CC BY
67
А. В. Любимов, К. Л. Блэк, Ю. Ю. Любимова
ИЗОФОРМЫ ЛАМИНИНА В ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ ТЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ МОЗГА И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Медицинский центр Сидарс-Синай, Лос-Анджелес, США
Микрочипы с 14 ООО генных зондов были использованы для анализа экспрессии генов в опухолях мозга человека, включая глиомы IV стадии (глиобластома мультиформная), астроцитомы ранних стадий и доброкачественные менингиомы, в сравнении с нормальной тканью мозга. Также изучались гистологически нормальные ткани, соседние с мультиформной глиобластомой. В сравнении с нормальной тканью мозга все мультиформные глиобластомы имели повышенную экспрессию 14 генов, которые относились к двум группам: гены факторов роста, а также гены структурных элементов и компонентов внеклеточного матрикса. Два гена имели повышенную экспрессию во всех опухолях и в соседних с мультиформной глиобластомой нормальных тканях. Это были гены рецептора эпидермального фактора роста (известного маркера глиом) и а4-цепи ламинина, основного компонента сосудистых базальных мембран. Повышенная экспрессия а4-цепи ламинина была подтверждена с помощью полимеразной цепной реакции в сочетании с обратной транскрипцией и иммуногистохимии. В базальных мембранах сосудов мультиформной глиобластомы и соседних с ней нормальных тканей в основном экспрессировалась изоформа ла-минин-8, содержащая а4-цепь (а4р 1 у 1).
В то же время в базальных мембранах сосудов опухолей ранней стадии и нормальных тканей мозга в основном экспрессировалась изоформа ламинин-9, также содержащая а4-цепь (а4|32у1). Мультиформные глиобластомы с повышенной экспрессией ламинина-8 рецидивировали намного быстрее (в среднем через 4,3 мес), чем мультиформные глиобластомы с повышенной экспрессией ламинина-9 (в среднем через 10,4 мес). Таким образом, повышенная экспрессия ламинина-8 может играть роль в неоваскуляризации глиом, их прогрессии и возникновении рецидивов.
Анализ 30 нормальных и опухолевых тканей молочной железы показал, что высокоинвазивные протоковые раки также часто имели повышенную экспрессию ламинина-8 в противоположность ‘ракам in situ, которые в основном экспрессировали ламинин-9, и нормальной ткани молочной железы, которая не содержала этих изоформ ламинина. Мы предположили, что ингибирование экспрессии ламинина-8 с помощью антисенс-олигонуклеотидов нового поколения (Морфоли-но™) против его цепей могло бы замедлить распространение опухолей и их рецидивирование. Мы разработали культуральную модель, которая, очевидно, соответствует ситуации в мозге, когда глиальные и эндотелиальные клетки соседствуют. Клетки линий мультиформной глиобластомы человека М059К и U-87MG кокультивировали с нормальными эндотелиальными клетками мозга (линия HBMVEC). Антисенс-олигонуклеотиды эффективно блокировали синтез ламинина-8 по данным иммуноблоттинга и иммуногистохимии. Комбинация антисенс-олигонуклеотидов против цепей ламинина а4 и (И ингибировала на 60% инвазию кокультур (в основном опухолевых клеток) через матрикс базальных мембран (Матригель®).
Эти данные свидетельствуют о том, что ламинин-8 может способствовать прогрессии и реци-дивированию опухолей не только как элемент неоваскуляризации, но и с помощью прямой стимуляции инвазии. Таким образом, его можно попытаться использовать как мишень для терапии глиом и других опухолей, включая рак молочной железы.
Ключевые слова: ламинин-8, ламинин-9, базальная мембрана, глиома, рак молочной железы, опухолевая инвазия, антисенс, рецидив, кокультура.
©Любимов А. В., Блэк К. Л., Любимова Ю. Ю., 2003 УДК 616.831+618.19]-006-07:577.1
14,000-gene microarrays were used to study gene expression profiles in brain tumors including high-grade gliomas (glioblastoma multiforme, GBM), low-grade astrocytomas, and benign meningiomas, in comparison to normal brain tissue. Histologically normal GBM-adjacent tissues were also studied. Compared to normal human brain tissue, all GBMs overexpressed 14 genes that belonged to two major groups, growth factor-relat-ed genes and structural/extracellular matrix-related genes. Two genes were consistently upregulated in both high-grade and low-grade gliomas as well as in GBM-adjacent tissues. These genes coded for the epidermal growth factor receptor (previously reported to be overexpressed in gliomas) and for a4 chain of laminin, a major blood vessel basement membrane component. Overexpression of laminin a4 chain in GBM and astrocytoma grade II was confirmed by RT-PCR and immunohistochemistry. An a4 chain-containing laminin isoform, laminin-8 (a4plyl), was mainly expressed in blood vessel walls of GBMs and GBM-adjacent tissues, whereas another a4 chain-containing laminin isoform, laminin-9 (a4|32yl) was mainly expressed in blood vessel walls of low-grade tumors and normal brain. GBMs that overexpressed laminin-8 had a shorter mean time to tumor recurrence (4.3 months) than GBMs with overexpression of laminin-9 (10.4 months). Upregulation of a4 chain-containing laminins could thus be important for glioma-induced neovascularization, glial tumor progression and recurrence. Analysis of 30 human breast tissues also showed predominant expression of laminin-8 in highly invasive ductal carcinomas contrary to carcinoma in situ that expressed laminin-9 and to normal breast tissues that did not express either laminin-8 or laminin-9. We hypothesized that inhibition of laminin-8 expression by a new generation of highly specific and stable antisense oligonucleotides (Moipholino™) against laminin-8 chains could slow or stop the spread of glioma and its recurrence. To mimic conditions in the brain with two main cell types present (glial and endothelial), an in vitro co-culture model was established. Human GBM cell Unes M059IC and U-87MG were co-cultured with normal human brain microvascular endothelial cells. Antisense treatment effectively blocked laminin-8 protein synthesis as confirmed by Western blot analysis and immunohistochemistry. Antisense oligonucleotides against both a4 and ¡31 chains of laminin-8 blocked the invasion of co-cultured cells (mainly GBM cells) through Matrigel for up to 62%. The results show that laminin-8 may not only contribute to tumor progression and recurrence as part of the neovascularization process but also by directly increasing the invasive potential of tumor cells. It may, therefore, constitute a new promising target for future drag therapy of glioma and other types of cancer including breast cancer.
