастания материнских растений (нормировано относительно контроля)
теринских растений ольхи кустарниковой при мощности экспозиционных доз в диапазоне от 0,7 до 53,5 пКл/ (кг-с) дало положительную корреляцию (г=0,97; р=0,008;
Таблица 2
Значения полулетальной дозы (ЛД5(|/3(|), вариабельности (%) коэффициентов антиоксидантной защиты, общей активности генома, репарации, общей относительной устойчивости генома клеток семенного потомства ольхи кустарниковой, выросшей в условиях разного ПЕРФ
у-фон, пКл-(кг-с) ЛД5с/30' ГР Ук аоз Ук оаг Ук реп Ук уг
0,7—1,6 27,0±3,5 22,8 32,9 54,2 40,9
3,8—10,6 146,7±22,4* 40,0 30,4 47,6 41,4
18,2—25,0 287,5±20,0* 36,2 32,6 67,9 47,9
32,4—39,2 140,0±15,3* 34,5 38,1 51,2 43,8
46,7—53,5 155,1±19,8* 36,4 38,2 50,0 41,1
* — различия статистически значимы по сравнению с контролем р<0,05 (^-критерий Манна-Уитни)
рис. 3) между содержанием низкомолекулярных антиок-сидантов в клетках проростков и значением полулетальной дозы, что соответствует ранее полученным данным [12]. Еще Бурлаковой и др. [17] установлена отчетливая корреляция между антирадикальной активностью различных ингибиторов свободнорадикальных реакций и радиозащитным эффектом в отношении повреждения ДНК и даже выживаемости животных.
Также ранее было показано, что радиоустойчивость растений зависит не только от совокупности защитных антиоксидантных, ДНК-репарационных систем, но и от внутрипопуляционной вариабельности (изменчивости) этих систем, которая, в свою очередь, в определенной степени является следствием предшествующей адаптации (отбора) популяции ко всей совокупности экологических стресс-факторов среды [6]. Само понятие «изменчивость» достаточно расплывчато и понимается по-разному. Чарльз Дарвин [18], говоря об изменчивости и рассматривая ее как один из двух важнейших факторов эволюции, тем не менее, не дал классификации ее проявлений, поскольку нечетко представлял все их разнообразие. Он оперировал общим термином «вариация». В табл. 2 показаны значения полулетальной дозы (ЛД50/30), вариабельности (%) коэффициентов антиоксидантной защиты (Укаш), общей активности генома (Укоаг), активности систем репарации ДНК (Укреп), общей относительной устойчивости генома клеток (Укуг) семенного потомства ольхи кустарниковой, выросшей в условиях разного ПЕРФ.
Установлено, что с ростом мощности экспозиционной дозы у-излучения, на территории произрастания материнских растений, вариабельность общей антиокси-дантной защиты клеток проростков семенного потомства увеличилась в 1,5—2,0 раза по сравнению с контролем. Есть данные, свидетельствующие, что полиморфность ферментов позволяет каждую биохимическую реакцию проводить с такой специфичностью и скоростью, которые обеспечивают адекватную ответную реакцию организма на действие разнообразных раздражителей, оптимальные специфичность и скорость реакций дезинтоксикации разнообразных токсикантов, попавших в организм или об-
Рис. 3. Суммарное содержание НМАО в клетках проростков ольхи кустарниковой и значения полулетальной дозы в зависимости от уровня ПЕРФ места произрастания материнских растений
разующихся в нем при действии физических или химических раздражителей. Причем, чем важнее функция или шире функциональный спектр фермента, тем шире его изоэнзимный спектр [19].
Вариабельность коэффициента общей активности генома возросла на 15% при мощности экспозиционных доз у-фона от 32,4—39,2 до 46,7—53,5 пКл/(кг-с). Значение вариабельности коэффициента устойчивости генома по мере роста мощности у-фона статистически достоверно не изменилось.
Репарация ДНК (от лат. тератайв — восстановление) — свойственный клеткам всех организмов процесс восстановления природной (нативной) структуры ДНК, поврежденной при нормальном биосинтезе ДНК в клетке, а также физическими или химическими агентами. Это универсальное свойство живых организмов восстанавливать повреждения, возникшие в ДНК в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы. Оно было открыто относительно недавно, около полувека назад [20]. Вариабельность расчетного коэффициента репарации также находилась на одном уровне с контролем, кроме групп растений, произраставших при мощности у-фона в диапазоне от 18,2 до 25,0 пКл/(кг-с), для которых данное значение составило 67,9%, что выше на 25% контрольного значения (Укреп=54,2%).
Таким образом, показано, что длительное произрастание растений при мощности экспозиционной дозы у-излучения от 18,2 до 25,0 пКл/(кг-с) вызвало неспецифические адаптивные изменения, которые привели к повышению вариабельности коэффициентов репарации и антиоксидантной защиты (Укреп=67,9%; Укаоз=36,2%) у семенного потомства, что в сочетании с повышенным суммарным содержанием низкомолекулярных анти-оксидантов в клетках (7,6±1,7мкг-экв /г ) явилось
у ^ ^ кверц. пр'
благоприятным фактором для формирования их более высокой радиоустойчивости к острому облучению (ЛД50/30=287,5±20,0 Гр).
