CC BY
94
Медицинская Иммунология 2003, Т. 5, № 1-2, стр 39-48 © 2003, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ФЕНОТИПА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
цитокинов
Старикова Э.А., Амчиславский Е.И., Соколов Д.И.*, Фрейдлин И.С., Полосухина Е.Р.**, Барышников А.Ю.**
ГУНИИ экспериментальной медицины РАМН,
* ГУНИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта г. Санкт-Петербург,
** НПЦ МедБиоСпектр г. Москва
Резюме. Наши исследования показали, что адгезионные молекулы ICAM-1 конститутивно не экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток человека линии EA.hy 926. TNFa и IFNy оказывают выраженное индуцирующее действие на экспрессию этих молекул. Наиболее сильным действием обладает TNFa. IFNy способен усиливать индуцирующий эффект, вызванный TNFa. IFNa, GM-CSF и IL-10 не вызывают индукции экспрессии молекул ICAM-1, однако GM-CSF проявляет себя как антагонист TNFa при совместном действии, а IL-10 оказывает ингибирующее действие на экспрессию адгезионных молекул на эндотелии, предварительно активированном провоспалительными цитокинами TNFa и IFNy. Молекулы HLA-DR не экспрессируются на поверхности клеток линии EA.hy 926 ни конститутивно, ни индуцибельно, а молекулы HLA-A,B.C конститутивно экспрессируются на поверхности клеток линии EA.hy 926. IFNy, IFNa и TNFa вызывают достоверное повышение экспрессии молекул HLA-A,B,C, при этом наиболее выраженным действием обладает IFNy. TNFa способен усиливать индуцирующий эффект интерферонов. Наши исследования показали, что изменения фенотипа эндотелиальных клеток под влиянием цитокинов отражает динамику развития воспалительного и иммунного ответов.
Ключевые слова: эндотелий, цитокины, ICAM-1, HLA-A,B,C.
Stankova ЕЛ., Amtchislavsky E.I., Sokolov D.I., Freidlin I.S., Polosukhina E.R., Baryshnikov A.Yu. DEVIATIONS OF ENDOTHELIAL CELLS SURFACE PHENOTYPE
UNDER THE INFLUENCE OF PRO-INFLAMMATORY AND ANTI-INFLAMMATORY CYTOKINES
Abstract.Intercellular adhesion molecule-1 ICAM-1 was not detected on resting EA.hy 926, but its expression increased rapidly after exposure to TNFa and IFNy. The effect of TNFa was significantly stronger than the effect of IFNy. However, IFNy was able to increase the influence of TNFa. In contrast, IFNa, GM-CSF and IL-10 were shown to have no effect on ICAM-lexpressions. GM-CSF was able to reduce ICAM-1 expression induced by TNFa on EA.hy 926 cells. IL-10 inhibited ICAM-1 induction after cells activation by TNFa and IFNy. Resting Ea.hy 926 endothelial cells expressed relatively high level of HLA-A,B,C molecules, at the same time, HLA-DR molecules were not detected. HLA-A,B,C molecules expression was increased by proinflammatory cytokines IFNy,
_______________________________________ IFNa and TNFa. Maximal level of HLA- А,В,С expres-
Адрес для переписки: sion was reached in response IFNy. Combination of TNF
Старикова Элеонора Александровна and interferons induced additional amplification of
197376 г. Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12, HLA-A,B,C expressions on EA.hy 926 cells. The devia-НИИЭМ РАМН, отдел иммунологии. tions of surface molecule expression on the endothelial
Тел.: (812)234-16-69. Факс: (812)234-94-89 cells reflected inflammation and immune response ki-
E-male: [email protected] netics. (Med.Immunol., 2003, vol.5, N1-2, pp 39-48)
Введение
Один из важнейших этапов развития раннего воспалительного ответа состоит в рекрутировании фагоцитов в очаг воспаления. Эндотелий сосудов играет активную роль в этом процессе. Пусковым механизмом для начала развертывания воспалительной реакции может быть непосредственная активация эндотелиальных клеток бактериальными продуктами [4, 17, 37, 40, 44]. Активация эндотелия также происходит в результате секреции фагоцитами и стромальными клетками цитокинов и других медиаторов воспаления [13,17, 22, 23, 25, 27]. Выработка 1Ь-1,1Ь-6,1Ь-8, 1Ь-12, ТОТсс, ИМ-СЭР фагоцитами индуцируется главным образом под влиянием бактериальных компонентов и продуктов [3, 40, 44]. К цитокинам, секретируемым в ответ на вирусную инфекцию, относятся интерфероны I типа [3, 6]. Эндотелиальные клетки испытывают на себе влияние всех этих медиаторов. Под влиянием медиаторов воспаления на эндотелии увеличивается экспрессия адгезионных молекул (Е- и Р-селектинов, 1САМ-1, УСАМ-1), которые регулируют процессы миграции эффекторных клеток через сосудистую стенку и инфильтрацию ими тканей [2, 3, 5, 13, 25, 27]. Этому способствует также сокращение эндотелиальных клеток и увеличение пор между ними [2,25,27]. В участке воспаления активированный эндотелий секретирует хемокины (МСР-1 и 1Ь-8) и цитокины (1Ь-1,1Ь-6 и СМ-СБР), для привлечения и активации моноцитов и нейтрофилов [2, 3, 25,27]. Распознающие микробные компоненты фагоциты и естественные киллеры секретируют регуляторные цитокины, такие как 1Ь-12, , 1Ь-4, которые кон-
тролируют дифференцировку С04-Т-клеток [3, 37, 44]. Под влиянием этих цитокинов происходят функциональные и фенотипические изменения эндотелиальных клеток, способствующие преимущественному рекрутированию в очаг инфекции цитотокси-ческих лимфоцитов и макрофагов, или базофилов и эозинофилов [2, 3]. Секреция большого количества провоспалительных цитокинов на более поздней стадии индуцирует синтез и секрецию иммунокомпе-тентными клетками противовоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-10 [2,3, 9, 39]. Изменения цито-кинового окружения, происходящие в динамике развития воспалительного ответа, не могут не затрагивать и эндотелий сосудов.
