CC BY
14
Изменения в морфофункциональном статусе, росте и развитии печени крыс при воздействии наночастиц Mo и MoO3*
Е.В. Шей да, к.б.н, ФГБОУ ВО Оренбургский ГУ; ЕА Русакова, к.б.н., Е.А. Сизова, д.б.н., ФГБОУ ВО Оренбургский ГУ, ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН, О.Ю. Сипайлова, к.б.н., ФГБОУ ВО Оренбургский ГМУ; Д.Б. Косян, к.б.н, ФГБНУ ФНЦ БСТ РАН
Прогресс в сфере нанотехнологий стимулирует потребительский рынок и увеличение потребления материалов и продуктов, связанных с ним. Обозначенная тенденция подтверждается областью применения наноматериалов в различных сегментах, включая продукты питания, электронику, фармацевтику, биотехнологию, косметику, здравоохранение и сельское хозяйство [1, 2]. Именно поэтому многие наночастицы (НЧ) всё больше и больше синтезируются с исключением в них возможных токсических эффектов [3].
Наночастицы имеют чрезвычайно малые размеры и демонстрируют механические, оптические, магнитные и химические свойства, отличные от других частиц. Использование этих свойств НЧ являются основой нанотехнологий [4]. Тем не менее свойства, делающие наноматериалы такими привлекательными, как, например, малый размер, разнообразная форма и высокая площадь поверхности, также могут быть причиной загрязнения окружающей среды и оказывать вредное воздействие на жизнь и здоровье людей и других живых организмов [5—8]. Так, НЧ молибдена и его три-оксида (Мо и МоО3), обладая уникальными свойствами и используемые в качестве антимикробных и противогрибковых препаратов [9, 10], обладают и достаточно высокой токсичностью на живые организмы. Поэтому целью нашего исследования явилось изучение воздействия НЧ Mo и MoO3 на рост и развитие печени крыс, выявление гепато-тропного эффекта с оценкой выраженности и обратимости морфологических изменений в печени.
Материал и методы исследования. Биомедицинские исследования проводили на 100 белых крысах-самцах линии Wistar массой 110—180 г. До начала эксперимента животные содержались в условиях экспериментально-биологической клиники ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет» на стандартной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) согласно правилам лабораторной практики при
проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Эксперименты проводили в соответствии с требованиями гуманного обращения с животными [4].
В качестве источников микроэлементов использовали НЧ Mo и MoO3 (табл.).
Оба образца были получены методом плазмохи-мического синтеза. Размеры частиц оценивали на основе измерений удельной поверхности, для чего использовали прибор Sorbi®-M (Meta®, Россия). Микроструктуру порошков анализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа PhilipsCM-30 (Philips, Япония). Для определения фазового состава использовали дифрактометр RigakuD/MAX-2200VL/PC (Rigaku, Япония), излучение СиКб.
НЧ Mo в своём составе содержали не менее 99,7% Mo и 0,30% О2 размером 50,0+0,56 Нм, с удельной поверхностью 14,0 м2/г. НЧ MoO3 в своём составе содержали 99,8% MoO3 и 0,20% О2 размером 92,0+0,54 Нм, с удельной поверхностью 12,0 м2/г.
При получении лиозолей водные взвеси УДЧ Mo и MoO3 обрабатывали ультразвуком на диспер-гаторе УЗДН-2Т («НПП Академприбор», Россия) при 35 кГц, 300/450 Вт, 10 мкА в течение 30 мин. Лиозоли НЧ вводили однократно внутрибрюшинно.
Все экспериментальные животные были разделены на пять групп (n = 6). Животные содержались в одинаковых условиях, с одинаковым рационом. Контрольную и опытные группы сформировывали из животных одного возраста. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Животным I и II опытных гр. однократно внутрибрюшинно вводили НЧ Mo в дозе 1,0 мг/кг и 25,0 мг/кг; животным III и IV опытных групп — НЧ MoO3 в дозе 1,2 мг/кг и 29,0 мг/кг соответственно. Животным контрольной гр. вводили изотонический раствор хлорида натрия 0,9% в эквивалентном объёме. Выбранные концентрации ультрадисперсных частиц не превышали максимальных переносимых доз (МПД) для данного металла. Животных взвешивали каждые три дня в течение всего периода исследования. По окончании эксперимента (14-е сут.) крыс декапировали под нембуталовым наркозом. После этого проводили анатомическую разделку и взвешивание внутренних органов животных.
Характеристика используемых НЧ Mo и MoO3
№ образца НЧ Удельная Размер, Нм Фазовый состав, %
поверхность, м2/г Mo O2
1 2 Mo MoO3 14,0 12,0 50,0±0,56 92,0±0,54 99.7 99.8 0,30 0,20
* Работа выполнена при поддержке областного гранта по соглашению №36 от 31.07.2018 г.