Key words: laminin-8, laminin-9, basement membrane, glioma, breast cancer, tumor invasion, antisense, recurrence, co-culture.
Список сокращений, используемых в тексте
БМ — базальная мембрана
ВКМ — внеклеточный матрикс
ГБМ — глиобластома мультиформная
ММП — матриксная металлопротеаза
bFGF — основный фибробластный фактор роста
(basic fibroblast growth factor)
EGFR — рецептор эпидермального фактора роста
(epidermal growth factor receptor)
IGF — инсулиноподобный фактор роста
(insulin-like growth factor)
RT-PCR — полимеразная цепная реакция в сочетании
с обратной транскрипцией (reverse transcription polymerase chain reaction) TGF — трансформирующий фактор роста (transforming growth factor)
VEGF — фактор роста эндотелия
(vascular endothelial growth factor)
Базальные мембраны и рак
Инвазия окружающих тканей является основным свойством злокачественных солидных опухолей, способствуя распространению опухоли и метастазированию. В процессе инвазии опухолевые клетки выходят за границы нормальных структур, проходя через БМ, и мигрируют в соединительнотканную строму. Эти события включают
тесные взаимоотношения опухолевых клеток с ВКМ и перестройку его структур, очевидно, с помощью протеаз опухолевых клеток [5; 15; 18].
ВКМ и его специализированные структуры БМ играют важную роль в опухолевом росте как барьеры для инвазии, подложки для миграции опухолевых клеток и компоненты образующихся опухолевых сосудов [5; 10; 15; 18; 30; 31]. Во многих солидных опухолях БМ прерывисты или' отсутствуют [5; И; 15; 23; 24; 43]. Это может быть следствием как неспособности опухолевых клеток правильно собирать БМ, так и разрушения БМ этими клетками. Считается, что про-теолитическая деградация ВКМ и БМ с помощью активатора плазминогена и ММП в большой степени способствует инвазии опухолей [8; 13; 35]. Во многих опухолях и опухолевых клеточных линиях наблюдается повышенная экспрессия активатора плазминогена и ММП.
Паренхимные и сосудистые БМ состоят из многих компонентов, которые могут встречаться во всех БМ (коллагены IV типа, ламинины, перлекан, энтактины/нидогены) или только в некоторых (матрилины, дистрогликаны, фибронектин, бама-кан, |3-нетрин, другие коллагены). Как коллаген IVтипа, так и ламинин имеют много изоформ, что приводит к огромной гетерогенности БМ в разных органах. Строго говоря, термины «коллаген IV типа» или «ламинин» уже устарели. Современный уровень наших знаний требует идентификации специфических изоформ этих белков в специфических БМ [6; 14; 22; 33].
• Ламинин-1 а1|31у1
• Ламинин-2 a2(3lyi
• Ламинин-3 ai |32у1
• Ламинин-4 a2|32yi
• Ламинин-5 аЗ|Ззу2
• Ламинин-6 аЗ|31у1
• ламинин-7 аЗ[32у1
• Ламинин-8 а4|31у1
• Ламинин-9 a4|32yi
• Ламинин-10 а5[31у1
• Ламинин-11 а5|32у1
• Ламинин-12 a2piy3
Цит. по: Miner J.H. // Kidney Int. — 1999. — Vol. 56. — P. 2016—2024 i Рисунок 1. Основные изоформы ламининов.
Семейство ламининовых гликопротеидов является основным компонентом БМ и насчитывает до 15 членов [6; 22; 33], хотя наиболее изучены 12 изоформ (рис. 1). Вселами-нины состоят из трех ковалентно связанных цепей а, |3 и у. Ламинины взаимодействуют с клетками с помощью рецепторов, в основном интегринов. С разными ламининами могут связываться инте1рины а1|31, а2р 1, аЗр1, аб(31, а6(:М и а7(31 [2; 28]. Многие ламинины являются компонентами БМ сосудов. БМ капилляров мозга в основном содержат ла-минин-8 (а4|31у1) и ламинин-10 (а5|31у1) [38]. По нашим данным, в них еще слабо экспрессируется ламинин-9 (cx4(32y 1) [25]. Ламинин-8 и один из его рецепторов интег-рин а6|31, по-видимому, важны для функционирования ге-матоэнцефалического барьера [38].
Как и другие компоненты БМ, ламинины не откладываются нормальным образом вокруг опухолевых структур: обычно они имеют прерывистое распределение или отсутствуют [11; 15; 23; 24; 43]. Тем не менее данных о роли каких-либо изоформ ламинина, включая ламинины сосудистых БМ, в опухолевом росте практически не было. Наши данные, которые описаны ниже, впервые предполагают участие нескольких сосудистых изоформ ламинина в прогрессии опухолей мозга, а также молочной железы.
Повышение экспрессии содержащего а4-цепь ламинина-8
в глиобластомах и его связь с рецидивированием опухолей
Наши данные, приведенные ниже, в основном касаются глиом человека. Эти опухоли являются главной причиной детской смертности от злокачественных новообразований и самыми частыми опухолями головного мозга [16]. Средняя выживаемость больных с астроцитомой ранних стадий или с олигодендроглиомой составляет 6—8 лет, с анапластической астроцитомой — 3 года и с ГБМ — всего 12—18 мес. ГБМ высокоинвазивны и быстро локально рецидивируют. Их лечат с помощью хирургии, лучевой терапии, химиотерапии или их комбинаций. Несмотря на хорошую изученность биохимии, морфологии и молекулярной биологии глиом, успехи в их лечении крайне ограничены [37].
