CC BY
49
Медицинская иммунология 1999, Т. 1, № 5, стр 71-74 © 1999, СПб РО РА АКИ
Краткие сообщения
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ АДГЕЗИОННЫХ МОЛЕКУЛ НА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
Кузнецова С.А., Косицкая Л.С., Соколов Д.И., Фрейдлин И.С., Полосухина Е.Р.*,Барышников АЛО. *
Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Российский Онкологический Научный Центр им. Н.Н.Блохина*.
Резюме. При запуске воспаления одним из ключевых событий является активация эндотелиальных клеток, которая сопровождается индукцией экспрессии па этих клегках адгезионных молекул. Целью настоящего исследования явилась адаптация ИФАдля оценки экспрессии иіггерюїегочпьіх адгезионных молекул. ІСАМ-1 па человеческих зіідотелі шшішіх клетках перевиваемой линии ЕСУ-304 с использованием моноклональных антител ІСО-184/СО 54. Человеческие рекомбинантные цитокины 'ШР-а и 1РЫ-у повышали экспрессию ІСАМ-1 па эндотелиальных клетках, выступая в качестве снпершстов. Показаны возможности использования модифицированною варианта ИФАдля количественной оценки экспрессии ІСАМ-1 па эндотелиальных клетках и ее изменений под влиянием цитокипов.
Ключевые слова; Цитокины, адгезионные малетлы. эндотелиальные клетки
Kouznetsom S., Kositikaia L., Sokolov D„ Ireicllin I., Pobsiwhim I:., Baryshnikov A.
IDENTIFICATION OF AN INDUCIBLE INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE 1 EXPRESSION ON HUMAN ENDOTHELIAL CELL LINE ECV304, USING A CELL ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY.
Abstract. Activation of endothelium is a critical event during the initiation of inflammatory processes and is associated with the induction of cell adhesion molecules. The aim of the present study was to investigate the expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) on cultured human endothelial cells (ECV-304). The expression of ICAM-1 was ev;ilua!:ed by cell enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with monoclonal antibodies ICO-184/CD 54. Human recombinant TNF-a and IFN-y each significantly enhanced endothelial ICAM-1 expression. IFN-y plus TNF-a cotreatment synergistically increased ICAM-1 expression. These data demonstrate that the version of cell-based ELISA Ls suitable for testing the ability
of cytokines to modulate the expression of endothelial cell pp.71-74)
Формирование очага воспаления связало, прежде всего, с мобилизацией лейкоцитов из кровяного русла Выходу лейкоцитов из сосудов предшествуют процессы их адгезии к эндотелию и трапеэпдотелиалыюй миграции. Эндотелиальная клетка оказалась в центре событий, развивающихся в очаге воспаления [2]. Миграция лейкоцитов через эндотелий состоит из нескольких (]ш, в которых последовательно участвуют различные молекулы адгезии из семейств селектииов, иммуноглобулинов и иптегрипов. Семейство межклеточных молекул адгезии - ICAM
Адрес для переписки:
Кузнецова Светлана Анатольевна
197376, г.Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова 12, НИИ
Экспериментальной медицины РАМН, отдел иммунологии.
Е Mail: immun @ immun.iem.ras.spb.ru Тел.2341669, fax. 2349489
adhesion molecules. (Med. Immunol., 1999, vol.1, N5,
(Intercellular Adhesion Molecules) является представителем суперсемейсгва гена иммуноглобулина и насчитывает 3 члена (ICAM-1,2,3). Было показано, что ICAM-1 играет роль то взаимодействии лейкоцитов с воспаленным эндотелием, в то время как ICAM-2 - опосредует взаимодействие с 1 «воспаленным эндотелием, a ICAM-3 участвует в инициации иммунного ответа, обеспечивая межклеточные контакты лимфоцитов. Ite 3 молекулы ICAM являются сигнальными и Moiyr проводить сишал как и клетки, несущие ICAM (лейкоциты и эндотелиальные клетки), так и в клетки, несущие ее рецептор (лейкоциты) [1]. Умеренно выраженная экспрессия ICAM-1 на эндотелиальных клетках способствует адгезии и последующей миграции лейкоцитов в очаг воспаления. Снижение или повышение его экспрессии могут нарушать процессы мобилизации лейкоцитов, что ведет к развитию патологии.