Цель нашей работы состояла в сравнительном исследовании влияния ряда про- и противовоспалительных цитокинов на экспрессию адгезионных молекул 1САМ-1 и молекул главного комплекса гистосовместимости I класса НЬА-А,В,С на поверхности человеческих эндотелиальных клеток перевиваемой линии ЕА.Ьу 926. Для моделирования развития воспалительного ответа нами были выбраны провоспа-лительные цитокины ТОТа, вМ-СБР, ¡РЫа, 1РЫуи противовоспалительный цитокин 1Ь-10.
Материалы и методы
В работе использовали рекомбинантные препараты человеческих цитокинов TNFa - «Рефнолин» (специфическая активность препарата 1ЕД - 0,06 нг), IFNy - «Гаммаферон», IFNa - «Реаферон» (НПО «Фермент», «Sanitas», Литва), коммерческий рекомбинантный препарат человеческого GM-CSF -«Leucomax» (специфическая активность препарата 1ЕД - 0,09 нг) («Schering-Plough»), рекомбинантный человеческий IL-10 (специфическая активность препарата 1ЕД - 1 нг) («Sigma», США).
EA.hy 926- линия эндотелиальных клеток человека была любезно предоставлена Dr. Cora-Jean С. Edgell (Университет Северной Калифорнии, США). Клетки культивировали в 50-ти мл флаконах («Sarstedt», Австрия), в среде DMEM/F12 («Био-лот», СПб), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (АО «Самсон», СПб), 2 мМоль глютамина («Flow Laboratories», Англия) и HAT («ICN», США), при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО . Пересев культуры производили каждые 3-4 дня. Для дезинтеграции монослоя клетки инкубировали в растворе Версена в течение 5-10 минут («Биолот», СПб).
Цитотоксический эффект цитокинов оценивали в МТТ-тесте. Клетки вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета в концентрации 32000 клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды. На следующий день вносили исследуемые цитокины в различных концентрациях. После 24-часовой инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием С02во все лунки планшета вносили по 10 мкл предварительно растворенного в физиологическом растворе МТТ (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tétrazolium bromide, ICN, США), таким образом, что его конечная концентрация составляла 0,5 мг/мл. После дополнительной 4-часовой инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием С02 для экстракции красителя во все лунки вносили по 100 мкл лизирующего буфера, содержащего 10% додецилсульфата натрия (“Serva”, Германия) в
0.01N-HC1, и инкубировали в течение 18 часов при 37°С. Оптическую плотность (ОП) учитывали с помощью автоматического спектрофотометра (“SLT-Spectra”, Австрия) при длине волны 540 нм. По степени снижения оптической плотности судили о ци-тотоксическом действии цитокинов.
Для оценки экспрессии поверхностных молекул использовали клеточный иммуноферментный анализ. Для этого клетки помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета («Greiner», Германия) в концентрации 32000 клеток на лунку в 200 мкл культуральной среды и инкубировали 24 часа во влажной атмосфере с 5% С02 при 37°С. Клетки инкубировали в присутствии исследуемых цитокинов 24 или 48 часов. Все эксперименты проводили в при-
сутствии 10 мкг/мл полимиксина В. После окончания инкубации клетки фиксировали в 0,05% растворе глутаральдегида («Reanal», Венгрия) на забуфе-ренном физиологическом растворе (ЗФР, рН=7,2). Клетки отмывали ЗФР, содержащим 0,05% твина-20 («Serva», Германия). Моноклональные лиофили-зированные антитела (мАт) соответствующей специфичности (Научно-производственный центр 1МедБиоСпектр1, Москва), предварительно растворенные согласно рекомендациям производителя, вносили в лунки в объеме 100 мкл. В контрольные лунки вносили среду RPMI 1640 / 5% ЭТС / 0,1% NaN , не содержащую мАт. После инкубации в течение Ï часа во влажной атмосфере с 5% СО при 37°С клетки отмывали ЗФР, содержащим 0,05%ггвина-20. Лиофилизированные поликлональные Ат к иммуноглобулинам мыши, меченные пероксидазой хрена («МедБиоСпектр», Москва), растворяли согласно рекомендациям производителя и вносили во все лунки планшета в объеме 100 мкл. После инкубации в течение 1 часа во влажной атмосфере с 5% С02 при 37°С и отмывки ЗФР, содержащим 0,05% твина-20, проводили дополнительную инкубацию с субстрат-хромогенной смесью, состоящей из 1 мг ортофени-лендиамина («Sigma»,США) в 1 мл цитрат-фосфат -ного буфера (рН=5), содержащем 0,06% перекиси водорода, в течение 5 мин в темноте. Цветную реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 1 М серной кислоты. Оптическую плотность учитывали с помощью автоматического спектрофотометра («SLT-Spectra», Австрия) при длине волны 492 нм. Экспрессию поверхностных молекул на клетках EA.hy 926 выражали в единицах оптической
плотности. Средние значения оптической плотности в контрольных лунках принимали за фон и вычитали из всех остальных значений оптической плотности.
