CC BY
57
УДК 616.36-002-022:578.891
И.А. Гончарова, С.Я. Жанаева, О.А. Левина, О.В. Фаламеева, Т.А. Короленко
ИЗМЕНЕНИЕ ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ СТИМУЛЯЦИИ И ДЕПРЕССИИ МАКРОФАГОВ У КРЫС ВИСТАР С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ
ГУ НИИ физиологии СО РАМН
Муниципальная инфекционная клиническая больница № 1, Новосибирск
Цель работы - изучить нарушения функции печени и роль печеночных макрофагов - клеток Купфера- при развитии острого токсического гепатита, вызываемого введением высоких доз ацетаминофена. Показано, что однократное введение ацетаминофена крысам Вистар в дозе 1000 мг/кг сопровождается развитием острого токсического гепатита с выраженным синдромом цитолиза с очагами некроза в центролобуляр-ной зоне дольки печени. Предварительное введение (за сутки до ацетаминофена) стимуляторов макрофагов - карбоксиметилированного Р-1,3-Б-гликана, Украина - предотвращало развитие острого токсического гепатита, что подтверждается биохимическими и морфологическими данными. Менее выраженный защитный эффект показан при предварительном введении крысам хлористого гадолиния. Одновременное введение реаферона и ацетаминофена крысам значительно снижало выраженность цитолитического процесса в печени. Стимуляция макрофагов печени предотвращала поражающее действие ацетаминофена на печень крыс._____________________
Ключевые слова: гепатит, ацетаминофен, макрофаги
Известно, что высокие дозы ацетаминофена (АцФ, парацетамол, панадол) у человека могут приводить к острой печеночной недостаточности, сопровождающейся центролобулярной дегенерацией и некрозом гепато-цитов [1, 9, 11, 14]. Токсичность ацетаминофена обусловлена взаимодействием его реактивного метаболита К-ацетил-р-бензоквинона с белками печени и снижением уровня глютатиона в гепатоцитах [5, 6].
Высказано предположение, что изменение функциональной активности непаренхиматозных клеток печени (макрофагов, эндотелиальных клеток) имеет существенное значение в проявлении токсического действия ацетаминофена на печень [13]. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты с целью исследования изменений функции печени и роли печеночных макрофагов - клеток Купфера (КК) при развитии острого токсического гепатита, вызываемого введением высоких доз ацетаминофена.
Методка. Работа выполнена на самцах крыс Вистар массой 250-320 г (виварий Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Для воспроизведения острого токсического гепатита с помощью гастрального зонда после кратковременного эфирного наркоза животным вводили АцФ (”ICN Biomedicals”, США) в дозе 1000 мг/кг в 1% крахмальной взвеси. Согласно литературным данным, при однократном введении АцФ в дозе более 300 мг/кг через 24 ч наблюдаются наиболее значительные изменения в печени [9].
С целью коррекции патологического состояния в следующей серии экспериментов предварительно вводили иммуномодуляторы: карбоксиметилированный
(1^3)-р-D-глюкан (КМГ), (Химический институт Словацкой АН, Братислава) в дозе 25 мг/кг однократно внутрибрюшинно; Украин (”Nowicky Pharma”, Austria) - препарат растительного происхождения, производное Чистотела большого (Chelidonium М.) в дозе 2 мг/кг
Рис. 4. Динамика психомоторной активности здоровых лиц по показателям двигательной реакции правой и левой руки (по тесту “линеограммы”, совершивших широтный перелет с Востока на Запад через 7 часовых поясов (п=64).
Фон - показатели до перелета. Достоверность различий по отношению к фону *** -р<0,001; ** -р<0,01
однократно внутривенно; реаферон-ЕС (ДГУ ПП “Век-тор-Фарм”) (интерферон-а, с успехом применяющийся при вирусном гепатите) вводили в дозе 100 000 ЕД на крысу внутрибрюшинно однократно. Как модель депрессии макрофагов использовали предварительное однократное внутривенное введение хлористого гадолиния (GdCl3) в дозе 7,5 мг/кг. Забой животных осуществляли через 24 ч после введения препаратов; умерщвляли путем декапитации. Полученную кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. В сыворотке крови определяли активность ферментов печени - ала-нинаминотрансферазу (АлТ), аспартатаминотрасферазу (АсТ) кинетическим УФ-методом с помощью наборов фирмы “Biocon” (Германия).