Сниженная эксщхххия 1САМ-1 аа мембранах клеток-мишеней может препятствовать цитолизу инфицированных «прусами или злокачественно трапс^юрмироваппых клеток. Повышенная экспрессия 1САМ-1 на мембранах клеток-мишеней способствует иммунному повреждению тка-ней и нежелательна при аутоиммунных, аллершческих и хронических воспалительных заболеваниях, ншемнп ткана'’!, отторжении трансплантата [1,2,3]. Генетически обусловленный да}х.“1сг молекулы 1СЛМ-1 у нокаут-мышей проявляется нарушеппем воспалительных реакций, но не специфического иммунною ответа [5]. Растворимая (|х>р-ма 1СЛМ-1 циркулирует в крови, по отсутствует в спинномозговой и синовиальной жидкостях , моче и желчи. При обострении различных заболеваний уровень цирку-лирующих в крови молекул 1САМ-1 повышается, что коррелирует с клиническим течением аутоиммунных и рада опухолевьмгаболешишй, отторжением траиа1ла1 пат; 1, развитием неонагальпою сепсиса, бронхолегачиойпой дисплазии и других заболеваний [1,2,3].
Существуют различные методические подходы для оценки экспрессии адгезионных молекул па поверхности клеток. Для изучения уровня экспрессии молекул па мембранах клеток используются радиоиммуппый, имму-иофлуоресцептп1.1Й п метод проточной цигофлуоримет-рии [4,9,12], при работе со срезами тканей наиболее часто исполюуются иммупогистохимические методы [81, для изучения уровня тШЧА этих молекул применяется полимеразная ценная реакция, сопряженная с реакцией обратной транскрипции (ЯТ-РСЯ) [4]. При изучении поверхностного ([хшотипа эндотелиальных клеток наряду с перечисленными используется вариант иммупо<|>ермеп-тпого анализа (ИФА) [9,11], который имеет ряд преимуществ перед другими методами. Для проведения ИФА мопослоя культивируемых клеток не требуется специального дорогостоящего оборудования и реагентов, как в случае проточной цитофлуориметрии или ИТ-РСЯ. Объективность оценки результатов обеспечивается автоматизированным спектрофотометрическим учетом, что выгодно отличает метод от иммунофлуоресцептпого или иммуногистохимического методов, опирающихся па визуальную оценку. И наконец, использование ИФА но-зволяет изучать экспрессию поверхшхтных молекул клеток, не подвергавшихся перед этим трипсинизации. Метод ИФА был использовал ранее с целью выявления Е-сапекгипа 17,11], Р-селектииа [7], УСАМ-1 [7,9], 1САМ-1[7] па человеческих эндотелиальных клетках вены пупочного канатика (ЕШУЕС) [7,9], на синовиальных микровас-кулярных эндотелиальных клетках [И] и па синовиальных фибробластах [9]. В качестве модельных эндотелиальных клеток до сих пор чаще всего используется первичная культура НиУЕС, Однако к ее недостаткам относятся: трудоемкость выделения клеток и низкая воспроизводимость, связанная с индивидуальными особенностями допоров пупочных канатиков. В связи с этим наше внимание привлекла перевиваемая линия человеческих эндотелиальных клеток ЕСУ-304. В задачу ис-
следоваиня входила адаптация метода иммупофермепт-I ют анализа для оценки экспрессии молекул ICAM-1 па человеческих эндотелиальных клетках ECV-304.