Результаты
С помощью МТТ-теста было показано, что все исследуемые цитокины в рабочих концентрациях не обладают цитотоксическим действием в отношении клеток линии ЕА.Ьу 926.
Адгезионные молекулы 1САМ-1 конститутивно не экспрессируются на поверхности клеток (рис.1). ТЫЕа в широком диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/мл оказывал выраженное индуцирующее действие на экспрессию адгезионных молекул 1САМ-1 на эндотелиальных клетках. Дозозависимость этого индуцирующего действия была отмечена лишь при сопоставлении эффектов двух наименьших концентраций препарата: 10 и 25 нг/мл. В более высоких концентрациях (от 50 до 1000 нг/мл) ТЫРа оказывал одинаково выраженное индуцирующее действие на экспрессию молекул 1САМ-1 на эндотелиальных клетках (рис. 1). 1Шу оказался значительно более слабым индуктором экспрессии тех же адгезионных молекул. Тем не менее, стимулирующее действие 1ЕЫу на экспрессию молекул 1САМ-1 на эндотелиальных клетках также было статистически достоверным (рис.1). Кроме того, 1ЕЫу в разных концентрациях достоверно усиливал влияние ТЫЕа на экспрессию адгезионных молекул 1САМ-1 (рис.2). 1Ша не оказывал достоверного индуцирующего влияния на экспрессию молекул 1САМ-1 (рис.1).
.. I i
TNFce IFNy IFNa
Рис.1. Сравнение влияния Т№а, 1РИу и на экспрессию молекул 1САМ-1 на клетках линии ЕА.Ьу 926 при инкубации в течение 24 часов.
* - Различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
# - Различия между эффектами ТЖа и в одной и той же концентрации статистически достоверны (р<0,001).
вМ-СЭР достоверного индуцирующего действия на экспрессию адгезионных молекул IС АМ -1 не ока-зывал, однако, при совместном действии с ТТЧРа снижал стимулирующий эффект ТОТа в отношении экспрессии молекул 1САМ-1 (рис.2).
1Ь-10 также не вызывал индукцию экспрессии адгезионных молекул 1САМ-1 на поверхности клеток линии ЕА.Ьу 926. Его ингибирующее действие на индуцирующие эффекты провоспалительных ци-токинов ТЫРа, 1РИу и их сочетаний оказалось статистически достоверным лишь в случае инкубации с ним клеток, предварительно инкубированных с провоспалительными цитокинами (табл.1).
В отличие от молекул главного комплекса гистосовместимости II класса НЬА-011, которые не эксп-
рессировались на клетках ЕА.Ьу 926 ни конститутивно, ни индуцибельно, молекулы главного комплекса гистосовместимости первого класса - НЬА-А, В, С конститутивно экспрессировались на поверхности клеток линии ЕА.Ьу 926. №N7,1РЫа и ТЫ Ра оказывали статистически достоверное, дозозависимое стимулирующее действие на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости НЬА-А, В, С. Наиболее выраженное влияние на исследуемый параметр оказывал 1РЫу, в то время как 1РЫа в наименьшей степени изменял этот показатель (рис.З). ТКТа достоверно усиливал стимулирующее влияние №N7 (рис.5) и 1РЫа (рис.4) на экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости НЬА-А, В, С.
□ контроль *ЗТМ= а 25 ЕДІмп НІРЦі 400ЕДІМ1 ШЭМ-СЗР 2000 ВДмл
ВТІчра 25 ВДмп+ ІРМ/ 400 ЕД/мл
ШТ№а 25 ВДмп+ ЄМ-СБР 2000 ЕДш
Рис.2. Влияние ТЫРа на экспрессию молекул 1САМ-1 на клетках линии ЕА.Иу 926 в присутствии 1РЫу и ОМ-СЭР при инкубации в течение 24 часов.
* - Различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
# - Различия статистически достоверны по сравнению с эффектом Т^а (р<0,01).
Табл.1. ВЛИЯНИЕ И-10 НА ЭФФЕКТЫ ДРУГИХ ЦИТОКИНОВ В ОТНОШЕНИИ ЭКСПРЕССИИ 1САМ-1 НА КЛЕТКАХ ЛИНИИ ЕА.НУ 926
Инкубация клеток
Уровень экспрессии молекул ІСАМ-1 (М±т) (ОП) в случае:
в присутствии: Обработки провоспалительными цитокинами Обработки провоспалительными цитокинами и 11.-10(100 ВД/мл)
24 часа 48 часов ПредобработкаИ-10 (время инкубации сИ-10 48 часов) ПостобрабошИ-Ю (время инкубации сИ-10 24 часа)
Т^сх 50 ВД/мл ІРМу400 ЕД/мл Т^а50ЕД/мл+ +^N7 400 ВД/мл И-10 10 ВД/мл И-10 100 ЕД/мл ІІ.-10 250 ВД/мл 1,123±0,07(п=4) 0,281 ±0,02(п=4) 1,449±0,05(п=4) 0,832+0,07(п=4) 0,299+0,01 (п=4) 1,083±0,04(п=4) 1,153+0,02(п=4) 0,260+0,02(п=4) 1,404±0,07(п=4) 0,107±0,00(п=4) 0,102±0,01(п=4) 0,091 ±0,01 (п=4) 0,746±0,02(п=4) 0,271 ±0,01 *(п=4) 1,050±0,02*(п=4) 0,096±0,01(п=4) 0,084±0,01 (п=4) 0,072±0,01(п=4)
: И-10 достоверно ингибировал эффект провоспалительных цитокинов (р<0,01).