Контроль за ростом особей осуществлялся ежедневно путём индивидуального взвешивания, утром, до кормления (±2 г). На основании результатов взвешивания были рассчитаны абсолютный и среднесуточный приросты, изучена динамика роста подопытных животных, а также отношение массы печени к массе тела. Биоматериал для исследования получали после декапитации крыс под нембуталовым наркозом (5 особей в каждом варианте опыта и в контроле на 1-е, 7-е и 14-е сут. Затем животных препарировали, проводили анатомическую разделку (кости, кожа, скелетная мускулатура, внутренние органы) с последующим взвешиванием, измельчением и формированием средней пробы (10 г) по каждой особи.
Для морфологического исследования на свето-оптическом уровне кусочки печени фиксировали в 10-процентном нейтральном формалине и заливали в парафиновую смесь HistoMix (ООО «БиоВитрум», Россия). Морфологический состав образцов ткани печени оценивали на гистологических срезах толщиной 5—6 мкм, изготовленных на полуавтоматическом микротоме (МЗП 01 — «Техном», Россия) и окрашенных гематоксилином и эозином.
Основные данные, полученные в исследовании, были обработаны с использованием программ «Excel» и «Statistica 6,0».
Результаты исследования. Было изучено влияние наночастиц Mo и MoO3 на массу внутренних органов крыс.
Концентрация 1,0 мг/кг НЧ Mo способствовала максимальному изменению массы лёгких и почек животных в сторону их увеличения на 14,9 и 7,22%
относительно контрольного образца. Кроме того, среди общей тенденции увеличения массы органов отмечалось снижение массы селезёнки, печени и сердца у крыс опытных групп на 14,6; 14,5 и 10,5% при сравнении с контролем (рис. 1А).
Воздействие 25,0 мг/кг НЧ Мо привело к наибольшему увеличению массы лёгких у особей
II опытной гр. — на 48,3% больше, чем в контроле. При воздействии данной концентрации НЧ Мо проявилось снижение массы селезёнки, сердца, печени и почек на 19,1; 17,9; 16,3 и 8,33% у крыс I, II, III и IV опытных групп по сравнению с аналогами контрольной гр.
Максимальные скачки в изменении массы (снижение массы) при концентрации 1,2 мг/кг НЧ Мо03 отмечались среди таких органов животных
III опытной гр., как сердце (на 41,8%), печень (33,7%), почки (29,3%) и селезёнка (22,8%) при сравнении с показателями у крыс контрольной гр. Увеличение массы лёгких при этом было незначительным — на 4,33% относительно контрольных значений (рис. 1В).
Примечательно, что концентрация НЧ Мо03 29,0 мг/кг способствовала равномерному увеличению массы таких органов, как почки и селезёнка на 5,93 и 2,03% у крыс IV опытной гр. при сравнении с аналогами контрольной гр. Вместе с тем было отмечено максимальное увеличение массы печени (на 21,3%) относительно контроля. Концентрация НЧ Мо03 в количестве 29,0 мг/кг приводила к изменениям в сторону уменьшения массы сердца на 3,51% у крыс IV опытной гр. в отличие от показателей у животных контрольной гр. (рис. 1Г).
Рис. 1 - Изменение массы внутренних органов крыс при воздействии различных концентраций НЧМо и Мо03: А - 1,0 мг/кг НЧМо; В - 25,0 мг/кг НЧМо; С - 1,2 мг/кг НЧМо03; D - 29,0 мг/кг НЧМо03
Рис. 2 - Печень крыс при введении УДЧМо и Мо03 в различных концентрациях:
а - на 7-е сутки после введения 1,0 мг/кг УДЧ Мо. Увеличение: 40x10; б - на 14-е сутки после введения 1,0 мг/кг УДЧ Мо. Увеличение: 10x10; в - на 7-е сутки после введения 25,0 мг/кг УДЧ Мо. Увеличение: 10x10; г-на 7-е сутки после введения 1,2 мг/кг УДЧМо03. Увеличение: 40x10; д-на 14-е сутки после введения 29,0 мг/кг УДЧ МоО3. Увеличение: 40x10. Окраска: гематоксилином и эозином
В ходе исследования было изучено влияние НЧ Мо и Мо03 на морфофункциональный статус печени крыс. Внутрибрюшинное введение 1,0 мг/кг НЧ Мо (I опытная гр.) на 1-е сутки наблюдения не оказало влияния на общую структурную организацию печени. Тем не менее выявлено мутное набухание цитоплазмы гепатоцитов, стёртость их границ при сохранении балочного строения дольки, а также преобладание гепатоцитов с увеличенными, гиперхромными ядрами и крупными ядрышками. 7-е сутки наблюдения показали наличие процессов нарушения кровообращения в виде полнокровия всей ткани печени с расширением просвета меж-дольковых, центральных вен и внутридольковых синусоидов. Очагами обнаружены эритроцитарные «сладжи» и стазы в просвете центральных вен и синусоидов. Гепатоциты, преимущественно в центре долек, находились в состоянии мелковакуольной дистрофии. Отдельно выявлялись группы некро-тизированных гепатоцитов (рис. 2а). Обратимость патологических процессов подтверждает оценка ткани печени на 14-е сутки после введения 1,0 мг/кг НЧ Мо, когда произошло снижение полнокровия и спад просветов центральных вен и межбалочных синусоидов, а также тяжести дистрофических изменений в гепатоцитах. Дистрофия приобрела зернистый и очагами мелковакуольный характер, с преимущественной локализацией в центральной части печёночной дольки (рис. 2б).
