CC BY
9УДК: 616. 216. 1-001-006. 5-031. 81:612. 017. 1
ИЗМЕНЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭОЗИНОФИЛИИ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ПОЛИПОЗНЫХ РИНОСИНУСИТАХ Б. Х. Давудова, М. З. Саидов, Н. А. Дайхес, С. В. Климова, А. С. Будихина, И. И. Нажмудинов
EOSINOPHILIA IN PERIPHERAL BLOOD AT POLYPOUS RHINOSINUSITIS. CHANGES OF CHARACTERISTICS OF INHERENT IMMUNITY DEPENDING ON B. Kh. Davudova, M. Z. Saidov, N. A. Daikhes, S. V. Klimova, A. S. Budikhina, I. I. Nazhmudinov
ФГУ Научно-клинический центр оториноларингологии Росздрава, г. Москва (Директор - проф. Н. А. Дайхес)
Дагестанская государственная медицинская академия, г. Махачкала (Зав. каф. патологической физиологии- проф. М. З. Саидов) ГНЦ - Институт иммунологии ФМБА России, г. Москва (Директор - академик РАН и РАМН, проф. Р. М. Хаитов)
Многочисленные исследования по проблеме полипозного риносинусита (ПРС) не привели до настоящего времени к принципиальным изменениям во взглядах на этиологию и патогенез этого заболевания. С учётом патогенетического значения эозинофилии в периферической крови и роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе ПРС, были изучены изменения показателей врождённого иммунитета in situ в системной циркуляции в группах прооперированных больных ПРС с наличием и отсутствием эозинофилии в периферической крови. Использовались иммуно-гистохимический метод исследования, а также метод проточной лазерной цитометрии. Результаты: 1. В составе клеточного воспалительного инфильтрата в носовых полипах при ПРС определяются клетки, позитивные с Toll-1 по Toll-10-рецепторы. 2. Между эозинофилией в периферической крови и экспрессией Toll-рецепторов определяется достоверная взаимосвязь, имеющая несомненное патогенетическое значение. 3. В группе больных ПРС с эозинофилией до 150 кл/мкл определяется достоверное усиление Toll-3 и Toll-9-рецепторов на моноцитах, Toll-2, Toll-3, Toll-5, Toll-9-рецепторов на гранулоцитах и Toll-3, Toll-5-рецепторов на лимфоцитах периферической крови. 4. В группе больных ПРС с эозинофилией свыше 150 кл/мкл определяется достоверное усиление Toll-1, Toll-2-рецепторов на моноцитах, Toll-4-рецептора на гранулоцитах и Toll-3, Toll-4, Toll-5-рецепторов на лимфоцитах периферической крови.
Ключевые слова: полипозный риносинусит, эозинофилия, Toll-рецепторы, метод проточной лазерной цитометрии, иммуногистохимический метод,, врожденный иммунитет
Библиография: 12 источников.
By the present, multiple investigations on the issue of polypous rhinosinusitis (PRS) have not led to principle changes of views on the disease etiology and pathogenesis. Taking in account pathogenetic significance of eosinophilia in peripheral blood and the role of inherent immunity mechanisms in PRS pathogenesis, changes of characteristics of inherent immunity in situ in the systemic circulation in groups of patients with PRS that underwent surgical intervention either at presence or absence of eosinophilia in peripheral blood have been studied. Immunohistochemical investigation technique as well as the method of laser flow cytometry has been used. Results: 1. At PRS, in the composition of cell inflammation infiltrate in nasal polyps, cells positive from То11-1 to Toll-10-receptors were revealed. 2. There has been discovered reliable relation of doubtless pathogenetic significance between eosinophilia in peripheral blood and Toll-receptors expression. 3. In the group of PRS patients with eosinophilia less than 150 cells/j l, the reliable increase of То11-3 and ТоИ-9-receptars on monocytes, Toll-2, Toll-3, Toll-5, Toll-9-receptors on granulocytes and Toll-3, Toll-5-receptors on peripheral blood lymphocytes was seen. 4. In the group of
^ 27 3^
PRS patients with eosinophilia above 150 cells/j l, the reliable increase of Toll-1, Toll-2-reseptors on monocytes, Toll-4-receptor on granulocytes and Toll-3, Toll-4, Toll-5-receptors on peripheral blood lymphocytes was detected.
Key words: polypous rhinosinusitis, eosinophilia, Toll-receptors, method of laser flow cytometry, immunohistochemical investigation technique, inherent immunity
Bibliography: 12 sources.