Понимание молекулярных механизмов развития глиом и образования местных рецидивов необходимо для улучшения лечения, прогноза и разработки новых эффективных методов лечения. Тем не менее для многих опухолей, включая глиомы, известные геномные, хромосомные и биохимические изменения в основном неспецифичны и поэтому имеют
ограниченную ценность для диагностики и эффективного лечения [36]. Таким образом, поиски специфичных маркеров опухолей мозга представляются весьма важными.
Глиомы часто имеют повышенные уровни онкогенов с-шус и c-met, интегрина LFA-3, фактора транскрипции АР-2, виментина, ММП, синтазы окиси азота, гладкомышечного актина, EGFR, TGFa и TGFp, VEGF, IGF II и bFGF-2. В то же время экспрессия коннексина-43 и тканевых ингибиторов ММП понижена [17; 27; 29; 34; 41].
В большинстве предыдущих работ изучались лишь один или несколько генов, хотя ясно, что в возникновении опухолей участвуют семейства и каскады генов. Не так давно эти пробелы стали заполняться с помощью генных чипов, позволяющих оценить экспрессию тысяч разных генов в одном опыте. Подобные исследования, в частности проведенные нашей группой, выявили многочисленные генные изменения в глиомах [25; 36]. Однако мультигенные исследования все еще связаны с трудностями, обусловленными индивидуальностью человеческих опухолей, независимостью прогрессии опухолей и отсутствием необходимых реагентов для изучения отдельных белков.
Мы применили эту технологию для изучения профилей генной экспрессии в глиомах в сравнении с нормальной тканью мозга и соседними с опухолью гистологически нормальными тканями. Были использованы чипы Incyte Genomics (UniGEM™ V), содержащие 14 ООО генных зондов по 500— 5000 пар оснований каждый. Значимыми считались различия экспрессии в 2 раза.
Свежие ткани получали из отдела патологии и сразу замораживали в жидком азоте. Все случаи были морфологически верифицированы квалифицированным патологом по классификациям Дюма — Дюпора и ВОЗ. Для анализа с помощью чипов были использованы 5 образцов ГБМ, 2 образца нормальной ткани головного мозга от 2 больных ГБМ, 2 образца астроцитомы II стадии, 1 образец менингиомы и 2 образца нормальной ткани головного мозга погибших от травм. Все образцы сравнивались с нормальным мозолистым телом. Эта ткань содержит в основном глиальные клетки [26] и может являться контролем для глиом. Объединенная мРНК из нормального мозолистого тела 70 человек, умерших от травм, была получена от Clontech.
Сравнение экспрессии генов белого вещества нормальной ткани мозга и мозолистого тела методом генных чипов не выявило заметных различий для подавляющего большинства генов, поэтому далее все опухоли сравнивались с мозолистым телом. В разных ГБМ была выявлена повышенная экспрессия 2345 генов, пониженная — 719 генов. Во всех ГБМ была повышена экспрессия только 14 генов, понижена экспрессия 12 генов. В последней группе преобладали гены, участвующие в метаболических процессах.
Гены с повышенной экспрессией в ГБМ можно разделить на две группы. К первой группе относятся гены, в основном связанные с процессами клеточного роста, включая гены АР-2, EGFR, кератоэпителина, VEGF-A, IGF-II и белков 3 и 5, связывающихся с IGF. Во вторую группу входят гены структурных белков и компонентов ВКМ, включая вимен-тин, фибронектин, тенасцин-С, al-цепь коллагена IV типа, а4-цепь ламинина, тропомодулин, десмоплакин, кератин 8 и
Рисунок 2. Полуколичественная ЯТ-РСЙ а4-цепи ламинина в ткани головного мозга.
Вверху показана экспрессия фрагмента а4-цепи ламинина размером в 362 пары оснований; внизу — экспрессия фрагмента |32-микро-глобулина размером в 333 пары оснований, который служил для выравнивания ЯТ-РСИ. Дорожки обозначены следующим образом: М — ДНК-маркеры, 100 пар оснований; 1 — ГБМ (образец №16); 2 — соседняя с ГБМ ткань (образец №16); 3 — ГБМ (образец №22); 4 — ГБМ (образец №39); 5 — соседняя с ГБМ ткань (образец №39); 6 — ГБМ (образец №45); 7 — ГБМ (образец №50); 8 — ГБМ (образец №47); 9 — ГБМ (образец №25); 10 — соседняя с ГБМ ткань (образец №25); 11 — астроцитома II стадии (образец №34); 12 — доброкачественная менингиома (образец №38); 13 — нормальная ткань мозга (образец №46); 14 — нормальная ткань мозга (образец №40); 15 — мозолистое тело; 16 — отрицательный контроль без обратной транскрипции.
рецептор фосфолипазы А2 [25]. Повышенная экспрессия АР-2, БОРК., УЕОБ-А, ЮБ-П, белков 3 и 5, связывающихся с ЮБ, виментина, фибронектина, тенасцина-С и коллагена IV типа и ранее обнаруживалась в глиомах [36]. Мы впервые выявили увеличение экспрессии генов а4-цепи ламинина и тропомодулина в этих опухолях.
Клиническая картина заболевания коррелировала с уровнем экспрессии генов. Опухоли с высоким уровнем экспрессии многих из перечисленных генов рецидивировали очень быстро, а опухоли с менее высокой экспрессией образовывали рецидивы медленнее.
В астроцитомах II стадии уровни экспрессии генов были в среднем ниже, чем в ГБМ. Только ЕОБЯ, а4-цепь ламинина и АР-2 увеличивались в сравнении с нормальной тканью мозга. Интересно, что профили и уровни генной экспрессии в соседних с ГБМ гистологически нормальных тканях были ближе к таковым в соответствующих опухолях, чем в нормальной ткани.