Материалы и методы
Человеческие эндотелиальные клетки линии ECV-304 - это спонтанно трансформированные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), которые были охарактеризованы и поддерживаются в кулыуре уже более 10 лет [8]. Клегки линии ECV-304 обладают большинством характеристик и поверхностных маркеров эндотелиальных клеток, в том числе они экспрессируют I САМ -1, лимфоцитассоциироваї шьііі аі ітнгеї і LEA-
3, молекулы адгезии клеток сосудов VCAM -1 и Р-селек-тип, уровень которых изменяется в зависимости от условий культивирования [2,8,10]. Так как клетки линии ECV-304 не нуждаются в добавлении специальных ростовых факторов в культуральную сроду в настоящей работе использовали следующие условия культивирования: среда RPMI 1640 ("Биолот", Санкт-Петербург) с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США), 50 мкг/мл сульфата гепта-мицниа ( АО " Самсон", Сашст-Петербург) и дополненной 2 мМ L-глютамипа ("Flow Laboratories", Англия). Клетки линии ECV-304 являются мопослойпой культурой, требующей пересева 1 раз в 3-4 дня. Дезинтеграцию мопослоя для пересева вызывали 5-мипугпой экспози-I шеи со смесью 0,25% растворов триї їсиі іа и версена ("Биолот", Санкт-Петербург) в соотношении 1:3. После этого клетки помещали в лунки 96-лупочиого плоскодонного плапшега ("Sarstedt", США) в концентрации 30000-35000 клеток на лупку в 100 мкл культуральной среды и инкубировали 24 чага до получения сплошного мопослоя. После этого клетки инкубировали в присутствии изучаемых агентов в течение 24 или 48 часов. В качестве потенциальных индукторов экспрессии ICAM-1 использовали раствор форболмиристатацстата (ФМА), который готовили на диметмлсулы|хжсиде ("Sigma",США) и хранили при -20°С, рекомбинантные препараты человеческих цитокипов ТНФ-а - рефполип и ИФН-у - гаммас|>е-рои (НПО "Фермент", "Sanitas", Литва). После окончания инкубации для фиксации клеток во все лупки планшета вносили по 100 мкл 0,05% раствора глутаральдегида ("Reanal", Венгрия) па забус|х;реппом физиологическом растворе (ЗФР, рН=7,2). После 10-мипутной иш<убации при комнатной температуре 1 раз отмывали 150мклЗФР содержащим 0,05% твина-20 ("Serva", Германия).
Лиофилизироваппые моноклональные аігштела (мАт) клоп ICO-184 сі іецифичі іьіе іс CD54/ICAM-1 (Научі ю-про-изводствеппый цеіпр "МсдБиоСпекір", Москва) растворяли в 1 мл дистиллированной юды, согласно рекомендациям производителя, после чего дополнительно разводили средой RPMI1640, содержащей 5% ЭТС и 0,1% NaN3, и вносили в лупки в обьеме 100 мкл. В контрольные лупки вносили среду RPMI 1640 / 5% ЭТС / 0,1% NaNv не содержащую
Рис. 1. Титрованиелигандсвязывающей активности моноклональных антител клона ІСО-184 против С054/ІСЛМ-1 на эндотелиальных клетках линии ЕСУ-304, преинкубированных с ФМА (100 нг/мл).
По оси абсцисс -разведения мАт в культуральной среде.
По оси ординат- значения оптической плотности при длине волны 492 нм.
мАт. После инкубации в течение 1 часа во влажной атмос-(})ере с 5% С02 при 37°С іслстки отмывали 5 раз ЗФР, содержащим 0,05% тпшіа-20. Лпофилизированные палнклонадь-ные Ат к иммуноглсх'Зулннам мыши, меченные перокаша-зоп хрена ( НИИ вакщш и сывороток, Саикг-Пстербурт) растворяли в 7 мл среды ЯРМІ 1640 / 5% ЭТС / 0,1% К'аІЧ, и вносили во все лунки планшета в обт>еме 100 місі. После инкубации в течение 1 чага го влажной атмосфере с 5% С02 при 37°С и 5-кратиоп отмывки ЗФР, содержащим 0,05% твнна-20,гіроюдшиідопслшпіельііуюинкубацшоссубстрат-хромогашой смесыо, состоящей из 1 мг оргофенклендиа-мина ("5ідга"СШЛ) в 1 мл ціпрат-<|хх:(]штіого бус[)ера (рН=5), содержащего 0,06% перекиси водорода. Субстрат-Х]Х1МОШПіуіО смесь вносили по 100 мкл в лупку и инкуби-
ровали 5 мин к темнели Цветную рсакщио (Х'гананливали добавлением в каждую лунку 100 .мкл 1 М серной кислоты Оптическую плотность учитывали с помощью автоматичес-когоспект^хлиметра ("БЕТ^хс-т", Австрия) придание полны 492 нм. Экспрессию 1САМ-1 на клетках ЕСУ-304 выражали в единицах оптической платности. Средние значения оптической плотности в контрольных лунках принимали за фон н вычитали из псех остальных значений оптической плотности. Статистическую об|забстпсу полученных данных проводили с вычислением критерия Стьвдента
Результаты и обсуждение
Для тою 'побы определить рабочее разведение мАт, специфичных к СО 54/1САМ-1 сплошной моноспой клеток линии ЕСУ-ЗШ п]хдварителы-ю инкубировали течение 24 часов с ФМА (100 нг/мл). мАт 1СО-184, растворенные в 1 мл дистиллированной воды, разводили далее |ххгговой средой в ахггношелиях мАт/срсда 1:5 -1:2560 и добавляли эти разведения к проинкубированным с ФМА клеткам в объеме 100 мкл. Исходя из получеипых результатов титрования, которые представлены иа рис.1, было выбрало оптимальное |шведение мАт (в 30 раз, что соопхтствуст 1 мкг/мл белка), которое использовалось нами п дальнейшей работе.