Многочисленные исследования по проблеме полипозного риносинусита (ПРС) не привели до настоящего времени к принципиальным изменениям во взглядах на этиологию и патогенез этого заболевания. Результаты регулярно проводимых международных консенсусных конференций по этой проблеме лишь подтверждают недостаточную изученность и понимание этой проблемы [2, 7, 9]. Ни один из применяемых на сегодняшний день методов терапии, включая топическую стероидную терапию, не позволяет контролировать симптомы, рецидивы и течение ПРС [3].
С учётом результатов клинико-иммунологических исследований многие авторы рассматривают ПРС как «астму носа» и относят ПРС к системным иммунозависимым заболеваниям [2, 4, 9]. Действительно, данные последних работ в этой области позволяют отнести ПРС к Th-2-зависимому эозинофильному воспалению слизистой оболочки носа, приводящему к нарушению коллагенового каркаса и, как следствие, к ремоделированию слизистой оболочки носа [11, 12]. Воспаление носит комплексный характер, но доминирующими элементами этого процесса являются следующие: превалирование эозинофилов в воспалительном инфильтрате, наличие в нём активированных форм Т- и В-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+ и CD20+ клеток), клеток макрофагально-моноцитарного ряда (CD35+, CD68+клеток), гиперпродукция про-воспалительных цитокинов (TNF-a, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИФ-у и др.), хемокинов (RANTES, eotaxin-1), адгезионных молекул (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, P-selectin), трансформирующих факторов роста (TGFa/P) и др. [3, 6, 7, 9, 11, 12]. Кроме этого необходимо упомянуть последние данные о том, что активированные формы эозинофилов в условиях продуктивного воспаления in situ приобретают свойства антиген(АГ)-презентирующих клеток, способных представлять растворимые АГ CD4+клеткам с последующей пролиферацией и «поляризацией» в ТЬ2+популяцию Т-лимфоцитов [6].
Очевидно, что представленные данные отражают весьма существенные изменения состояния местного иммунитета носовой полости у больных ПРС, имеющие несомненное патогенетическое значение. Эти изменения ассоциированы с одновременной модуляцией показателей системного адаптивного иммунитета. Однако, доминирующая роль эозинофилов в генезе ПРС очевидна. Не менее очевидна и связь морфогенеза носовых полипов с эозинофилией периферической крови. Эта связь тем более актуальна, что известное на сегодняшний день значение эозинофилии в генезе системных аллергических заболеваний (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит), гельминтозов, заболеваний желудочно-кишечного тракта и др. дополняет известные схемы патогенеза ПРС и открывает возможности для специфической диагностики и лечения этого заболевания.
В последнее время для объяснения иммунопатогенеза ПРС и других заболеваний привлекаются последние данные о роли врождённого иммунитета в индукции антиген(АГ)специфи-ческого иммунного ответа in situ [5, 8, 10]. Это обусловлено тем, что фундаментальные представления о механизмах индукции адаптивного иммунитета в настоящее время пересмотрены. Считается, что первым этапом индукции АГ-специфического адаптивного иммунного ответа является взаимодействие высококонсервативных компонентов микробной стенки со специфическим, генетически детерминированным рецепторным аппаратом, представленном на клетках врождённой иммунной системы (дендритные клетки, макрофаги, нейтрофилы и др.). Результатом этого взаимодействия является продукция провоспалительных цитокинов и активация АГ-специфических Т- и В-лимфоцитов. Представленная схема, разумеется, крайне упрощена, более детальная информация содержится, в частности, в обзорах [5, 10]. Наиболее изучены в этом отношении три класса рецепторов - Toll-подобные рецепторы, Nod-рецепторы
и RIG-рецепторы [5,10]. В клиническом отношении наиболее важны Toll-подобные рецепторы. Очевидно, что механизмы врождённого иммунитета играют немаловажную роль в имму-нопатогенезе ПРС.
С учётом патогенетического значения эозинофилии в периферической крови и роли механизмов врождённого иммунитета в патогенезе ПРС, целью нашего изучения были изменения показателей врождённого иммунитета in situ и в системной циркуляции в группах прооперированных больных ПРС с наличием и отсутствием эозинофилии в периферической крови.