Обсуждение
Важнейшим этапом развития воспаления является адгезия лейкоцитов к эндотелию, опосредованная усилением экспрессии на эндотелиальных клетках адгезионных молекул, среди которых ключевыми считаются молекулы ІСАМ-1. Молекула межклеточной адгезии ІСАМ-1, принадлежащая к иммуноглобулиновому суперсемейству, представляет собой одноцепочечный гликопротеин, который состоит из 5 внеклеточных доменов, одного - трансмембранного и короткого цитоплазматического участка [16,27]. Цитоплазматический домен ІСАМ-1 способен взаимодействовать с белком цитоскелета а-актинином [16]. ІСАМ-1 действует как молекула межклеточ-
нои адгезии в процессе воспаления - участвует в адгезии лейкоцитов к эндотелию, в трансэндотелиальной миграции, обеспечивает адгезию клеток к внеклеточному матриксу [2, 3, 16, 27]. Основными лигандами для 1САМ-1 на лейкоцитах являются (32 - интегрины (ЬЕА-1, МАС-1) [3, 16, 27].
Покоящиеся эндотелиальные клетки экспрессируют низкий уровень 1САМ-1, который резко возрастает под влиянием провоспалительных цитоки-нов ТОТа, 1Ь-1 и ШЫу, а также бактериальных продуктов [2, 3, 10, 16, 17,26, 27].
Полученные нами на модели клеток перевиваемой линии Е А.Ьу 926 результаты подтверждают, что уровень экспрессии молекул 1САМ-1 регулируется
□ контроль
■ ЮЕД'ып
■ 100 ЕДОіп
■ 400 ЕД(мл ШЮООЕД/МЛ
Рис.З. Сравнение влияния 1РЫсх, 1РИу и Т№а на экспрессию молекул НЬА - А,В,С на клетках линии ЕА.Ьу 926 при инкубации I течение 24 часов.
* - Различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
# - Различия между эффектами 1РМсс, 1РМу и Т^а в одной и той же концентрации статистически достоверны (р<0,01).
□ контроль
■ № 1000 ВД/мл
■ Т^а 100 Е/Умл
в ІВ^а 1000+ Т^а 100 ВД/мл
Рис.4. Влияние ^N01 на экспрессию молекул НШ - А,В,С
на клетках линии ЕА.Иу 926 в присутствии Т№а при инкубации в течение 24 часов.
* - Различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
# - Различия статистически достоверны по сравнению с эффектом одного ^N<2 (р<0,01).
про- и противовоспалительными цитокинами. Нами не было обнаружено конститутивной экспрессии молекул ІСАМ-1 на клетках линии ЕА.Ьу 926, что согласуется с имеющимися в литературе характеристиками поверхностного фенотипа эндотелиальных клеток [5, 2, 3, 27, 29].
Среди изученных цитокинов наиболее сильным индуктором экспрессии молекул ІСАМ-1 на клетках линии ЕА.Ьу 926 оказался ТЫБа, что хорошо согласуется с ранее описанными в литературе свойствами этого провоспалительного цитокина [2,3,4,8,10, 17,22,25]. ТЫЕа обеспечивает рекрутирование лейкоцитов из крови в очаг воспаления на начальных этапах. Это происходит не только за счет повышения экспрессии адгезионных молекул ІСАМ-1, УСАМ-1 и Е-селектинов на эндотелиальных клетках, но и в результате стимуляции синтеза и секреции ими хемокинов МСР-1 и 1Ь-8. [2,3,4, 13, 25, 26,
27, 31, 35, 42]. Основными продуцентами ТЫБа в организме человека считаются моноциты/макрофаги, которые начинают секретировать ТКЕа уже через несколько часов после активации [2,37,41]. Синтез и секрецию таТа клетками иммунной системы и другими клетками индуцируют липополисахарид и другие компоненты микроорганизмов[3, 37, 41].
Более слабым индуктором экспрессии молекул ІСАМ-1 на клетках ЕА.Ьу 926 оказался 1ЕЫу. Использованный в тех же концентрациях, что ТКЕа, ІЕКу вызывал в четыре раза менее выраженный прирост экспрессии молекул ІСАМ-1. Вместе с тем, ІЕКу проявил способность усиливать стимулирующий эффект ТОТа на экспрессию молекул ІС АМ-1 у клеток ЕА.Ьу 926 при совместном с ним применении. Эти результаты согласуются с имеющимися в лите-
ратуре характеристиками провоспалительных эффектов 1ЕЫу [2, 5, 8, 25, 27]. 1ЕЫу является ключевым цитокином клеточного иммунного ответа. Пик экспрессии гена 1ЕЫу происходит значительно позже, чем у других провоспалительных цитокинов (через 48-24 часа) [3,37]. На начальных стадиях иммунного ответа синтез и секрецию 1ЕИу индуцирует 1Ь-
12, который секретируется активированными макрофагами [3]. Эндотелий, активированный 1РКу, способен к секреции таких хемоаттрактантов как МСР-1,1Р-10 [2]. Наряду со слабо выраженным противовирусным действием, 1БМу обладает значительным иммуномодулирующим эффектом, который проявляется в активации макрофагов, усилении их антигенпрезентирующих функций, что в значительной степени обусловлено усилением экспрессии молекул МНС II класса [2, 5].