Инъекция животным внутрибрюшинно 25,0 мг/кг НЧ Мо (II опытная гр.) через сутки привела к следующим изменениям в гистологической
картине печени крыс: появление пестрой окраски гистосреза, создаваемой чередованием обширных участков дистрофических измененных гепатоцитов с очагами ткани, приближенных по гистологии к норме. Гепатоциты в состоянии дистрофии имели мутную гомогенную цитоплазму, местами с мелковакуольными включениями. Границы ге-патоцитов стерлись при сохранении балочного строения. Через 7 суток после введения указанной дозы НЧ Мо вышеописанные изменения были отягощены усилением полнокровия всех структур печени с расширением и междольковых сосудов, центральных вен и внутридольковых синусоидов, а также крупными очагами некрозов гепатоцитов с нарушением балочного строения и потерей границ долек (рис. 2в). На 14-е сут. наблюдения морфологическая картина улучшилась незначительно. По-прежнему наблюдался тяжелый вакуольный гепатоз. Встречались мелкие, состоящие из нескольких гепатоцитов, очаги некрозов. Балочное строение изменилось. Границы долек стерлись.
Внутрибрюшинное введение 1,2 мг/кг НЧМо03 (III опытная гр.) уже через сутки отразилось на гистологической характеристике печени животных. Орган приобрел пеструю окраску: крупные очаги гепатоцитов в состоянии дистрофии и нарушением балочной архитектуры печеночной дольки чередовались с очагами сохраненной структуры печени. Ядра гепатоцитов были увеличены, гиперхромные с крупными ядрышками. По всей поверхности срезов печени выявлялось усиленное полнокровие с расширением просветов центральных вен
и межбалочных синусоидов. Оценка гистосрезов на 7-е сутки после инъекции выявила усиленное полнокровие с развитием стазов в центральных венах, а также обширные участки мелкокапельной дистрофии гепатоцитов (рис. 2г). На 14-е сутки наблюдалось снижение патологических сдвигов. Нарушение кровообращения проявилось в относительно умеренном полнокровии печёночной ткани. Вакуольная дистрофия отмечалась в основном в центральных зонах долек. Как проявление компенсаторных механизмов, наблюдалось усиление функциональной активности неповреждённых гепатоцитов, что проявлялось в увеличении размеров клеток и ядер, а также их гиперхромии.
На 1-е сутки после введения 29,0 мг/кг НЧ Мо03 (IV опытная гр.) отмечалось полнокровие печени, выраженное во всей портальной системе сосудов. Характер дистрофических изменений гепатоцитов в основном зависел от места локализации в дольке. По периферии долек дистрофия была преимущественно зернистая, в центральных частях — мелковакуольная. Границы долек на отдельных участках были стёрты. Выявлялись крупные поля печёночной ткани с сохранением структуры, приближенной к норме, с повышенной активностью гепатоцитов. На 7-е сутки патологические сдвиги прогрессировали. Во всех полях гистологических срезов печени определялось усиленное полнокровие с развитием стазов в центральных венах. Обширные участки дистрофии гепатоцитов распространялись на большую часть печёночных долек. Дистрофия преимущественно носила мелковакуольный характер. 14-е сутки наблюдения демонстририровали усиление в ткани органа некробиотических изменений с развитием тяжёлой диффузной крупнокапельной вакуольной дистрофии и появлением некротизированных групп гепатоцитов (рис. 2д).
Выводы. В результате однократного внутрибрю-шинного введения НЧ молибдена и его триоксида отмечается снижение абсолютной массы тела и печени у животных, исключение составили животные, получившие Мо03 в дозе 29 мг/кг. Эти данные перекликаются с результатами исследований некоторых авторов, указывающих на снижении массы тела животных при введении НЧ [11, 12]. Дозы НЧ Мо и Мо03 и экспозиция времени после инъекции напрямую влияют на уровень повреждения ткани печени и морфологические изменения, обратимость данных процессов.