Пациенты и методы
В работу включены 22 пациента (9 женщин и 13 мужчин) с клиническими диагнозами полипозный риносинусит или полипозный гаймороэтноидит. Больные находились на обследовании и лечении в 67 городской клинической больнице Москвы. Всем больным по клиническим показаниям была проведена операция полипотомии носа. В соответствии с целью настоящей работы все больные были разделены на две группы. 1 группа - с уровнем эозинофилов в периферической крови до 150 кл/мкл и 2 группа - с уровнем эозинофилов в периферической крови свыше 150 кл/мкл, поскольку по нормативным показателям состоянием эозинофилии считается количество этих клеток выше 150 кл/мкл. На каждого пациента была заведена индивидуальная карта наблюдения, куда вносилось в т. ч. и информированное согласие на проведение обследования и операцию. Весь операционный материал отправлялся на патоморфоло-гическое исследование; этот же материал использовался для иммуногистохимических исследований. Одновременно у всех пациентов перед операцией проводился забор крови на цитометрические исследования и на общий анализ крови. В качестве контрольной группы были взяты практически здоровые люди.
Иммуногистохимические исследования. Методика иммуногистохимических (ИГХ) исследований подробно описана нами в предшествующих публикациях [1]. Укажем только, что для тестирования Toll1-10 и Nod 2 рецепторов использовались моноклональные антитела (МАТ) и поликлональные антитела фирм SeroTec и Alexis, а также тест-система для визуализации результатов EnVision+Dual Link System-HRP, (DAB), Dako, которую можно применять для первичных мышиных и кроличьих АТ. Эти же антитела использовались и в проточной цито-метрии, что обеспечивало унифицированность полученных результатов. В качестве контроля использовались гистологические срезы биоптата интактной слизистой оболочки носовой полости, полученной во время операций. Все ИГХ-исследования были проведены на 4-микронных криосрезах, полученных со свежезамороженного материала на криостате «Leka» и зафиксированных в ацетоне. DAB-позитивные клетки как в носовых полипах, так и на препаратах интактной слизистой оболочки носа идентифицировались по коричневому окрашиванию мембраны и цитоплазмы клеток. В качестве негативного контроля по отношению к использованным для ИГХ-исследований антителам использовались мышиные и кроличьи иммуноглобу-линовые фракции от неиммунизированных животных.
Наиболее демонстративные препараты сканировались в световом микроскопе «Leica DMLB» со встроенной видеокамерой по программе «Leica QWin Colour for Image Analysis». Видеоизображения переносились на флеш-карту и воспроизводились в тексте работы. Все препараты были подвергнуты морфометрии. Морфометрические показатели определяли путем подсчета количества Toll1-10 и Nod2-позитивных клеток в нескольких полях зрения при ув. 400. с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типичные для данного препарата поля зрения.
Проточная лазерная цитометрия. Пробоподготовка для проточной цитометрии проводилась по стандартной процедуре. С этой целью ядросодержащие клетки периферической крови выделяли путём осаждения эритроцитов 3% раствором желатина. Перед внесением антител клеточная суспензия для исследования на экспрессию внутриклеточных Toll-3, 5, 7, 8, 9 и Nod2-рецепторов подвергалась предварительной обработке фиксирующим/пермеабилизирующим раствором. Изучение экспрессии остальных Toll-рецепторов не требовало обработки этим раствором, поскольку Toll-1, 2, 4, 6 и 10-рецепторы являются преимущественно мембран-ассо-циированными. Обработка вторичными анти-мышиными антителами, мечеными FITS или PE,
также соответствовала общепринятым стандартам. В качестве изотипического контроля цито-метрических замеров использовали IgG-фракцию от неимунизированных мышей. Конечная концентрация клеток для анализа составляла 2-10 /мл. Проточную лазерную цитометрию проводили на приборе FACSCalibur, с аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Цитограммы исследуемой клеточной взвеси выводили на основе регистрируемых параметров малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме «dot-plot». Анализ интенсивности флюоресценции и процента флюоресцирующих клеток проводили в зелёной области (FITS) FL1 (530 нм) и оранжевой области (PE) FL2 (585 нм). Клетки анализировались в лучах аргонового лазера при скорости потока 5000 клеток/сек. Среднюю интенсивность флюоресценции клеток выражали в условных единицах флюоресценции (УЕФ). Данные обрабатывались с помощью программы «Cell Quest».
Статистическая обработка. Описательная статистика включала в себя выведение медианы (Ме) и 25;75-процентилей для каждой из исследуемых выборок. При сравнении двух групп между собой использовался Т-критерий Манна-Уитни. При множественных сравнениях - критерии Крускала-Уолеса и Данна. Корреляционную взаимосвязь между изучаемыми параметрами определяли с помощью коэффициента корреляции Спирмена (r). Значения р<0,05 рассматривались как статистически значимые.