В целом только гены ЕОРЯ и а4-цепи ламинина имели более высокий уровень экспрессии во всех опухолях и соседних с ГБМ тканях по сравнению с нормальной тканью. ЕОБК является известным маркером глиом [36]. Подобные данные по а4-цепи ламинина отсутствовали. Поэтому мы более подробно исследовали этот ген и белок.
Для полуколичественной ЯТ-РСИ были взяты 15 образцов, включая все ГБМ, которые были исследованы с помощью генных чипов. Высокая экспрессия а4-цепи ламинина выявлялась во всех ГБМ и соседних с ними тканях. В менин-гиоме экспрессия этой цепи была ниже, а в нормальной ткани мозга и мозолистом теле была очень слабой (рис. 2). Таким образом, ЯТ-РСК полностью подтвердила данные, полученные с помощью генных чипов.
Для непрямой иммунофлюоресценции на криостатных срезах сначала использовали следующие образцы тканей:
9 ГБМ, 3 астроцитомы II стадии, 3 образца тканей, соседних с ГБМ, 2 менингиомы и 2 образца нормальной ткани мозга. Использовали антитела к цепям ламинина а1—а5, (31—133 и у1 [25]. Окраска на а4-цепь ламинина была слабой в БМ сосудов нормальной ткани мозга и менингиом. Во всех астроцитомах II стадии окрашивание усиливалось (рис. 3). Очень сильное окрашивание выявлялось во всех ГБМ и соседних с ними тканях в соответствии с данными, полученными с помощью генных чипов и ЮГ-РСК. Альфа4-цепь ламинина может входить в ламинин-8 (а4(Иу1), ламинин-9 (а4|32у1) и недавно обнаруженный ламинин-14 (а4|32у3). Ламинин-14 не был найден в наших опытах, т. к. а4- и уЗ-цепи не сораспре-делялись. В то же время цепи р 1, (52, и у 1 ламинина-8 и лами-нина-9 сораспределялись с а4-цепью. Окраска нау1-цепь была яркой во всех тканях (рис. 3).
Окраска на (31-цепь была слабой в нормальной ткани мозга, в 2 из 3 образцов астроцитом и в 3 из 9 образцов ГБМ. Во всех этих случаях была выявлена яркая окраска на (52-цепь (рис. 3). Вместе с тем в 6 из 9 образцов ГБМ и соседних с ними тканей окрашивание на р1-цепь было намного сильнее, чем окрашивание на |32-цепь, что согласуется с повышенной экспрессией ламинина-8 (рис. 3). Различий в экспрессии других а-цепей ламинина (а1, а2 и а5) между нормальными и опухолевыми тканями не было.
Таким образом, в нормальной ткани мозга и в астроцитомах ранних стадий в основном экспрессировалось небольшое количество ламинина-9, в то время как большинство ГБМ сильно окрашивались на ламинин-8. Дальнейший анализ новых случаев (всего 35 глиом и 5 образцов нормальных тканей мозга) полностью подтвердил предыдущие данные (табл. 1). Глиомы ранних стадий содержали цепи ламинина-9, а в глиомах поздних стадий, особенно в ГБМ, в основном выявлялись цепи ламинина-8 (71% случаев).
60 мкм
Ац II
а4-цепь р1-цепь р2-цепь у1-цепь
Рисунок 3. Иммуногистохимическое исследование распределения а4-содержащих ламининов в нормальной ткани и опухолях головного мозга.
Окрашиваются исключительно сосуды. Окраска на а4-цепь слабая в нормальной ткани мозга, усиливается в астроцитоме и особенно в ГБМ; р1-цепь слабо окрашивается в нормальной ткани мозга и в астроцитоме и сильно в ГБМ, что соответствует повышенной экспрессии ламинина-8 (а4|31у1). Окраска на |32-цепь снижается в ГБМ, что соответствует пониженной экспрессии ламинина-9 (а4|32у1). В каждом случае окрашивались серийные срезы. Н — нормальная ткань мозга; Ац II — астроцитома II стадии.
Приведенные данные свидетельствуют о связи ламинина-8 с прогрессией глиом.
Эти результаты были проверены с помощью полуколичест-венного иммуноблоттинга (рис. 4). Лизаты опухолей и нормальных тканей (всего 16 образцов) анализировали с помощью антител к цепям ламинина-8 и ламинина-9. Цепи ламинина-8
Таблица 1
Иммуногистохимическое выявление изоформ ламинина в нормальной ткани и опухолях головного мозга1
Гистологический диагноз Число случаев Ламинин-8 Ламинин-9
Норма 5 0 О2
ГБМ
1—11 стадии 7 0 7(100)
III стадия 7 2(28) 5(72)
IV стадия 21 15(71) 6(29)
' В скобках указаны проценты.
2 Низкий и вариабельный уровень ламинина-9 выявляется в нормальной ткани мозга.
выявлялись во всех 5 ГБМ и в 2 из 3 образцов астроцитом III стадии. Все 4 астроцитомы 1-Й стадий и 4 образца нормальной ткани мозга в основном содержали небольшое количество цепей ламинина-9. Выявлялся ламинин-9 в ГБМ и в 2 астроцитомах III стадии, но в меньшем количестве, чем ламинин-8.
В связи с тем что прогрессия опухолей приводит к усилению злокачественности, мы сравнили способность ГБМ к рецидивированию в зависимости от содержания ламинина-8 и ламинина-9. Среднее время безрецидивного течения болезни у 15 больных с ГБМ, содержащими ламинин-8, составляло всего 4,3 мес, в то время как этот показатель у 6 больных с ГБМ, содержащими ламинин-9, достигал 10,4 мес (р<0,05).
Мы впервые описали повышенную экспрессию а4-цепи ламинина в глиомах и соседних с ними тканях. Ламинин-8 (а4ріу1) выявлялся в большинстве ГБМ, а ламинин-9 (а4р2у1) в глиомах ранних стадий. Экспрессия ламинина-8 коррелировала с более быстрым рецидивированием ГБМ.-Можно предположить, что ламинин-8 играет роль в инвазии и прогрессии глиом. Он может являться ценным прогностическим фактором рецидивирования этих опухолей.