Выводы
1. Установлена положительная корреляция (1=0,98) между активностью СОД и выживаемостью семенного потомства ольхи кустарниковой в зависимости от ПЕРФ произрастания материнских растений, что может рассматриваться как один из механизмов адаптации этого вида к хроническому радиационному стрессу в малых дозах.
2. Выявлено, что при произрастании материнских растений ольхи кустарниковой при мощности экспозиционной дозы у-излучения в диапазоне от 1,4 до 53,5 пКл/ (кг-с) наблюдается положительная корреляция (г=0,94) между значениями полулетальной дозы и содержанием низкомолекулярных антиоксидантов в клетках проростков дочернего поколения.
3. Установлено, что с ростом мощности экспозиционной дозы у-излучения места произрастания материнских растений, вариабельность общей антиоксидантной защиты клеток проростков семенного потомства увеличивается до 1,5—2,0 раз по сравнению с контролем.
4. Показано, что длительное произрастание материнских растений ольхи кустарниковой при мощности экспозиционной дозы у-излучения от 18,2 до 25,0 пКл/(кг-с) вызвало адаптивные изменения, которые привели к по-
ИЗУЧЕНИЕ АДАПТИВНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОЛЬХИ КУСТАРНИКОВОМ...
вышению вариабельности коэффициентов репарации и антиоксидантной защиты семенного потомства, что в сочетании с повышенным суммарным содержанием низкомолекулярных антиоксидантов в клетках явилось благоприятным фактором для формирования их радиоадаптивного ответа к острому облучению. То есть при оценке радиоустойчивости дикорастущих растений необходимо учитывать не только адаптивные изменения их антиок-сидантных и геномных систем, но и вариабельность этих защитных систем.
Литература
1. Кузин А.М. Проблема малых доз и идеи гормезиса в радиобиологии // Радиобиология. — 1991. — Т. 31, вып. 1. — С. 16—21.
2. Кудряшов Ю.Б. Радиационная биофизика. — М.: Физмат-лит, 2004. — 488 с.
3. Чернавский Д.С. Синергетика и информация. Динамическая теория информации. — М.: Едиториал УРСС, 2004. — 288 с.
4. Инге-Вечтомов С.Г. Неоднозначность матричных процессов как фактор адаптации / В кн.: Системы надежности клетки. — Киев: Наукова думка, 1986. — №1. — С. 28—38.
5. Журавская А.Н., Воронов И.В., Шадрина Е.Г. Влияние внутривидового разнообразия ряда физиологических, биохимических и морфологических показателей на радиочувствительность березы растопыренной // Наука и образование. — 2003. — №1 (29). — С. 29—33.
6. Журавская А.Н., Воронов И.В., Прокопьев И.А. Влияние вариабельности физиолого-биохимических характеристик на радиочувствительность экоформ лебеды раскидистой (Atriplex patulaL.) и полыни чернобыльник (Artemisia vulgarisL.) // Радиационная биология Радиоэкология. — 2006. — Т. 46, №1. — С. 85—90.
7. Андреев В.Н., Галактионова Т.Ф., Горовой П.Г., Караваев М.Н., Леонова Т.Г., Липшиц С.Ю., Михалева В.М., Пермя-кова А.А., Перфильева В.И., Скворцов А.К., Толмачев А.И., Чу-гунова Р.Н. Определитель высших растений Якутии. — Новосибирск: Наука, 1974. — 544 с.
8. Ермаков А.И., Арасимович В.В. Методы биохимического исследования растений. — Л.: Колос, 1987. — 456 с.
9. Constantine N.G., Stanley K.R. // Plant Physiol. — 1977. — V. 59. — P. 565—569.
10. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. — М.: Наука, 1969. — 740 с.
11. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. — М.: Наука, 1983. — 304 с.
12. Журавская А.Н., Филиппов Э.В., Кершенгольц Б.М. Влияние биохимических адаптаций ольхи кустарниковой (Duschecia fruticosa (Rupr)) к повышенному естественному радиационному фону на выживаемость проростков и радиочувствительность ее семян // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2000. — Т. 40. — №3. — С. 254—260.
13. Гродзинский Д.М. Радиобиология растений. — Киев: Наукова думка, 1989. — 380 с.
14. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа, 1980. — 293 с.
15. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
16. Журавская А.Н., Кершенгольц Б.М., Курилюк Т.Т., Щербакова Т.М. Энзимологические механизмы адаптации растений к условиям повышенного естественного радиационного фона // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1995. — Т. 35, вып. 3. — С. 349—355.
17. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижина Г.П., Конрадов А.А. Новые аспекты закономерностей действия низкоинтенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1999. — Т. 39, №1. — С. 26—34.
18. Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора. — 1859. — 120 с.
19. Кершенгольц Б.М. Неспецифические биохимические механизмы адаптации организмов к экстремальным условиям среды // Наука и образование. — 1996. — Т. 3. — С. 130—138.
20. Лучник Н.В. Влияние слабых доз излучателей на митоз у гороха // Бюлл. Уральского отделения МОИП. — Свердловск, 1958. — Вып. 1. — С. 37—49.