Контроль качества данных исследований проводили, используя лиофилизированные контрольные сыворотки на основе человеческой крови с известным содержанием компонентов (фирма “Biocon”, Германия). Исследования выполнены на биохимическом анализаторе COBAS E MIRA (”La Roch”, Австрия). Активность хи-тотриозидазы оценивали, используя флуоресцентный субстрат 4-метилумбеллиферил-Р-D-N-N’-N’’ - триаце-тилхитотриозид (”Sigma”, США; любезно предоставлен проф. Wevers R., Голландия) [3]. Инкубацию проводили при pH 5,2 в течение 30 мин; использовали 10 мкл сыворотки крови и 200 мкл 22 мМ раствора субстрата в фосфатном Mellvain буфере. Для остановки реакции применяли 2,0 мл 0,15 М глицинового буфера рН 10,6. Флуоресценцию измеряли при 360 нм (возбуждение) и 455 нм (эмиссия) на спектрофлуориметре PERKIN ELMER 650-10S (Япония). Результаты выражали в нмоль освобожденного метилумбеллиферона (МУФ)/мл/ч.
Для гистологического анализа кусочки печени животных фиксировали в 12% растворе формалина; парафиновые срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.
Статистическая обработка результатов проведена с помощью прикладной программы “Microsoft Excel” с вычислением среднего арифметического (М) и ошибки среднего арифметического (m). Достоверность различий экспериментальных данных рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента (достоверным считали различия при р<0,05).
Результаты. При изолированном введении крысам АцФ в дозе 1000 мг/кг была успешно воспроизведена экспериментальная модель токсического гепатита. При этом активность АлТ и АсТ увеличилась в 9,8 и 14,8 раза соответственно по сравнению с интактными животными (p<0,001) (табл. 1). Макроскопически печень крыс этой группы была дряблой на ощупь с бледно-серыми очагами; масса органа - в 1,5 раза больше, чем у интактных животных (9,9±0,3 г и 6,4±0,3 г соответственно; p<0,05). При морфологическом исследовании в печени подтверждено развитие острого токсического гепатита, проявлявшегося дискомплексацией балок с массивными зональными некрозами, преимущественно в центролобуляр-ной зоне (до 25-30% площади дольки); резко выраженным полнокровием сосудов и синусоидов. В зоне некрозов отмечена полинуклеарная инфильтрация с преимущественной локализацией в демаркационной зоне. В очагах некрозов и в паренхиме органа выявлено некоторое количество телец Маллори. Сохраненные гепатоци-
ты вокруг зон некрозов были в состоянии выраженной мелко- и средневакуолярной дистрофии (местами - баллонной дистрофии). Эти данные свидетельствуют о развитии выраженного острого токсического гепатита, что совпадает с известными литературными данными [14]. Явления альтерации сопровождались развитием слабо выраженных компенсаторных механизмов: встречались единичные диплоидные гепатоциты, а также увеличенные в объеме клетки с гипертрофированными гиперх-ромными ядрами.
При изолированном введении крысам Украина (в дозе 2 мг/кг однократно внутривенно), КМГ (в дозе 25 мг/кг однократно внутрибрюшинно) и хлористого гадолиния (в дозе 7,5 мг/кг однократно внутривенно) активность АлТ колебалась от 98,8±6,24 до 149,2±9,50 ЕД/л и не отличалась от активности фермента у интактных крыс (табл. 1). Активность АсТ в этих группах также соответствовала значениям интактных животных (табл. 1). При введении этих препаратов общая структура печени оставалась неизмененной и имела характерное дольчатое строение. В перицентральной зоне дольки наблюдали единичные гепатоциты с признаками гидропической дистрофии. Изолированное введение реаферона-ЕС ин-тактным крысам вызывало увеличение активности АлТ и АсТ (табл. 1), указывающее на незначительное изменение функциональной активности печени. Отсутствие изменений структуры печени в этой группе подтверждают и данные гистологического исследования, однако в некоторых гепатоцитах имели место признаки мелкозернистой дистрофии, более выраженные в перипорта-льной зоне. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии гепатотоксического эффекта указанных препаратов.