Повышенная экспрессия ламинина-8 в опухолях молочной железы
В дальнейших исследованиях важно было проверить, является ли экспрессия ламинина-8 специфичной для глиом или она свойственна и другим опухолям. С этой целью мы
а4-цепь
Р-актин
(31-цепь р-актин
|32-цепь
(3-актин
■р vw
щт *«* щ
«■мцф
Рисунок 4. Иммуноблоттинг цепей ламинина в тканях мозга.
В нормальной ткани мозга и в астроцитомах ранних стадий практически нет цепей ламинина-8. Две из 3 астроцитом III стадии и все 5 ГБМ экспрессируют цепи ламинина-8. При сравнении экспрессии р1 -цепи с экспрессией |32-цепи видно, что ламинина-8 больше, чем ламинина-9. Дорожки выравнивались по содержанию |3-актина. Н — нормальная ткань мозга; Ац I — астроцитома I стадии; Ац II — астроцитома II стадии; Ац III — анапластическая астроцитома III стадии; ГБМ IV — глиобластома IV стадии; ПК — положительный контроль.
исследовали с помощью иммунофлюоресценции 30 образцов тканей молочной железы человека, включая 19 образцов инфильтрирующего протокового рака, 3 образца метастазов протокового рака молочной железы в головной мозг, 3 образца протокового рака in situ и 5 образцов нормальной ткани молочной железы (табл. 2). Кроме ламинина, выявляли также кератины 8/18 (окраска клеток выстилающего эпителия и рака молочной железы) и фактор VIII (сосуды). Часть тканей также исследовали методом иммуноблоттинга.
Иммунофлюоресценция не выявила ламинин-8 в нормальной ткани молочной железы (табл. 2). В раке in situ в основном обнаруживался ламинин-9. В 84% образцов инфильтрирующего протокового рака и во всех метастазах была обнаружена яркая окраска сосудистых БМ на цепи ламини-на-8. Иммуноблотгинг полностью подтвердил данные иммуногистохимии (рис. 5). Таким образом, ламинин-8 отсутствовал в нормальной ткани молочной железы и появлялся в инфильтрирующих протоковых опухолях и их метастазах. Эти результаты очень сходны с полученными нами данными на глийльных опухолях мозга. Ламинин-8, очевидно, является маркером высокоинвазивных опухолей. Вполне возможно, что он может быть использован в будущем для разработки новых методов лечения рака.
Подавление опухолевой инвазии посредством блокирования экспрессии ламинина-8
В свете приведенных данных было важно изучить эффект ингибирования экспрессии ламинина-8 на инвазию опухолей. Мы провели исследование в культуре ткани, используя имеющиеся линии человеческих ГБМ. Метод кокультур позволил изучать вместе два основных типа клеток, встречающихся и соседствующих в глиомах, т. е. глиальные и эндотелиальные клетки. Нашей целью было блокирование экспрессии ламинина-8 в кокультурах для воздействия на инвазию. Для этого были выбраны антисенс-ОН, т. к. новое
поколение этих реагентов высокоэффективно in vitro и in vivo, специфично и лишено токсичности.
Антисенс-ОН препятствуют синтезу определенных белков. Они специфично связываются с мРНК и блокируют трансляцию [7]. Антисенс-ОН являются распространенными и надежными реагентами для изучения функции генов, регуляции генной экспрессии и взаимодействий между продуктами генов. В последние годы появились интересные данные об использовании антисенс-ОН в глиомах. Так, блокирование ММП-9 снижало инвазивность глиом в культуре [20]. Рост глиом у голых мышей подавляли антисенс-ОН к гену теломеразы [19]. Применение антисенс-ОН к гену рецептора IGF-I индуцировало апоптоз клеток глиом и приводило к улучшению состояния больных [2]. Клинические испытания антисенс-ОН проводятся для лечения и других типов опухолей человека.
Таблица 2
Иммуногистохимическое выявление изоформ ламинина
в нормальной ткани и опухолях молочной железы1
Гистологический диагноз Число случаев Ламинин-8 Ламинин-9
Норма 5 0 2(40)
Рак in situ 3 1 (33) 2(67)
Инфильтрирующий протоковый рак 19 16(84) 3(16)
Метастазы инфильтрирующего протокового рака в головной мозг 3 3(100) 0
1В скобках указаны проценты.
HM
HM
МРМЖ МРМЖ
а4-цепь
ß-актин
ßl-цепь
ß-актин
ß2-uenb
р-актин
Рисунок 5. Иммуноблоттинг цепей ламинина в тканях молочной железы и метастазов протокового рака в головной мозг.
В нормальной ткани молочной железы нет ламинина-8, но он сильно экспрессируется в метастазах. В метастазах ламинина-8 больше, чем ламинина-9 ((51-цепи больше, чем (52-цепи). Дорожки выравнивались по содержанию (5-актина. НМ — нормальная ткань молочной железы; МРМЖ — метастаз рака молочной железы в головной мозг.
Трудности применения этого подхода, связанные с неспе-цифичностью, нестабильностью и побочными эффектами, во многом решены новым поколением антисенс-ОН. К ним относятся пептидно-нуклеиновыеи Морфолино™-антисенс-ОН [32; 39]. Морфолино™-ОН не зависят от РНКазы Н, хорошо растворимы в воде, эффективны в среде без сыворотки и полностью резистентны к нуклеазам. Они имеют высокую аффинность к РНК и наивысшую специфичность из всех видов антисенс-ОН. Морфолино™-ОН высокоактивны в
ДеньЗ
День 6
X " І g 1 1 л-s I о “ £ сз ф “ оо § 1 е != Й
СО. “ + » і ■ со. s
т ,Як
щшшвяшшящшшяяшт-ьщщвяшт, й,. . . ШНР-
T98G
HBMVEC
HAST 040
0-
М059К
а4-цепь
ßl-цепь
р2-цепь
Рисунок 6. Иммуноблоттинг цепей ламинина в кондиционированной среде клеточных линий.