Результаты и обсуждение
Разделение больных ПРС на две группы - без эозинофилии и с эозинофилией в периферической крови не сопровождалось какими-либо особенностями в анамнезе или социально-бытовых условий. Однако процент больных с рецидивами носовых полипов (от 2-3 и более) в группе больных с уровнем эозинофилов до 150 кл/мкл, (медиана количества эозинофилов -51, 25;75 процентили - 6;111) составил 30%, а в группе больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл, (медиана количества эозинофилов - 284, 25;75 процентили - 219;265) составил 73%. Более чем двухкратное увеличение процента рецидивов во второй группе больных свидетельствует о прямой зависимости вероятности рецидивирования заболевания от эозинофи-лии периферической крови.
Патоморфологическое изучение ткани носовых полипов не выявило каких-либо особенностей у двух обследованных групп. Картина соответствовала строению либо отёчных, либо отёчно-фиброзных полипов. В таблице 1 представлены данные ИГХ-исследования экспрессии Toll 1-10- и Nod2-рецепторов в операционном материале обследованных больных. Видно, что, во-первых, на клетках воспалительного инфильтрата экспрессируются все исследованные Toll-рецепторы - от первого по десятый и, во-вторых, клеточная плотность DAB-позитивных клеток во всех случаях была незначительной и варьировала от 6 до 20 клеток в п/з при ув. 400. Статистически достоверное увеличение количества Toll-позитивных клеток было зарегистрировано в группе больных с эозинофилией до 150 кл/мкл, причём это касалось только Toll 8+ и Toll 9+ клеток. Важно заметить, что в контрольной интактной ткани слизистой носа уровень Toll-позитивных клеток был совершенно незначительным, а Toll-1, 3, 4, 5 и 9-позитивные клетки вообще не регистрировались. Морфологически DAB-позитивные клетки идентифицировались преимущественно как макрофаго- и фибробластоподобные, встречались мононуклеар-ные позитивные клетки, а также позитивные гранулоциты. Весьма информативным было определение реакции эпителия носовых полипов, поскольку эпителиальные клетки являются важнейшим компонентом врождённого иммунитета, Покровный эпителий, а также эпителий слизистых желёз был позитивным во всех случаях по Toll- 5, 6, 7 и 10 - рецепторам, в остальных случаях позитивная реакция варьировала от полного отсутствия до незначительной DAВ-окраски. Экспрессия Nod-2-рецептора полностью отсутствовала во всех группах и случаях.
Представленные результаты ИГХ-исследований ткани носовых полипов характеризуют состояние врождённого местного иммунитета в двух обследованных нами группах больных. Экспрессия всех Toll-позитивных клеток определяется на клетках воспалительного инфильтрата, на покровном эпителии и на эпителии слизистых желёз. Подобная картина имеет место в условиях продуктивного эозинофильного воспаления и подчёркивает многогранность патологического процесса при ПРС. Очевидно, что одновременное определение параметров врож-
дённого, но уже системного, иммунитета на клетках периферической крови при ПРС представляет собой очень важный блок информации, с точки зрения иммунопатогенеза ПРС, включая и взаимосвязи изученных показателей.
Таблица 1
Экспрессия Toll 1-10 и Nod 2-рецепторов на клетках воспалительного инфильтрата в носовых полипах в зависимости от эозинофилии в периферической крови, иммуногистохимические данные,
Ме (25;75процентили)
Больные с Больные с
Рецепторы эозинофилией до 150 кл/мкл n = 10 эозинофилией свыше 150 кл/мкл n=12 Контроль n=4
Toll 1 6 (5;7) 6 (2; 10) 0
Toll 2 9 (6;14) 7 (2,5;10) 1-2
Toll 3 8 (7;9) 6 (2,5;13) 0
Toll 4 9 (8; 18) 9 (7;22) 0
Toll 5 14 (12;34) 18 (5;20) 0
Toll 6 12 (9; 17) 12 (4; 12) 1-2
Toll 7 13 (11;18) 15 (11;17) 1-5
Toll 8 11 (6;13)* 5 (0,5;11) 1-2
Toll 9 10 (7;14)* 6 (2; 16) 0
Toll 10 20 (17;20) 16 (12;19) 1-4
Nod 2 0 0 0
Примечание: экспрессия Toll 1-10 и Nod 2-рецепторов в носовых полипах представлена в виде абсолютного количества DAB-позитивных клеток в п/з при ув.400; в контроле представлен диапазон количества DAB-позитивных клеток в п/з при ув.400; 0 - отсутствие DAB-позитивных клеток; *p<0,05 при сравнении групп больных с эозинофилией до 150 кл/мкл и выше 150 кл/мкл (T-критерий Манна-Уитни).