В следующей серии экспериментов коррекцию токсического гепатита проводили предварительным введением иммуностимулятора КМГ (за сутки до АцФ). Обнаружено, что активность АлТ и АсТ снижалась в 10,0 и 19,6 раза соответственно по сравнению с активностью ферментов у крыс с изолированным введением АцФ (р<0,01 по сравнению с контролем) и приближалась к активности фермента у интактных животных (табл. 1). Микроскопическое исследование печени выявило значительно меньшую степень морфологических изменений в структуре органа по сравнению с группой неле-ченных животных. Значительно уменьшились площади некрозов, отсутствовали массивные зональные очаги некрозов, однако сохранялась небольшая очаговая гиперемия портальных сосудов и синусоидов, очаговая мелкокапельная дистрофия гепатоцитов. Эти данные свидетельствуют о значительном уменьшении выраженности цитолитического процесса под влиянием КМГ.
Активность АлТ и АсТ в сыворотке крови крыс с предварительным введением иммуномодулятора Украина (за сутки до введения АцФ) была в 6,3 и 10,7 раза ниже, соответственно, чем в группе нелеченных животных (р<0,01) (табл. 1). Микроскопически балочное строение долек печени было сохранно, но отмечались очаги микронекрозов. Синусоиды были сужены; часть гепатоцитов находилась в состоянии вакуольной дистрофии. Внутри долек формировались небольшие клеточные инфильтраты из мононуклеаров, в портальных трактах -редкая мононуклеарная инфильтрация.
При введении реаферона-ЕС в дозе 100 000 ЕД на крысу внутрибрюшинно однократно (одновременно с АцФ) активность АлТ и АсТ соответствовала значениям интактных животных (табл. 1). Морфологический анализ показал, что, несмотря на отсутствие обширных очагов некрозов, имели место некоторая гомогенизация ге-патоцитов в центролобулярной зоне и выраженные признаки вакуольно-гидропической и зернистой дистрофии с расширением и полнокровием синусоидов; наблюдалась умеренная полиморфно-клеточная инфильтрация ткани с примесью мононуклеаров.
В группе крыс с предварительным (за сутки до АцФ) введением вёС1з (с целью селективной депрессии макрофагов печени) активность АлТ и АсТ в сыворотке крови была в 3-4 раза ниже, чем в группе с изолированным введением АцФ (р<0,05) (табл. 1). Морфологическая картина печени характеризовалась уменьшением зоны центролобулярных очагов некрозов по сравнению с группой животных с острым токсическим гепатитом.
Хитотриозидаза (ХТ) - новый лизосомальный фермент макрофагов, резкий подъем активности которого в сыворотке крови обнаружен при болезни Гоше [7]. Ранее нами показано, что у интактных крыс Вистар активность ХТ сыворотки крови приближалась к значениям, полученным в сыворотке крови человека и составляла 18,4± 2,98 нмоль МУФ/мл/ч, что сопоставимо с исследованиями ХТ у человека (табл. 2). Стимулятор макрофагов КМГ повышал активность ХТ у крыс, что сопровождалось увеличением числа непаренхиматозных, преимущественно Купферовских, клеток [3]. Депрессия макрофагов печени, вызываемая с помощью хлористого гадолиния, подавляла активность ХТ сыворотки крови крыс почти в 2 раза [3]. Эти данные дают возможность говорить, что именно стимуляция макрофагов вызывает повышение активности ХТ. В настоящем исследовании показано, что при введении АцФ крысам наблюдалось значительное повышение активности ХТ под воздействием токсического фактора (57,5±14,3 нмоль МУФ/мл/ч; р<0,05 по сравнению с контролем). В группе с изолированным введение иммуномодулятора реаферона-ЕС в дозе 100 000 ЕД на крысу также несколько повышена активность ХТ (27,5±7,46 нмоль МУФ/мл/ч). Одновременное введение реаферона-ЕС и АцФ крысам снижало активность ХТ до 39,4±8,11 нмоль МУФ/мл/ч, приближаясь к значениям у интактных животных.
Таким образом, как показано в нашем исследовании, однократное пероральное введение АцФ в дозе 1000 мг/кг крысам Вистар вызывало развитие “молниеносной” формы острого токсического гепатита. Высокие дозы АцФ приводят к острой печеночной недостаточности, сопровождающейся центролобулярной дегенерацией и некрозом гепатоцитов у человека и экспериментальных животных [14]. Механизм АцФ-индуцирован-ной токсичности включает в себя разрыв нескольких биохимических путей (истощение глютатиона гепатоцитов, ковалентную модификацию белков-мишеней, кислородный стресс, хромосомные аберрации, нарушение кальциевого гомеостаза) [8,11]. Токсичность АцФ обусловлена взаимодействием его реактивного метаболита К-ацетил-р-бензоквиона с белками плазмы крови и снижением уровня глютатиона в гепатоцитах [15]. Показано, что АцФ истощает запасы глютатиона в печени
in vivo и в культуре гепатоцитов in vitro [10]. Известно, что у мышей увеличение концентрации печеночного глютатиона оказывало защитный эффект при введении высоких доз АцФ. Показано, что инактивация клеток Купфера (и других макрофагов) снижает токсичность АцФ [4, 11].