Эндотелий HBMVEC секретирует цепи ламинина-9 («4 и (52), астроциты HAST 040 не секретируют изучаемые цепи ламинина, а глиома М059К секретирует цепи ламинина-8 (а4 и (51)
культуре ткани [40], а также in vivo [3]. Пептидно-нуклеино-вые антисенс-ОН также водорастворимы, хотя и менее, чем Морфолино™-ОН. Они представляют собой уникальный тип информационной молекулы, содержащей основания нуклеиновых кислот, прикрепленные к пептидоподобной основе. Пептидно-нуклеиновые антисенс-ОН способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и могут быть использованы как универсальный носитель для биотинилиро-ванных пептидов [21].
Для кокультур мы использовали линии глиом U-87MG и М059К (из АТСС) и линию микроваскулярных эндотелиальных клеток мозга HBMVEC, полученную от д-ра К. Самою (Япония). Нормальные эмбриональные астроциты мозга человека HAST 040 были получены из Clonexpress, Inc. Соотношение типов клеток в растущих кокультурах определялось с помощью теста на поглощение ацетилированного липопротеида низкой плотности, который накапливается только в эндотелии [42].
Морфолино™-антисенс- и Морфолино™-сенс-ОН к генам цепей ламинина-8 а4 и pi получали из Gene Tools, Inc. (Мор-фолино — олигомер фосфородиамидат). Специальную инкубационную смесь держали с клетками 3 ч, затем меняли среду
200 кДа
200 кДа
200 КДа
200 кДа
День 6
240 кДа
240 кДа
В Г
Рисунок 7. Блокирование экспрессии ламинина-8 в кокультурах.
Иммуноблоттинг кондиционированной среды после инкубации кокультур НВМУЕС+М059К с Морфолино™-антисенс-ОН в течение 3 или 6 дней. А. —Альфа4-цепь ламинина (200 кДа). Ее количество снижается после обработки антисенс-ОН к генам а4-, |31-цепи и особенно их комбинации (а4+р1). Б. — Бета1 -цепь ламинина (230 кДа). Комбинация антисенс-ОН ка4+(51 также эффективно снижала концентрацию (51 -цепи в среде. В, Г. —Иммуноблоттинг человеческого фибронектина (240 кДа) как контроль количества белка, нанесенного на каждую дорожку. Антитела к ламинину удаляли с мембран, мембраны затем инкубировали с антителами к фибронектину. Т980, лизат клеток глиомы Т98в, которая синтезирует только ламинин-8 (положительный контроль антител). На дорожки наносились равные объемы среды.
Рисунок 8. Блокирование инвазии клеток через Матригель® с помощью антисенс-ОН.
После обработки кокультур антисенс-ОН фракция инвазирующих клеток существенно снижалась. Наиболее выраженный эффект наблюдался при использовании комбинации антисенс-ОН к а4+|31. Сходные данные получены для линий глиом М059К и 11-871\/Ю. * р<0,04. ** р<0,001. Инвазия в культурах, обработанных сенс-ОН, принята за 100%.
и культивировали клетки 3,5 или 7 дней. Экспрессию ламини-на определяли иммунофлюоресценцией и иммуноблоттин-гом. В последнем случае использовали кондиционированную среду кокультур, т. к. в клетках было слишком мало ламинина. Измерение инвазии проводили методом трансмиграции через Матригель® [1] с последующим подсчетом клеток, прошедших через Матригель®, и статистической обработкой данных.
Были выявлены следующие параметры экспрессии ламинина в культурах (рис. 6). Эндотелиальные клетки HBMVEC продуцировали цепи ламинина-9, а астроциты HAST 040 не экспрессировали ни одной из исследуемых цепей. В противоположность этому глиомы U-87MG и М059К секретирова-ли а4- и pi-цепи ламинина-8, но не р2-цепь ламинина-9. В кокультурах HBMVEC+HAST 040 выявлялись только цепи ламинина-9 (на рисунке не показано).
Кокультуры HBMVEC+M059K и HBMVEC+U-87MG экспрессировали цепи ламинина-8 и, слабо, ламинина-9. В этих условиях нормальный эндотелий начинал вырабатывать ламинин-8 под влиянием клеток глиом (не показано). Таким образом, исследуемые кокультуры были сходны с соответствующими тканями по характеру экспрессии ламини-нов. В нормальных кокультурах, как и в нормальной ткани мозга, выявлялся только ламинин-9; в кокультурах с глиомами, как и в опухолях, отмечалась экспрессия ламинина-8.
Обработка кокультур HBMVEC+M059K и HBMVEC+ U-87MG Морфолино-антисенс-ОН к генам а4- и pi-цепей ламинина приводила к существенному ингибированию экспрессии этих цепей через 3 или 6 дней инкубации (рис. 7). Наибольший эффект оказывала комбинация антисенс-ОН к a4+pi. Сходные результаты были получены иммуноблоттингом и иммунофлюоресценцией. Кокультуры эндотелия и глиом далее анализировали на инвазивность через Матригель® после обработки сенс- и антисенс-ОН. В основном через Матригель® проходили клетки глиом. Каждый антисенс ингибировал инвазию, а их комбинация была наиболее эффективна (рис. 8). В культуре клеток U-87MG иншбирование достигало 62%.
Пока неясно, каким образом ламинин-8 усиливает инвазию опухолей. Возможно, он стимулирует миграцию клеток.
Ранее было показано, что оба сплайс-варианта ламинина-8 слабо поддерживают адгезию клеток, но способствуют их миграции лучше, чем другие изоформы ламинина [9; 12]. Можно предположить, что увеличение экспрессии ламинина-8 как в •опухолях, так и в опухолевом эндотелии снижает адгезию, но увеличивает миграцию клеток глиом, способствуя инвазии.