Таблица 2
Экспрессия Toll 1-10 и Nod 2 -рецепторов на моноцитах периферической крови в зависимости от эозинофилии, данные проточной цитометрии, Me (25;75процентили)
Рецепторы Условные единицы флюоресценции
больные с эозинофилией до 150 кл/мкл n = 10 больные с эозинофилией свыше 150 кл/мкл n=12 контрольная группа n=15
Toll 1 49 (30;68) 71 (57;90)* 30 (26;57)
Toll 2 105 (95;125) 105 (92;201)* 75 (69;146)
Toll 3 187 (109;246)* 79 (75;194) 73 (58;104)
Toll 4 114 (86;126) 198 (131;264) 78 (64;124)
Toll 5 771 (439;1393) 858 (795;1786) 486 (382;537)
Toll 6 166 (156;176) 190 (164;216) 166 (151;200)
Toll 7 187 (174;200) 191 (185;213) 275 (161;344)
Toll 8 42 (39;45) 40 (39;54) 42 (40;58)
Toll 9 500 (396;834)* 452 (325;599) 332 (271;391)
Toll 10 197 (195;199) 189 (177;201) 160 (141;177)
Nod 2 76 (68;83) 74 (72;89) 78 (72;98)
Примечание: *p<0,05 по сравнению с контрольной группой (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).
31 Ь.
В таблице 2 представлены результаты цитометрических исследований Toll-1-10 и Nod-2 рецепторов, экспрессированных на моноцитах у двух групп больных ПРС. Необходимо отметить, что в таблице представлены данные интенсивности флюоресценции моноцитов (в условных единицах флюоресценции), снятых в моноцитарном окне цитограмм больных по параметрам малоуглового светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC) в режиме «dot-plot». Видно, что в группе больных с эозинофилией до 150 кл/мкл статистически достоверное увеличение экспрессии Toll-рецепторов по сравнению с контрольной группой было зарегистрировано по отношению к Toll-3 и Toll-9 (р<0,05), а в группе больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл по отношению к Toll-1 и Toll-2-рецепторам (р<0,05). В целом, у больных ПРС экспрессия практически всех Toll-рецепторов была достоверно выше, либо имела тенденцию к повышению. Экспрессия Nod-2-ре-цептора, который являются внутриклеточным, практически не отличалась от контрольной группы. Интерпретация факта селективности усиления экспрессии Toll-рецепторов (в нашем случае Toll-1, Toll-2, а также Toll-3 и Toll-9) в терминах современной иммунологии является предметом отдельного анализа. В данном случае важна констатация изменения экспрессии конкретных Toll-рецепторов на конкретных клетках в двух исследованых группах больных ПРС, с целью изучения патогенетической связи этих фактов с эозинофилией в периферической крови.
Весьма интересным оказалось изучение корреляционных взаимосвязей между экспрессией Toll 1-10 рецепторов на моноцитах периферической крови и абсолютным количеством Toll 1-10-позитивных клеток в ткани полипов в зависимости от эозинофилии. Расчёт всех коэффициентов корреляции показал наличие достоверной прямой сильной связи по Toll-7-ре-цептору (r=0,875, p<0,05) и по Toll-8-рецептору (r=0,929, p<0,05). Таким образом, из всех Toll-рецепторов положительная достоверная корреляционная взаимосвязь определялась по отношению к Toll-7 и Toll-8 рецепторов в группе больных ПРС с эозинофилией свыше 150 кл/мкл.
В таблице 3 представлены данные цитометрии в двух обследованных группах в гранулоцитар-ном окне цитограмм. Видно, что в группе больных с эозинофилией до 150 кл/мкл статистически достоверное повышение интенсивности экспрессии зарегистрировано по отношению к Toll-2, Toll-3, Toll-5 и Toll-9-рецепторам по сравнению с контрольной группой. Напротив, интенсивность свечения Toll-8-рецептора в этой же группе была достоверно снижена, но по сравнению с группой больных ПРС с эозинофилией свыше 150 кл/мкл. Из всех Toll-рецепторов ингибиция экспрессии была зарегистрирована по отношению именно к этому рецептору. Подчеркнём, что речь идёт об экспрессии Toll-рецепторов на гранулоцитах периферической крови больных ПРС. В группе больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл усиление экспрессии было отмечено по отношению к Toll-4-рецептору, а ингибиция экспрессии по отношению к Toll-10-рецептору (р<0,05 в обоих случаях). Как видно в двух группах больных усиление и ингибиция экспрессии Toll-рецепторов определяется по отношению к разным видам этих рецепторов. Очевидна связь уровня эозинофилов и экспрессии конкретных типов Toll-рецепторов на гранулоцитах больных ПРС.