Спонтанная экспрессия 1САМ-1 на клетках ЕСУ-304 оказалась слабо выраженной, что соответствует литературным данным, касающимся эндотелиальных клеток различного происхождения [4,7,8,13]. Инкубация с ФМА приводи-ла к закономерному повышению экспрессии 1САМ-1, что согласуется с литературными данными [7], это повышение было стойким, сохраняясь через 48 часов.
В качестве природных активаторов эндотелиальных клеток использовали провоспалительные цитокины 1РЫ-у и ТЫР-а Клепш линии ЕСУ-304 инкубировали в присутствии каждого из цитокипоп отдельно или в присут-
Таблица 1. ПОКАЗАТЕЛИ ЭКСПРЕССИИ 1САМ-1 НА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЕСУ-304 В ДИНАМИКЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ АКТИВАТОРОВ НА ЭТИ КЛЕТКИ
Условия инкубации клеток ЕСУ-304 Экспрессия 1САМ-1 в ед. оптической плотности (М±т) после инкубации клеток в течение
24 часов 48 часов
Ростовая среда (контроль) 0,814+0,036 (п=24) 0,81810,026 (п=8)
Ростовая среда с добавлением: ФМА (100 нг/мл) 1,98610,040* (п=4) 2,286+0,050* (п=4)
Т№-а (400Еа/мл) 1,85810,067* (п=24) 1,76310,034* (п=8)
ІРИ-у (400Ед/мл) 1,24310,033* (п=24) 1,136+0,015* (п=8)
ТОТ-а + ШЫ-у 2,19710,149* (п=12) 2,15710,074* (п=8)
* - отличие от уровня контроля достоверно (Р<0,001).
ствии комбинации :-тк щтжшюи в течение 24 или 48 часов. Как пидно из табл. 1, 'ГК'Р -а н концентрации 400 Ед/мл оказался более сильным индуктором экспрессии ІСЛМ-1 на эндотелиальных клетках, чем ІШ -у в -такой же концентрации, хотя последний тоже достоверно усиливал экспрессию этих молекул. В присутствии сочетания ІШ^у и тер-а в культуральной С[Х>де наблюдали э(|х[юкт усиления действия этих цитокинов: отличие средних величин экспрессии ІСЛМ-1 при инкубации со смесью цитокинов от уровней экспрессии ІСЛМ-1 при инкубации с каждым из цитокинов в отдельности оказалось статистически достоверным (ік0,01). Через 48 часов инкубации уровень индуцированной экспрессии ІСАМ-1 незначительно снижался, но оставался достаточно высоким по сравнению с неактивированными клетками, что говорит о пролонгированном действии цитокинов на клетки линии ЕСУ-304. Использованные нами концентрации цитокинов соответствовали ранее описанным для других клеток концентрациям, оптимальным для индукции различных адгезионных молекул [1,4,6].