Наши данные свидетельствуют о возможности антисенс-подхода для лечения опухолей (в частности, глиом) с использованием ламинина-8 в качестве мишени. Такое лечение могло бы препятствовать распространению опухолей, снижая их инвазивность. Его также можно было бы использовать в сочетании с традиционными видами лечения или с другими перспективными мишенями терапии, например EGFR или ММП. Другими средствами блокирования ламинина-8 могут быть специфические антитела или небольшие интерферирующие РНК.
Авторы благодарят д-ров Л. Сорокину, Д. Майнора, X. Фуд-живару, К Секигучи, Н. Петяяниеми, И. Виртанена, Т. Сасаки за предоставление антител, патолога д-ра В. Йонга за диагностические данные и сотрудников лаборатории д-ра М. Фуджи-ту, д-ра М. Ридингер, Н. Хазензон и A. JIaxmepa.
ЛИТЕРА ТУРА
1.AlbiniA., Iwamoto Y., Aaronson S. A., KozlowskiJ. М., McEwanR. N.
A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor ceils // Cancer Res. — 1987. — Vol. 47. — P. 3239—3245.
2. Andrews D. W., Resnicoff М., Flanders A E., Kenyon L., Curtis М., Merli G., Baserga R., Iliakis G., Aiken R. D. Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotide directed against the insulinlike growth factor type I receptor in malignant astrocytomas // J. Clin. Oncol. - 2001. - Vol. 19. - P. 2189-2200.
3. Arora V., Knapp D. C., Smith B. L., StatdfieldM. L., Stein D. A., Reddy М. Т., Weller D. D., Iversen P. L. c-Myc antisense limits rat liver regeneration and indicates role for c-myc in regulating cytochrome P-450 ЗА activity // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 2000. — \bl. 292. — P. 921—928.
4. Belkin A. М., Stepp M. A. Integrins as receptors for laminins // Microsc. Res. Tech. - 2000. - Vol. 51. - P. 280-301.
5. Bosnian P. Т., Havenith M. G., VisserR, Cleutjens J. P. Basement membrane in neoplasia// Prog. Histochem. Cytochem. — 1992. — \bl. 24. — P. 1—92.
6. Colognato H., Yurchenco P. D. Form and function: the laminin family ofheterotrimers I I Dev. Dyn. — 2000. — Vol. 218. — P. 213—234.
7. Dias N., Stein C. A. Antisense oligonucleotides: basic concepts and mechanisms // Mol. Cancer Ther. — 2002. — Vol. 1. — P. 347—355.
8. Duffy M. J., Maguire T. M., HillA., McDermott E., O’Higgins N. Metalloproteinases: role in breast carcinogenesis, invasion and metastasis // Breast Cancer Res. — 2000. — Vol. 2. — P. 252—257.
9. Fujiwara H., Kikkawa Y., Sanzen N., Sekiguchi K. Purification and characterization of human laminin-8. Laminin-8 stimulates cell adhesion and migration through a3pl and a6pi integrins // J. Biol. Chem. —
2001. - Vol. 276. - P. 17 550-17 558.
10. Grant D. S., Kibbey M. C., Kinsella J. L., Cid M. C., Kleinman H. K.
The role of basement membrane in angiogenesis and tumor growth // Pathol. Res, Pract. — 1994. — Vol. 190. — P. 854—863.
11. Guelstein V. I., Tchypysheva T. A., Ermilova V. D., LjubimovA. V. Myoepithelial and basement membrane antigens un benign and malignant human breast tumors // Int. J. Cancer. — 1993. — \fol. 53. — P. 269—277.
12. Hayashi Y., Kim K. H., Fujiwara H., Shimono C., Yamashita M.,
Sanzen N., Futaki S., Sekiguchi K. Identification and recombinant production of human laminin a4 subunit splice variants // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2002. — Vol. 299. — P. 498—504.
13. Hofmann U. B., Becker J. C., Bruecker E.-B. Bedeutung von matrix-degradierenden enzymen fuer die melanomprogression I I Haytarzt. —
2002. - Vol. 53. - P. 587-595.
14. Hudson B. G., Tryggvason K, Sundaramoorthy M., Neilson E. G. Alport's syndrome, Goodpasture's syndrome, and type IV collagen //
N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol. 348. — P. 2543-2556.
15. loachim E., CharchantiA., Briasoulis E., Karavasilis V., Tsanou H., Arvanitis D. L., Agnantis N. J., Pavlidis N. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression // Eur. J. Cancer. — 2002. —
Vol. 38. - P. 2362-2370.
16. Kaye A. H., Lam E. R. (eds.). Brain Tumors. —Churchill Livingsnone, 1997. - P. 1-990.
17. Kilic T., Pamir M. N., Kullu S., Eren F., Ozek M. M., Black P. M. Expression of structural proteins and angiogenic factors in cerebrovascular anomalies // Neurosurgery. — 2000. — Vol. 46. —
P. 1179-1191.
18. Kleinman H. K., Koblinski J., Lee S., Engbring J. Role of basement membrane in tumor growth and metastasis // Surg. Oncol. Clin. N.
Am. - 2001. - Vol. 10. - P. 329-338.
19. Komata T., Kondo Y., Koga S., Ko S. C., Chung L. W., Kondo S. Combination therapy of malignant glioma cells with 2-5A-antisense telomerase RNA and recombinant adenovirus p53 // Gene Ther. —
2000. - Vol. 7. - P. 2071-2079.
20. Kondraganti S., Mohanam S., Chintala S. K, Kin Y., Jasti S. L.,
Nirmala C., Lakka S. S., Adachi Y., KyritsisA. P., Ali-Osman F.,
Sawaya R., Fuller G. N., Rao J. S. Selective suppression of matrix metal-loproteinase-9 in human glioblastoma cells by antisense gene transfer impairs glioblastoma cell invasion // Cancer Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 6851-6855.