Оценка корреляционной взаимосвязи между экспрессией Toll 1-10 рецепторов на гранулоцитах периферической крови и абсолютным количеством Toll 1-10-позитивных клеток в ткани полипов в зависимости от эозинофилии в периферической крови выявила достоверную сильную обратную связь по Toll-4-рецептору (r=-1,000, p<0,05) и Toll-8-рецептору (r=-0,875, p<0,05), причём эти взаимосвязи отмечались исключительно в группе больных в эозинофилией свыше 150 кл/мкл. В группе больных с эозинофилией до 150 кл/мкл достоверных корреляционных взаимосвязей между показателями системного и местного врождённого иммунитета не определялось вообще. С учётом достоверности различий по интенсивности экспрессии Toll-рецепторов по сравнению с контрольной группой (табл. 3) и достоверности корреляционных взаимосвязей между экспрессией Toll-рецепторов на гранулоцитах в системной циркуляции и экспрессией Toll-рецепторов в носовых полипах, изученных ИГХ-методами, видно что достоверная связь касается только Toll-4 рецептора. Речь идёт об увеличении экспрессии этого рецепторов на гранулоцитах периферической крови с одновременным снижением количества Toll-4-позитивных клеток в ткани полипов. Почему это касается именно Toll-4-рецепто-ра является предметом отдельного изучения, однако очевидно, что модуляция активности этого рецептора представляется перспективным в отношении лечения больных ПРС. Интенсивность экспрессии Nod-2-рецептора не отличалась от контрольной группы.
Таблица 3
Экспрессия Toll 1-10 и Nod 2 -рецепторов на гранулоцитах периферической крови в зависимости от эозинофилии, данные проточной цитометрии, Me (25;75процентили)
Условные единицы флюоресценции
больные с больные с
Рецепторы эозинофилией до 150 эозинофилией свыше контрольная группа
кл/мкл 150 кл/мкл n=15
n = 10 n=12
Toll 1 50 (32;68) 49 (46;52) 28 (21;63)
Toll 2 69 (64;75)* 61 (44;97) 51 (31;58)
Toll 3 534 (247;1029)* 362 (335;833) 338 (222;516)
Toll 4 85 (77;94) 112 (71;123)* 58 (50;72)
Toll 5 6450 (3269;9213)* 3883 (3607;5462) 2357 (2191;2577)
Toll 6 59 (40;78) 25 (22;27) 42 (29;53)
Toll 7 - 306 (266;361) 504 (369;637)
Toll 8 197 (193;201)** 313 (266;386) 245 (210;304)
Toll 9 882 (554;1359)* 677 (513;1110) 510 (452;564)
Toll 10 - 202 (196;208)* 553 (392;711)
Nod 2 222 (220;224) 285 (271;299) 310 (276;364)
Примечание: *p<0,05 по сравнению с контрольной группой (критерии Крускала-Уоллиса и Данна); **p<0,05 по сравнению с группой больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).
Таблица 4
Экспрессия Toll 1-10 и Nod 2 -рецепторов на лимфоцитах периферической крови в зависимости от эозинофилии, данные проточной цитометрии, Me (25;75процентили)
Условные единицы флюоресценции
больные с больные с
Рецепторы эозинофилией до 150 эозинофилией свыше контрольная группа
кл/мкл 150 кл/мкл n=15
n = 10 n=12
Toll 1, % 11 (10;12) 12 (11;14) 11 (10;14)
Toll 2,% 14 (13;15) 14 (11;17) 11 (8;13)
Toll 3 96 (53;138)* 52 (44;75)** 44,5 (39;48)
Toll 4 32 (21;46) 48 (39;55)* 27 (23;29)
Toll 5 533 (195;860)* 300 (240;430)* 126 (99;160)
Toll 6,% 37 (26;48) 26 (20;31) 57,5 (47;65)
Toll 7 34 (33;34) 40 (37;42) 49 (38;52)
Toll 8 25 (23;27) 32 (28;37) 32 (27;33)
Toll 9 216 (185;485) 217 (186;331) 178 (156;227)
Toll 10,% 43 (35;50) - 34,5 (27;49)
Nod 2 37 (33;41) 45 (39;48) 45 (40;46)
Примечание: по Toll-3, 4, 5, 7, 8, 9- и №<12-рецепторам средняя интенсивность флюоресценции лимфоцитов представлена в условных единицах флюоресценции; по Toll 1,2,6,10 -рецепторам в процентах позитивных клеток; *p<0,05 по сравнению с контрольной группой (критерии Крускала-Уоллиса и Данна); **p<0,05 по сравнению с группой больных с эозинофилией до 150 кл/мкл (критерии Крускала-Уоллиса и Данна).