У 1ЕЫа нам не удалось выявить 1САМ-1 - индуцирующего действия, что не противоречит имеющимся в литературе характеристикам этого цитокина. Основными продуцентами 1ЕЫа являются плаз-моцитоидные дендритные клетки, активированные продуктами жизнедеятельности вирусов [6]. ШЫа -цитокин, обладающий наиболее выраженной противовирусной активностью, которую связывают с его способностью подавлять процессы транскрипции и трансляции вирусного генома, активировать ЫК-клетки, цитотоксические Т-лимфоциты, макрофаги [3, 6].
Несколько неожиданные результаты были получены нами при изучении эффектов цитокина СМ-СБЕ, который не оказывал самостоятельного влияния на экспрессию молекул 1САМ-1 на клетках линии ЕА.Ьу 926, но проявил способность ослаблять
□контрол ■ ІГГ^ШО ЕДЪл 400 ЕДМл □ТМГа 100 ЕДМл £Ґ№ 100+ Р Мд 100 ЕД4ил □ТЫГа 100 + РЫд 400 ЕДЬл
Рис.5. Влияние 1РИу на экспрессию молекул ША - А,В,С на клетках линии ЕА.Иу 926 в присутствии ТИРа при инкубации в течение 24 часов.
* - Различия статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
# - Различия статистически достоверны по сравнению с эффектом одного 1РЫу (р<0,01).
стимулирующее действие TNFa на экспрессию этих молекул при совместном с ним применении. Нам не удалось найти в литературе описания каких-либо проявлений антагонизма GM-CSF по отношению к TNFa. Однако провоспалительные и противовоспалительные эффекты GM-CSF еще недостаточно изучены и касающиеся этого литературные данные весьма противоречивы. Человеческий GM-CSF впервые описан как фактор, необходимый для роста и развития клеток-предшественников макрофагов и грану-лоцитов. Продуцентами GM-CSF являются активированные Т-лимфоциты, макрофаги, фибробласты и эндотелиальные клетки. GM-CSF находится в ряду цитокинов, секретируемых и при развитии раннего воспалительного ответа, и в ходе развития специфического иммунного ответа [3]. Показано, что GM-CSF может секретироваться эндотелиальными клетками конститутивно [15, 20, 38]. GM-CSF усиливает миграцию нейтрофилов через не стимулированный эндотелий, но ингибирует миграцию этих клеток через эндотелий, предварительно обработанный IL-1 [38]. GM-CSF также способен проявлять стимулирующие эффекты в отношении эндотелиальных клеток. Было показано, что GM-CSF способен стимулировать экспрессию Е-селектина, ICAM-1 на эндотелии гломерул почек [7,34], однако на культуре эндотелиоцитов микрососудов кожи человека было показано отсутствие влияния GM-CSF на экспрессию ICAM-1 [34].
В качестве потенциального антагониста провос-палительных цитокинов при индукции экспрессии адгезионных молекул нами был изучен противовоспалительный цитокин IL-10. В использованной экспериментальной системе IL-10 вызывал выраженное снижение уровня экспрессии молекул ICAM-1 по сравнению с уровнем, достигнутым под влиянием TNFa, IFNy или их сочетания. Ингибирующее действие IL-10 проявлялось только в случае его добавления в цитокиновую смесь через сутки после про-воспалительных цитокинов, т.е. в случае его действия на клетки, предварительно инкубированные в присутствии провоспалительных цитокинов. Полученные результаты перекликаются с имеющимися в литературе характеристиками IL-10. Интерлейкин-10
- универсальный противовоспалительный цитокин, обладающий широким спектром ингибирующих эффектов в отношении различных клеток-мишеней [3, 11]. In vivo IL-10 синтезируется активированными макрофагами вслед за TNFa, IFNy и IL-12 и ауток-ринно подавляет синтез и секрецию провоспалительных цитокинов [3, 11]. Известно, что противовоспалительный эффект IL-10 опосредован блокированием активности транскрипционного фактора NF-kB, который способен активировать гены многих провоспалительных цитокинов, острофазных белков, адгезионных молекул и молекул главного комплекса гистосовместимости [ 11 ]. IL-10 также блокирует опос-
редованную Erk 1, Erk 2 и другими МАР-киназами трансдукцию сигнала, который важен для индукции синтеза и секреции ряда хемокинов и цитокинов. В ряду эффектов IL-10 - дестабилизация mRNA провоспалительных цитокинов [И]. В большинстве исследований не удавалось выявить прямого противовоспалительного действия IL-10 на эндотелиальные клетки. До сих пор нет никаких данных относительно экспрессии а- и ß-цепей рецептора IL-10, а также комплекса, передающего сигнал от рецептора IL-10 на эндотелиальных клетках. IL-10 оказывает различное влияние на эндотелиальные клетки, в зависимости от их происхождения, а также пути трансдукции сигнала, индуцированного провоспалительными ци-токинами [39]. Согласно литературным данным, IL-
10 ингибирует экспрессию ICAM-1, VCAM-1 и секрецию IL-6, IL-8 активированными HUVEC [39].