21. Lee H. J., Boado R. J., Braasch D. A., Corey D. R, Pardridge W. M. Imaging gene expression in the brain in vivo in a transgenic mouse model of Huntington's disease with an antisense radiopharmaceutical and drug-targeting technology // J. Nucl. Med. — 2002. — Vbl. 43. — P. 948—956.
22. Li S., Edgar D., FasslerR., Wadsworth W., Yurchenco P. D. The role of laminin in embryonic cell polarization and tissue organization // Dev. Cell. - 2003. - Vol. 4. - P. 613-624.
23. LjubimovA. V, BartekJ., CouchmanJ. R, KapullerL. L., Veselov V. V, KovarikJ., Perevoshchikov A. G., Krutovskikh V. A. Distribution of individual components of basement membrane in human colon polyps and adenocarcinomas as revealed by monoclonal antibodies // Int. J. Cancer. - 1992. - Vol. 50. - P. 562-566.
24. Ljubimov A. V, Krutovskikh V A. Distribution of laminin and collagen type IV in rat colon tumors induced by 1,2-dimethylhydrazine // Inv. Metast. - 1987. - Vol. 7. - P. 61-72.
25. LjubimovaJ. Y., LakhterA. J., LokshA.,Yong W. H., RiedingerM. S., Miner J. H., Sorokin M. L., LjubimovA. V, Black K L. Overexpression of a4 chain-containing laminins in human glial tumors identified by gene microarray analysis ¡I Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. —
P. 5601-5610.
26. LueL. P., BrachovaL., Walker D. G., Rogers J. Characterization of glial cultures from rapid autopsies of Alzheimer’s and control patients // Neurobiol. Aging. — 1996. — Vol. 17. — P. 421—429.
27. MaenpaaA., Kovanen P. E., PaetauA., Jaaskelainen J., Timonen T. Lymphocyte adhesion molecule ligands and extracellular matrix proteins in gliomas and normal brain: expression ofVCAM-1 in gliomas // Acta Neuropathol. (Berl.). — 1997. — Vol. 94. — P. 216—225.
28. Miner J. H., Patton B. L., Lentz S. I., Gilbert D. J., Snider W. D., Jenkins N. A., Copeland N. G., Sanes J. R. The laminin alpha chains: expression, developmental transitions, and chromosomal locations of a 1-5, identification of heterotrimeric laminins 8-11, and cloning of a novel cx3 isoform // J. Cell Biol. — 1997. - Vol. 137. - P. 685—701.
29. Muracciole X., Romain S., Dufour H., Palman J., Chinot O., Ouajik L., Grisoli F., BrangerD. F., Martin P. M. PAI-1 and EGFR expression in adult glioma tumors: toward a molecular prognostic classification //
Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. — 2002. — Vol. 52. — P. 592—598.
30. Nakano S., Tsuruta J., lyama K. Remodeling of basement membrane in association with cancer invasion // Rinsho. Byori. — 2000. —
Vol. 48. - P. 451-457.
31. Nerlich A. Morphology of basement membrane and associated matrix proteins in normal and pathological tissues // VerofF. Pathol. — 1995. — Vol. 145.-P. 1-139.
32. Nielsen P. E. Peptide nucleic acid targeting of double-stranded DNA// Methods Enzymol. — 2001. — Vol. 340. — P. 329—340.
33. Patarroyo M., Tryggvason K., Virtanen I. Laminin isoforms in tumor invasion, angiogenesis and metastasis // Semin. Cancer Biol. — 2002. — Vol. 12. - P. 197-207.
34. Qin H., Sun Y, Benveniste E. N. The transcription factors Spl, Sp3, and AP-2 are required for constitutive matrix metalloproteinase-2 gene expression in astroglioma cells//J. Biol. Chem. — 1999. — Vbl. 274. — P. 29 130-29 137.
35. Rabbani S. A., Mazar A. P. The role of plasminogen activator system in angiogenesis and metastasis // Surg. Oncol. Clin. N. Am. — 2001. — Vol. 10. - P. 393-415.
36. Sehgal A. Molecular changes during the genesis of human gliomas // Semin. Surg. Oncol. — 1998. — Vol. 14. — P. 3—12.
37. Shapiro W. R., Shapiro J. R. Biology and treatment of malignant glioma// Oncology. — 1998. — Vol. 12. — P. 233—240.
38. Sixt M., Engelhardt B., Pausch F., Hallmann R., WendlerO.,
Sorokin L. M. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis // J. Cell Biol. —
2001. - Vol. 153. - P. 933-946.
39. Summerton J., Weller D. Morpholino antisense oligomers: Design, preparation and properties //Antis. Nucl. Acid Drug Dev. — 1997. — Vol. 7. - P. 187—195.
40. Taylor M. F., PaulauskisJ. D., Weller D. D., Kobzik L. Comparison of efficacy of antisense oligomers directed toward TNF-a in helper T and macrophage cell lines // Cytokine. — 1997, — Vol. 9. — P. 672—681.
41. Ueki K, Nishikawa R., Nakazato K, Hirose T., Hirato J., Fuñada N., Fujimaki T., Hojo S., Kubo O., Ide T., Usui M., Ochiai C., Ito S., Takahashi H., MukasaA.,AsaiA., Kirino T. Correlation of histology and molecular genetic analysis of lp, 19q, lOq, TP53, EGFR, CDK4, and CDKN2A in 91 astrocytic and oligodendroglial tumors // Clin. Cancer Res. - 2002. - Vol. 8. - P. 196-201.
42. Voyta J., Via D., Butterfield E., Zetter B. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein //J. Cell Biol. — 1984. — Vol. 99. — P. 2034—2040.
43. Wetzels R. H., HollandR., van Haelst U. J., Lane E. B., Leigh L. M., Ramaekers F. C. Detection of basement membrane components and basal cell keratin 14 in noninvasive and invasive carcinomas of the breast //Am. J. Pathol. - 1989. - Vbl. 134. - P. 571-579.