Не менее интересным оказались результаты изучения экспрессии Toll-рецепторов на лимфоцитах периферической крови. Данные представлены в таблице 4. Необходимо обратить внимание на особенность представленных результатов, а именно: часть данных представлена в виде процента позитивных лимфоцитов, другая - в виде интенсивности свечения клеток в лимфо-цитарном окне. Подобное деление обусловлено удобством анализа результатов и максимальной информативностью полученных данных. Видно, что в группе с эозинофилией до 150 кл/мкл статистически достоверное увеличение интенсивности экспрессии Toll-рецепторов по сравнению с контрольной группой затрагивает только Toll-3- и Toll-5-рецепторы (р<0,05). В группе же с эозинофилией свыше 150 кл/мкл статистически достоверное увеличение интенсивности экспрессии Toll-рецепторов распространялось уже на Toll-3, Toll-4 и Toll-5 (р<0,05), причём экспрессия Toll-3-рецептора в этой группе была одновременно достоверно выше по сравнению с контрольной группой и достоверно ниже по сравнению с группой больных с эозинофилией до 150 кл/мкл (р<0,05). Изучение корреляционных взаимосвязей между экспрессией Toll-ре-цепторов на лимфоцитах в системной циркуляции и количеством Toll-позитивных клеток в носовых полипах показало следующие результаты. В группе больных с эозинофилией до 150 кл/мкл достоверная положительная средняя взаимосвязь определялись по Toll-2-рецептору (г=0,619, p=0,05) и достоверная отрицательная слабая связь определялась по Toll-4-рецептору (г=-0,400, p<0,05). В группе больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл достоверная положительная средняя связь определялась по Toll-3-рецептору (r=0,627, p<0,05). С учётом указанных различий по интенсивности экспрессии Toll-рецепторов и корреляционных взаимосвязей между ними можно констатировать, что в группе больных ПРС с эозинофилией до 150 кл/мкл усиление экспрессии Toll-4-рецептора сопровождается уменьшением содержания этих клеток в ткани носовых полипов. Однако в группе больных с эозинофилией свыше 150 кл/мкл усиление экспрессии Toll-3-рецепто-ра сопровождается сопряжённым увеличением этих же клеток в ткани носовых полипов.
Таким образом, представленные результаты констатируют активное участие механизмов врождённого иммунитета в Th-2-зависимом эозинофильном воспалении слизистой оболочки носа при ПРС. Наличие достоверных различий и корреляционных взаимосвязей между Toll-позитивными клетками в системной циркуляции и in situ, а также очевидная зависимость между этими показателями и уровнем эозинофилии в периферической крови подчёркивает перспективность изучения этой проблемы с точки зрения разработки новых методов системной и/или топической иммунотерапии. Интерпретация иммунологических механизмов модуляции экспрессии Toll-рецепторов на клетках периферической крови и на клетках воспалительного инфильтрата в носовых полипах представляет собой отдельную научную проблему и составит предмет нашей следующей работы. Выводы:
1. В составе клеточного воспалительного инфильтрата в носовых полипах при полипозных риносинуситах (ПРС) определяются клетки, позитивные с Toll-1 по Toll-10-рецепторы.
2. Между эозинофилией в периферической крови и экспрессией Toll-рецепторов определяется достоверная взаимосвязь, имеющая несомненное патогенетическое значение.
3. В группе больных ПРС с эозинофилией до 150 кл/мкл определяется достоверное усиление Toll-3 и Toll-9-рецепторов на моноцитах, Toll-2, Toll-3, Toll-5, Toll-9-рецепторов на гранулоцитах и Toll-3, Toll-5-рецепторов на лимфоцитах периферической крови.
4. В группе больных ПРС с эозинофилией свыше 150 кл/мкл определяется достоверное усиление Toll-1, Toll-2-рецепторов на моноцитах, Toll-4-рецептора на гранулоцитах и Toll-3, Toll-4, Toll-5-рецепторов на лимфоцитах периферической крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Иммуногистохимические показатели местного иммунитета у часто болеющих детей/ Саидов М. З. [и др.]. // Иммунология - 2006 - N 2 - С. 108-112.
2. Международный консенсус по полипозному риносинуситу 2002-2004г. г. / Младина Р. [и др.] // Рос. ринология - 2005 - N 4 - C. 4-5
3. Портенко Г. М. Полипозные риносинуситы. М.: 2002, 158 с.
4. Рязанцев С. В. Полипозные риносинуситы у больных с бронхообструктивным синдромом. // Новости оториноларингологии и логопатологии - 2000 - N 3 (23) - С. 46-55.