В динамике воспаления поверхностный фенотип эндотелиальных клеток может меняться: на смену одним адгезионным молекулам приходят другие, наряду с экспрессией адгезионных молекул под влиянием провоспалительных цитокинов повышается экспрессия других молекул, которые позднее могут опосредовать участие эндотелиальных клеток в специфическом иммунном ответе. К числу таких молекул относятся молекулы главного комплекса гистосовместимости: HLAI и II классов. Специфический иммунный ответ начинается с распознавания Т-лим-фоцитами чужеродного антигена, при этом на первый план выходят антигенпрезентирующие функции вспомогательных клеток, в том числе эндотелиальных клеток, на которых под влиянием интерферо-нов повышается экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости [3, 9, 37].
Нам не удалось выявить на клетках линии EA.hy 926 ни конститутивной, ни индуцированной экспрессии молекул HLA-DR. Мы сосредоточили внимание на изучении экспрессии молекул HLA-A,B,C, которые конститутивно экспрессировались на клетках EA.hy 926, и экспрессия их возрастала под влиянием изученных провоспалительных цитокинов: TNFa, IFNy и IFNa. В данном случае наиболее выраженное стимулирующее действие на экспрессию молекул HLA-A,B,C оказывал IFNy. При этом TNFa проявил способность усиливать стимулирующие эффекты как IFNy, так и IFNa. Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными относительно цитокиновой регуляции экспрессии молекул HLA I класса. Молекула HLA
11 класса представляет собой - гетеродимер, состоящий из трансмембранной тяжелой цепи и легкой цепи (ß2- микроглобулина). В результате распознавания определенных молекул HLA I класса на клетках-мишенях происходит ингибирование эффектор-ных функций NK - клеток. Специфические Т-лим-фоциты активируются, когда распознают антигенные пептиды в комплексе с HLA I молекулами (3,
18). Синтез молекул HLAI класса индуцируют про-воспалительные цитокины - TNFa и интерфероны. Человеческие и мышиные эндотелиальные клетки экспрессируют относительно высокий уровень молекул МНС I класса in vivo, котрый возрастает под влиянием IFNy [18]. Способность провоспалитель-ных цитокинов усиливать экспрессию продуктов генов HLA I класса способствует осуществлению процессов распознавания антигенов [2, 3, 9, 37, 43]. Повышение уровня экспрессии молекул HLA I класса на поверхности эндотелиальных клеток, не инфицированных вирусными частицами, защищает клетки от возможной атаки со стороны NK-клеток [12, 33,
36, 41]. Показано также, что, активированные IFNy эндотелиальные клетки способны костимулировать Т-лимфоциты к пролиферации [41], синтезу и секреции цитокинов [14, 17, 26].
Наши исследования показали, что TNFa и IFNy оказывают однонаправленное действие на экспрессию молекул ICAM-1 и HLA-A, В, С, на клетках линии EA.hy 926. Эти провоспалительные цитокины усиливают эффекты друг друга. Одним из механизмов, обеспечивающим синергидное действие цитокинов, является их взаимное влияние на экспрессию рецепторов. IFNy способен усиливать экспрессию рецепторов TNFa, и, наоборот TNFa способен усиливать экспрессию рецепторов для IFNa на моноцитах/ макрофагах [1]. На клетках линии Mel JuSo было показано, что ген ICAM-1 содержит две разные регуляторные области, опосредующие эффекты этих цитокинов [1, 27]. Аналогичным образом объясняется усиление стимулирующего действия интерфе-ронов на экспрессию молекул HLA-A,B,C. На клетках HeLa и HUVEC показано, что TNFa и IFNy активируют два разных энхансера в области промотора генов HLA-A,B,C - кВ и ICS соответственно [18]. Таким образом, усиление эффектов TNFa и IFNy может происходить в процессе трансдукции сигналов от рецепторов цитокинов внутрь клетки.
Наши исследования подтверждают решающую роль TNFa в процессе развития ранней воспалительной реакции, когда необходима быстрая мобилизация лейкоцитов из кровеносного русла в очаг воспаления. В дальнейшем, в ходе развития специфического иммунного ответа, происходит нарастание концентрации IFNy, и на первый план выходят антигенпрезен-тирующие свойства клеток. IL-10, синтез и секреция которого происходят значительно позже, выступает в качестве фактора, снижающего активность макрофагов, сдерживающего синтез цитокинов ТЫ-клетками и накопление лейкоцитов в очаге воспаления. Таким образом, эндотелиальные клетки являются активными участниками воспалительного и иммунного ответа, а изменения экспрессии поверхностных молекул, происходящие на эндотелиальных клетках под влиянием цитокинов, отражают общие закономерности развития этих процессов.
Список литературы
1. Фрейдлин И. С., Соколов Д. И. Кооперативные эффекты цитокинов // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии.- 2001.-т.1.- с.311-324
2. Фрейдлин И. С., Шейкин Ю. А. Эндотелиальные клетки в качестве мишеней и продуцентов цитокинов // Медицинская Иммунология. - 2001. -т.З, №4. - с.499-514.
3. Ярилин А. А. Основы иммунологии: Учебник.
- М.: Медицина, 1999. - 608 с.