Гепатотропный эффект обратимого характера показали все изучаемые НЧ, однако введение их в больших дозировках сопровождалось серьёзными патологическими изменениями в структуре печени, что проявлялось в появлении обширных участков крупновакуольного гепатоза и очагов некроза. При введении НЧ в меньших дозировках (1 мг/кг — НЧ Мо и 1,2 мг/кг — НЧ МоО3) выраженных структурных изменений в гепатоцитах и паренхиме
печени не отмечалось, а умеренное полнокровие, признаки зернистой дистрофии, гипертрофия ге-патоцитов и гиперхромия их ядер носили скорее адаптивный характер.
В основе нарушения кровоснабжения органа может лежать и способность НЧ Mo и MoO3 к агрегации (вследствие развитой удельной поверхности и избыточной поверхностной энергией Гиббса) с последующей эмболией сосудов микроциркуля-торного русла печени и развитием гипоксических повреждений клеток [13].
Учитывая накопленные данные по исследованию токсических эффектов НЧ, необходимо принять во внимание и возможность прямого ци-тотоксичекого воздействия нанометаллов на клетки организма, в том числе и печени. По мнению ряда авторов [14], прямое действие может быть обусловлено непосредственным действием наноматериала на клетку: механическое повреждение мембраны клетки и/или отдельных её органелл, также снижение её эффективной площади вследствие сорбции наночастиц, накопление в цитоплазме, денатурирующее действие на белки и т.п.
Литература
1. Moore MN. Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic environment? Environ Int. 2006; 32:967-76.
2. Chen X, Schluesener H J. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. ToxicolLett. 2008; 176(1):1-12.
3. Lovern SB, Strickler JR, Klaper R. Behavioral and physiological changes in Daphnia magna when exposed to nanoparticle suspensions (titanium dioxide, nano-C60, and C60Hx- C70Hx). Environ Sci Technol. 2007; 41(12):4465-70.
4. Simonet BM, Valcárcel M. Monitoring nanoparticles in the environment. Anal Bioanal Chem. 2009; 393(1):17-21.
5. Wei L, Thakkar M, Chen Y, Ntim SA, Mitra S, Zhang X. Cytotoxicity effects of water dispersible oxidized multiwalled carbon nanotubes on marine alga Dunaliellatertiolecta. AquatToxicol. 2010; 100(2):194-201.
6. Gong N, Shao K, Feng W, Lin Z, Liang C, Sun Y. Biotoxicity of nickel oxide nanoparticles and bio-remediation by microalgae Chlorella vulgaris. Chemosphere. 2011; 83(4):510-6.
7. Petersen EJ, Zhang L, Mattison NT, O'Carroll DM, Whelton AJ, Uddin N, Nguyen T, Huang Q, Henry TB, Holbrook RD, Chen KL. Potential release pathways, environmental fate, and ecological risks of carbon nanotubes. Environ Sci Technol. 2011; 45(23):9837-56.
8. Lapresta-Fernández A, Fernández A, Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms. Trends Anal Chem. 2012; 32:40-59.
9. Fakhri A., Nejad P.A. Antimicrobial, antioxidant and cytotoxic effect of Molybdenum trioxide nanoparticles and application of this for degradation of ketamine under different light illumination. J. Photochem. Photobiol. B, 2016, 159: 211-217 (doi: 10.1016/j. jphotobiol.2016.04.002).
10. Zhang W., Shi S., Wang Y., Y u S., Zh u W., Zhang X., Zhang D., Yang B.,Wa ng X., Wang J. Versatile molybdenum disulfide based antibacterial composites for in vitro enhanced sterilization and in vivo focal infection therapy. Nanoscale, 2016, 8(22): 11642-11648 (doi: 10.1039/c6nr01243d).
11. Fardin Assadi a, Hamid Reza Amirmoghadami b, MojghanShamseddin c, KeivanNedaei d , AzamHeidari e / Effect of Molybdenum Trioxide Nanoparticles (MoO3 NPs) on Thyroid Hormones in Female Rats Journal of Human / Environment and Health Promotion. 2016; 1(4):189-195.
12. Asadi F, Mohseni M, Dadashi N K, et al. / Effect of Molybdenum nanoparticles on blood cells, liver enzyme and sexual hormones in male rars / Biological Trace Element Research. 2016.
13. Griffitt R.J., Weil R., Hyndman K.A., Denslow N.D., Powers K., Taylor D., Barber D.S. Exposure to copper nanoparticles causes gill injury and acute lethality in Zebrafish (Daniore-rio) // Environ Sci Technol. 2007. V. 41(23). P. 8178-860.
14. Heinlaan M., Ivask А., Blinova I., Dubourguier H.C., Kahru A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalusplatyurus // Chemosphere. 2008. V. 71(7). P. 1308-16.