Полученные результаты свидегельспзуют С) том, что предложенная нами модифицированная методика ИФА являеген не только вполне доступной, но и достаточно чувствительной и специфичной для изучения влияния различных факторов на экспрессию адгезионных молекул на поверхности эндотелиальных клеток. Данная модификация методики позволяет изучать кинетику изменений экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках, что представляет особый интерес при исследовании воспаления. В динамике развития воспаления в сосудистом русле и в воспалительном инфильтрате постоянно происходят изменения количества циркулирующих и инфильтрирующих клеток нейтрофилов, мононуклеарных фагоцитов, лим({юцитов. Эти изменения коррелируют со сменой адгезионных молекул, экспрессируемых эндотелиальными клетками. Синтез ІСАМ-1 в начале воспаления, как правило, воз|истает и достигает стабильного уровня экспрессии через 24 часа после начала воспаления. Регулирование экспрессии ІСАМ-1 может происходить на разных уровнях и часто зависит от типа клеток и индуктора [1,2]. Данное исследование подтверждает способность 1ПЧ-у и ТОТ-а индуцировать экспрессию С054/ ІСАМ-1 на эндотелиальных клетках человека. Этидвапро-воспалительных цитокга га являются выраженными синер-гистами в активирующем действии на экспрессию молекул ІСАМ-1 на эндотелиальных кпепш.
В настоящем исследовании показаны методические возможности модифицированного варианта ИФА с использованием моноклональных антител отечественного производства для количественной оценки экспрессии адгезионных молекул ІСАМ-1 на эндотелиальных клетках человека и изменений экспрессии этих молекул под влиянием отдельных цитокинов и их сочетаний. Метод может быть использован при поиске и конструировашей
препаратов, целенаправленно модифицирующих повер-хнехгшый ([хзнеггип эндотелиальных клеток
Работа поддержана Грантом РФФИ №97-04-48889.
Список литературы
1. Александров А.В., Джексон А.М., Румянцев А.Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM //- Иммунология.-1997.-МЫ.-С.4-11.
2. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взан-модсйстния.-М. 1995.
3. Ярилин A.A. Контактные межклеточные взаимодействия при иммунном ответе.// Медицинская иммунология.-1999,-Том 1,№ 1-2.-С.37-46.
4. Doukas J.,Pober J.S. IFN-y enhances endothelial activation induced by tumor necrosis factor but not IL-1.// J. of Immunol.-1990.-Vol.l45,No.6.-P.1727-1733.
5. Hatfield C.A., Brashler J.R., Winterrowd G.E. ct al. Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice have antibody responses but impaied leukocyte recruitment.// Amer.J. of Physiol- 1997.-Vol.273.No3 Pt 1.-P.L513-23.
6. Lopez-Peelrera C., Jardi М., Ingles-Esteve J. et al. Characterization of tissue factor expression on the human endothelial cell line ECV304.// Amer.J. of Hematol.- 1997-Vol.56.- P.71-78.
7. Melrose J., Tsurushita N.. Liu G., Berg E.L IFN-y inhibits activation-induced expression of E- and P-selectin on endothelial cells.//J. of Immunol.-1998.-Vol.161.- P.2457-2464.
8. Savage C.O., Brooks C.J., Adu D. et al. Cell adhesion molecule expression within human glomerular and kidney organ culture.//J. of Pathol.-1997.-Vol.l81.-P.lll-115.
9. Shang X., Lang B.J., Issekutz A.S. Adhesion molecule mcchanisms mediating monocyte migration through synovial fibroblast and endothelium barrier role for CD11/CD18, Veiy Late Antigen-4(CD49d/CD29), Veiy Late Antigen-5 (CD49e/CD29), and Vascular Cell Adhesion Molecule-1 (CD 106).//J. of Immunol.-1998.-Vol.l60.-P467-474.
10. Takahasi K., Sawasaki Y. Rare spontaneously transformed human endothelial cell line provides useful research tool.// In vitro Cell.Dev.Biol.-1992.-Vol.28.-P380-382.
11. To S.S., Newman P.M., Hyland V.J. et al. Regulation of adhesion molecule expression by human synovial microvascular endothelial cells in vitro. //Arthritis Rheum.-
1996.-Vol.39,No3.-P.467-477.
12. Vaporciyan A.A., Mulligan M.S., Warren J.S. et al. Up-regulation of lung vascular ICAM-l in rats is complement dependent.// J.of Immunol.-1995.-Vol,155.-P.1442-1449.
13. Wheller S.K., Perretti M. Dexamethasone inhibits cytokine-induced intercellular adhesion molecule-1 up-regulation on endothelial cell lines.// Eur. J. of Pharmacol-
1997,-Vol.331 -P.65-71.
поступила в редакцию 25.10.99 принята к печати 11.11.99