4. Bhunia A. K., Arai Т., Bulkley G., Chatterjee S. Lactosylceramide mediates Tumor Necrosis Factor- 6 -induced Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) expression and the adhesion of neutrophil in Human Umbilical Vein Endothelial Cells // The Journal of Biological Chemistry. - 1998. -Vol.273,No.51. - P. 34349-34357.
5. Bouis D., Hospers G. A. P., Meijer C., Molema G., Mulder N. H. Endothelium in vitro: A review of human vascular lines for blood vessel-related research // An-giogenesis. - 2001. - Vol.4. - P.91-102.
6. Cella M. et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon //Nat. Med. - 1999. - Vol.5. - P. 919-923.
7. Detmar M., Tenorio S., Hettmannsperger U., Ruszczak Z., Orfanos C.E. Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1 of human dermal microvascular endothelial cells in vitro // Blood. - 1993. - Vol.4. -P.1001-1008.
8. Doukas J., Pober J. S. IFN-gamma enhances endothelial activation induced by tumor necrosis factor but not IL-1 // The Journal of Immunology. - 1990. -Vol. 145. -P.1727-1733.
9. Epperson D. E., Arnold D., Spies T„ Cresswell P., Pober J. S., Johnson D. R. Cytokines increase transporter in antigen processing-1 expression more rapidly than HLA class I expression in endothelial cells // The Journal of Immunology. - 1992. -Vol.149. - P.3297-3301.
10. Fan J., Frey R. S., Rahman A., and Malik A. B. Role of neutrophil NADPH oxidase in the mechanism of Tumor Necrosis Factor - induced NF-кВ activation and Intercellular Adhesion Molecule-1 expression in endothelial cells // The Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277, No. 5. - P.3404-3411.
11. Fickenscher H., Нцг S., Kbpers H., Knappe A., Wittmann S., Sticht H. The interleukin-10 family of cytokines // Trends in Immunology. - 2002. - Vol.23, No.2. - P.89-95.
12. Forte P., Pazmany L., Matter-Reissmann U. B., Stussi G., Schneider M. K.J., Seebach J. D. HLA-G inhibits rolling adhesion of activated human NK cells on porcine endothelial cells //J. Immunol. - 2001. - Vol. 167, No.10. - P. 6002-6008.
13. Freyer D., Manz R., Ziegenhorn A., Weih M., Angstwurm K., Dncke W. -D., Meisel A., Schumann R.
R., Schunfelder G., Dirnagl U., Weber J. R. Cerebral endothelial cells release TNF-a after stimulation with cell walls of Streptococcus pneumoniae and regulate inducible nitric oxide synthase and ICAM-1 expression via autocrine loops //J. Immunol. - 1999. - Vol. 163. -P.4308-4314.
14. Gavin J. Blake, Paul M. Ridker Novel clinical markers of vascular wall inflammation // Circ Res.-2001. - Vol.89. - p.763-771.
15. Groger M., Holnthoner W., Maurer D., Lechle-itner S., Wolff K., Mayr B. B., Lubitz W., Petzelbauer P. Dermal microvascular endothelial cells express the 180-kDa macrophage mannose receptor In Situ and In Vitro // J. Immunol. - 2000. - Vol.165, No. 10. - P.5428
- 5434.
16. Hubbard A. K. and Rothleininter R. Cellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression and cell signaling cascades // Free Radical Biology & Medicine.-2000,-Vol. 28, No. 9.- P. 1379-1386.
17. Jersmann H. P. A., Hii C. S. T., Ferrante J. V., Ferrante A.. Bacterial Lipopolysaccharide and Tumor Necrosis Factor Alpha synergistically increase expression of human endothelial adhesion molecules through activation of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways // Infection and Immunity.
- 2001. - Vol. 69. - No.3. - P.1273-1279.
18. Johnson D. R. Locus-specific constitutive and cytokine-induced HLA class I gene expression // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170, No. 10. - P. 1894 - 1902.
19. Johnson D. R., Hauser I. A., Voll R. E., Emmrich
F. Arterial and venular endothelial cell costimulation of cytokine secretion by human T cell clones //J. Leu-koc. Biol. - 1998. - Vol.63. - P.612-619.
20. Kosaki K. Ando J., Korenaga R„ Kurokawa T„ Kamiya A., Fluid shear stress increases the production of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor by endothelial cells via mRNA stabilization // Circ Res. - 1998. - Vol.82. - P.794-802.
21. Khayyamian S., Hutloff A., Buchner K., Grafe M., Henn V., Kroczek R. A., Mages H. W. ICOS-ligand, expressed on human endothelial cells, costimulates Thl and Th2 cytokine secretion by memory CD4+ T cells // PNAS. - 2002. - Vol. 99. - No. 9. - P. 6198 - 6203.
22. Lakshminarayanan V., Beno D. W. A., Costa R.
H., Roebuck K. A. Differential Regulation of Interleu-
kin-8 and Intercellular Adhesion Molecule-1 by H O
2 2
and Tumor Necrosis Factor - a in endothelial and epithelial cells // The Journal of Biological Chemistry. -1997. - Vol.272. - No.52. - P.32910-32918.
23. Lum H., Roebuck K. A. Oxidant stress and endothelial cell dysfunction // Am J Physiol Cell Physiol.
- 2001. - Vol.280. -P.719-741.
24. Ma W., Lehner P. J., Cresswel P. 1, Pober J. S., Johnson D. R. Interferon-gamma rapidly increases peptide transporter (TAP) subunit expression and peptide transport capacity in endothelial cells // J. Biol. Chem.