При предварительном введении реаферона-ЕС нами выявлен выраженный гепатопротективный эффект, проявляющийся в уменьшении выраженности цитолитиче-ского синдрома и морфологических изменений, характерных для острого токсического АцФ гепатита. Судя по повышенным значениям активности ХТ, отмечена активация клеток Купфера. Известно, что активация КК способствует повышению синтеза оксида азота и супероксида [10].
Интерфероны относятся к средствам, которые могут влиять на возбудителя инфекции опосредованно, моби-лизируя определенные защитные механизмы. Ставка при использовании интерферонов должна делаться не на действие их как медикаментов, а как на стимул, с рассчетом на ответное эндогенное производство активных субстанций и реализацию эволюционно сложившихся механизмов защиты организма [2].
Выводы. Однократное пероральное введение АцФ крысам Вистар в дозе 1000 мг/кг в течение первых суток сопровождается развитием острого токсического гепатита с выраженным синдромом цитолиза и характерными неспецифическими структурными изменениями в центролобулярной дольке печени, возникающими при острых отравлениях.
Стимуляторы макрофагов - КМГ, Украин и реафе-рон-ЕС, а также хлористый гадолиний, вызывающий селективную депрессию макрофагов печени, - не являются гепатотоксичными.
Предварительное введение (за сутки до АцФ) стимуляторов макрофагов - КМГ, Украина и реаферона-ЕС -предотвращает развитие острого токсического гепатита, что подтверждается биохимическими и морфологическими данными. Менее выраженный защитный эффект показан при предварительном введении крысам хлористого гадолиния.
Одновременное введение реаферона-ЕС крысам с АцФ гепатитом значительно снижает выраженность ци-толитического процесса в печени.
Токсическое поражение печени АцФ вызывает активацию макрофагов, судя по увеличенной активности ХТ сыворотки крови крыс.
LIVER FUNCTION TESTS DURING MACROPHAGE STIMULATION AND DEPRESSION OF WISTAR RATS WITH TOXIC HEPATITIS
I.A. Goncharova, S.Ya. Zhanaeva, O.A. Levina, O.V. Fala-meeva, T.A. Korolenko
The aim was to evaluate liver function test and study the role of liver macrophages in development of acute toxic hepatitis induced by acetaminophen. Acetaminophen (1000 mg/kg, single) administration induced acute toxic hepatitis with development of cytolysis syndrome and centrolobular necroses. Preliminary administration of macrophage stimulators carboxymethylated P-1,3-D-glucan and Ukrain prevented toxic hepatitis according to biochemical data (serum ALT and AST activity) and morphological results. Some positive effect was shown in case of preliminary administration of gadolinium chloride, induced selecti-
ve depression of liver macrophages. Simultaneous administration of Reaferon and acetaminophen also reduced the cytolytic syndrome. Macrophage stimulation was shown to protect significantly liver injury induced by acetaminophen.
ЛИТЕРАТУРА
Таблица 1
Влияние КМГ, Украина, хлористого гадолиния, реаферона-ЕС на функциональные пробы печени у крыс Вистар с токсическим гепатитом (M±m)
1. Венгеровский А.И. Механизм гепатотоксич-ности парацетамола / А.И. Венгеровский.
А.С. Саратиков // Фармакол. Токсикол. 1991.
Т. 54. № 3. С. 76-80.
2. Клиническая характеристика вирусного гепатита С / Н.П. Толоконская, Г.И. Непомнящих, Н.Н. Киселев и др. // Эпидемиол. и ин-фекц. бол. 1999. № 5. С. 20-23.
3. Хитотриозидаза как маркер стимуляции макрофагов / Т.А. Короленко, С.Я. Жанаева,
О.В. Фаламеева и др. // Бюл. эксперим. биол. мед. 2000. Т. 130. № 10. С. 391-397.