Научные статьи
5. Хаитов Р. М.,Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Биология рецепторов врождённой иммунной системы. // Физиология и патология иммунной системы - 2008 - Т. 12 - N 6 -С. 3-28.
6. Blanchard C., Rothenberg M. Biology of the eosinophil. // Advances in Immunology - 2009 - V. 101 - P. 81-121
7. Gevaert P., Gevaert H. Eosinophilic inflammation: causative factors, triggers and mechanisms. // International Consensus on Nasal Polyposis, Update 2006, цит. Рос. ринология - 2006 - N 2 - С. 29.
8. Involvement of Toll-like receptors in the immune response of nasal polyp epithelial cells / Wang J. [et al.]. // Clin. Immunol. - 2007 - V. 124 - N 3 - P. 345-352.
9. Korono Y. The role of cytokine in eosinophilic infiltration into nasal polips. // International Consensus on Nasal Polyposis, Update 2006, цит. Рос. ринология - 2006 - N 2 - С. 31.
10. Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. // Nature - 2007 - V. 449 -N 18 - P. 819-826.
11. T-helper cell population and eosinophilia in nasal polyps / Cheng W. [et al.]. // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. - 2007 - V. 17 - N 5 - P. 297-301.
12. Th2 cytokines associated with chronic rhinosinusitis with polyps downregulate the antimicrobial immune function of human sinonasal epithelial cells. / Ramanathan M. J. [et al.]. // Am. J. Rhinol. - 2008 - V. 22 - N 2 - P. 115-121.
УДК:616. 323-007. 61:576. 8. 077. 3
ПРОДУКЦИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ
В ТКАНИ ГЛОТОЧНОЙ МИНДАЛИНЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ
ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНОМ СИНДРОМЕ У ДЕТЕЙ
М. В. Дроздова, А. С. Симбирцев, Е. А. Варюшина, Е. В. Тырнова
PRODUCTION OF PROINFLAMMATORY CYTOKINES BY
NASOPHARYNGEAL TONSIL (ADENOID) TISSUE IN CHILDREN WITH
CHRONIC LYMPH PROLIFERATIVE SYNDROME
M. V. Drozdova, A. S. Simbirtzev, E. A. Varushina, E. V. Tyrnova
ФГУ Санкт-Петербургский НИИ уха, горла, носа и речи Росмедтехнологий
(Директор - Засл. врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
ФГУП Гос. НИИ Особо чистых биопрепаратов ФМБА России, г. Санкт-Петербург (Директор - проф. В. П. Добрица)
Исследована продукция ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-1бета, ИЛ-1альфа в ткани глоточной миндалины при хроническом лимфопролиферативном синдроме у детей 3-8 лет. Материал: 1-2 биоптата от 42 детей (32 аденотомиии, 10 аденотонзиллотомии). Методы: непрямая иммуногистохи-мия с использованием системы экстравидин-биотин-щелочная фосфатаза, гистохимия нейт-рофилов по миелопероксидазе с использованием диаминобензидина. У 16 детей ВЭБ, ЦМВ-ин-фекция (паст-инфекция, ПЦР+ ДНК ВЭБ, ЦМВ в соскобах со слизистой ротоглотки). У 15 детей АСЛ-О > 200 МЕ/мл. У 11 детей неясная этиология. Результаты: наличие продукции каждого ИЛ у 25-75% при герпетической инфекции, 91-100% при стрептококковой и неясной этиологии. Интенсивность продукции: ИЛ-1альфа 0,25, ИЛ-1бета 0,25, ИЛ-6 0,5, ИЛ-8 0,93 при ВЭБ, ЦМВ-инфекции;от 1,4 до 1,73 при стрептококковой инфекции. С возрастанием АСЛ-О продукция провоспалительных цитокинов повышалась, но не выше умеренного уровня. Заключение: механизм иммуносупрессии различен при герпесвирусной и стрептококковой этиологии.
Ключевые слова: иммуногистохимия, провоспалительные цитокины, глоточная миндалина.
Библиография: 16 источников.
Production of Il-6, Il-8, Il-1beta, and Il-1alpha by nasopharyngeal tonsil (adenoid) tissue is investigated in children of 3-8 years with chronic lymph proliferative syndrome. Material: 1-2 biopsies from 42 children (32 adenectomy, 10 adenotonsilectomy). Methods: indirect immunohistochemistry with the use of system of extravidin-biotin-alkaline phosphatase, the neutrophil myeloperoxidase histochemistry with the use of diaminobenzidin. At 16 children with VEB, CMV-infection (past-infection,
^ 35 b,