- 1997. - Vol.272. - No.26. - P.16585 - 16590.
25. Mantovani A., Bussolino F., Intora M. Cytokine regulation endothelial cell function: from molecular level to bedside // Immunology Today. - 1997. - Vol.18. -№5. - P.231-239.
26. McHale J. F., Harari O. A., Marshall D., Haskard
D. O. TNF-a and IL-1 sequentially induce endothelial ICAM-1 and VCAM-1 expression in MRL/lpr Lupus-Prone Mice // The Journal of Immunology. - 1999. -Vol. 163. - P.3993-4000.
27. Meager A. Cytokine regulation of cellular adhesion molecule expression in inflammation // Cytokine and growth factor reviews. - 1999. - Vol.10. - P.27-39.
28. Mestas J., Hughes C. C. W. Endothelial cell costimulation of T cell activation through CD58-CD2 interactions involves lipid raft aggregation // J. Immunol. - 2001. - Vol.167, No. 8. - P.4378 - 4385.
29. Mutin M., Dignat-George F., Sampol J. Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules // Tissue antigens. - 1998. - Vol.50. - P.449-458.
30. Orozco A. S., Zhou X., S. G. Filler. Mechanisms of the proinflammatory response of endothelial cells to Candida albicans infection // Infection and immunity.
- 2000. - Vol.68, No.3. - P. 1134-1141.
31. Rahman A., Anvar K. N., Malik A. B. Protein kinase C-z mediates TNF-a-induced ICAM-1 gene transcription in endothelial cells // Am J Physiol Cell Physiol. - 2000. - Vol.279. - P.906-914.
32. Ruco L. P., Pomponi D., Pigott R., Stoppacciar A., Monardo F., Uccini S., Boraschi D., Tagliabue A., Santoni A., Dejana E. Cytokine production (IL-1 alpha, IL-1 beta, and TNF alpha) and endothelial cell activation (ELAM-1 and HLA-DR) in reactive lymphadenitis, Hodgkin’s disease, and in non-Hodgkin’s lymphomas //American Journal of Pathology. - Vol.137. -P. 1163-1171.
33. Sasaki H., Xu X. -C., Mohanakumar T. HLA-E and HLA-G expression on porcine endothelial cells inhibit xenoreactive human NK cells through CD94/ NKG2-dependent and -independent pathways // J. Immunol. - 1999. - Vol.163. - No.ll. - P.6301 - 6305.
34. Savage C. O. S., Brooks C. J., Adu D., Richards
G., Howie A. J. Cell adhesion molecule expression within human glomerular and kidney organ culture //J. Pathol.
- 1997. - Vol.181, No.l. - P. Ill - 115.
35. Schmidt A., Goepfert C., Feitsma K., Buddecke
E. Lovastatin-stimulated superinduction of E-selectin, ICAM-1 and VCAM-1 in TNF-a activated human vascular endothelial cells // Atherosclerosis. - 2002. -Vol.164. - P.57-64.
36. Seebach J. D., Comrack C., Germana S., LeGuern C., Sachs D. H., DerSimonian H. HLA-Cw3 expression on porcine endothelial cells protects against xenogeneic cytotoxicity mediated by a subset of human NK cells //J. Immunol. - Vol.159. - P. 3655-3661.
37. Shen J., T-To S. S., Schrieber L., King N.J. C Early E-Selectin, VCAM-1, ICAM-1, and late major histo-
compatibility complex antigen induction on human endothelial cells by Flavivirus and comodulation of adhesion molecule expression by immune cytokines // Journal of Virology. - 1997. - Vol. 71, No. 12. - P.9323-9332.
38. Takahashi T., Hato F., Yamane T., Fukumasu H., Suzuki K., Ogita S., Nishizawa Y., Kitagawa S. Activation of human neutrophil by cytokine-activated endothelial cells // Circ Res. - 2001. - Vol.88. - P.422-429.
39. Tedgui A., Mallat Z. Anti-Inflammatory Mechanisms in the Vascular Wall // Circ Res. - 2001. - Vol.88.
- P.877-887.
40. Vasselon T, Detmers P. A. Toll Receptors: a central element in innate immune responses // Infection and Immunity. - 2002. - Vol.70. - №3. P.1033-1041.
41. Valle’e I., Guillaumin J. -M., Thibault G., Gruel Y., Lebranchu Y., Bardos P. Human T lymphocyte proliferative response to resting porcine endothelial cells
results from an HLA-restricted, IL-10-sensitive, indirect presentation pathway but also depends on endot-helial-specific costimulatory factorsl // The Journal of Immunology. - 1998. - Vol.161. - P.1652-1658.
42. Wagner J. G., Roth R. A. Neutrophil migration mechanisms, with an emphasis on the pulmonary vasculature // Pharmacol Rev. - 2000. - Vol.52, No.3. -P.349-374.
43. Yssel V. H., J. E. de Vries and Karasek M. A. Antigen presentation by human dermal microvascular endothelial cells. Immunoregulatory effect of IFN-gam-ma and IL-10 //J. Immunol. - 1994. - Vol. 152. -P.5734-5741.
44. Zhang G., Ghosh S. Toll-like receptor-mediated NF-kB activation: a phylogenetically conserved paradigm in innate immunity // The Journal of Clinical Investigation. - 2001. - Vol. 107, No.l. - P. 13.
поступила в редакцию 24.01.2003 принята к печати 05.04.2003