4. Acetaminophen-induced hepatotoxicity / M.E.
Blazka, D.R. Germolec, P. Simeonova, M.I.
Luster // J. Inflamm. 1996. Vol. 39. № 47. P.
138-150.
5. Acetaminophen - induced hepatotoxicity /
A.M. Matthews, D.W. Roberts, J. A. Hinson,
N.R. Pumford //Drug Metab. Dispos. 1996. Vol. 24. №
11. P. 1192-1196.
6. Acetaminophen toxicity. Opposite effects of two forms of glutathione peroxidase / O. Mirochnitchenko, M. Weisb-rot-Lefkowitz, K. Reuhl et al. // J. Biol Chem. 1999. Vol. 274. №15. P. 10349-10355.
7. Czartoryska B. Changes in Serum Chitotriosidase Activity with Cessation of Replacement Enzyme (Cerebrosidase) Administration in Gaucher Disease / B. Czartoryska, A. Tylki-Szymanska, A. Lugowska // Clin. Biochem. 2000. Vol. 33. №2. P. 147-149.
8. Evidence for a direct role of intracellular calcium in paracetamol toxicity / A.R. Boobis, C.E. Seddon, P. Nasseri-Sina, D.S. Davies // Biochemical Pharmacology. 1990. Vol. 39. №8. P. 1277-1281.
9. Inhibition of tumour necrosis factor alpha does not prevent experimental paracetamol - induced hepatotoxicity / K.J. Simpson, N.W. Lukacs, A.H. Mc Gregor et al. // J. Pathol. 2000. Vol. 190. № 3. P. 489-494.
10. James L.P. Acetaminophen-induced hepatotoxicity / L.P. James, P.R. Mayeux, J.A. Hinson // Drug Metab Dispos. 2003. Vol. 31. № 12. P. 1499-1506.
Группы АЛТ (ЕД/л) АСТ (ЕД/л)
Интактные (n=8) 104,0± 6,5 298,6± 28,5
Ацетаминофен (n=10) 1367,0±532,0 ** 4411,0±2100,0 **
Хлористый гадолиний (n=5) 98,8± 6,24 254,3± 21,6
КМГ (n=5) 113,3± 10,1 238,3± 12,9
Украин (n=5) 108,5± 11,3 264,8± 23,25
Реаферон-ЕС (n=13) 149,2± 9,5 309,1± 12,2
Хлористый гадолиний + ацетаминофен (n=8) 458,5± 141,9 * 896,5±32,9 *
КМГ + ацетаминофен (n=7) 136,2±7,86 * 224,7± 14,12 *
Украин + ацетаминофен (n=7) 217,0± 18,3 * 412,0±44,4 *
Реаферон-ЕС + ацетаминофен (n=14) 182,8± 22,8 286,2± 34,9
Примечание. * - р<0,05 по сравнению с интактными животными, ** - р<0,01 по сравнению с интактными животными; п - количество животных в группе.
11. Modulation of macrophage functioning the acute hepatoti-xicity of acetaminophen / D.L. Laskin, C.R. Gardner, V.F. Price, D.J. Jollow // Hepatology. 1985. Vol. 21. № 4. P. 1045-1050.
12. Oxidative stress by acute acetaminophen administration in mouse liver / S. Lores-Arnaiz, S. Lesuy, J.C. Cutrin, J.C. Boveris // Free Radical. Biol. Med. 1995. Vol. 19. № 3. P. 303.
13. Pretreatment of mice with macrophage inactivators decreases acetaminophen hepatotoxicity and the formation of reactive oxygen and nitrogen species / S.L. Michael, N.R. Pumford, M.R. Niesman, J.A. Hinson//Hepatology. 1999. Vol. 30. № 1. P. 186-195.
14. Ray S.D. A hepatotoxic dose of acetaminophen modulates expression of BCL-2, BCL-X(L), and BCL-X(S) during and necrotic death of mouse liver cells in vivo /S.D. Ray, N. Jena//Arch Toxicol. 2000. Vol. 73. № 10-11. P. 594-606.
15. Shen W. Acetaminophen-induced cytotoxicity in cultured mouse hepatocytes: Correlation of nuclear Ca2+ accumulation and early DNA fragmentation with cell death / W. Shen, L.M. Kamendulis, S.D. Ray // Toxicol Appl Pharmacol. 1991. Vol. 111. P. 242-254.
