CC BY
6© Коллектив авторов, 2021 Вопросы онкологии, 2021. том 67, № 5
УДК 616.24-006
DOI 10.37469/0507-3758-2021-67-5-665-674
А.С. Мартьянов12, Ф.В. Моисеенко3, А.С. Жабина3, Т.Н. Соколова14, С.А. Белухин3,
Т.А. Лайдус1-2, М.М. Холматов12, В.И. Тюрин12, Н.М. Волков3, Е.Ш. Кулигина12, Г.А. Янус1-
2
Изменения концентрации циркулирующей в плазме опухолевой ДНК в первые часы таргетной терапии позволяют прогнозировать ответ опухоли у пациентов с EGFR-зависимым раком легкого
1 НМИЦ онкологии им. H.H. Петрова Минздрава россии, Санкт-Петербург
2 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет»
Минздрава россии
3 ГБУЗ «Санкт-Петербургский клинический научно-практический центр специализированных видов
медицинской помощи (онкологический)
Развитие современных высокочувствительных методов детекции мутаций позволило «жидкостной» биопсии стать полноценной альтернативой стандартной «тканевой» биопсии и войти в клиническую практику для неинвазивного анализа злокачественных новообразований. Чрезвычайно значимым приложением «жидкостной» биопсии стал мониторинг течения заболевания в ходе терапии. Целью данного исследования являлся анализ изменений циркулирующей в плазме свободной ДНК (цоДНК), происходящих в первые часы после начала терапии ингибиторами тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKI). В исследование было включено 30 больных немел-коклеточным раком легкого (НМРЛ), связанным с мутациями в гене EGFR. От каждого пациента получали серийные образцы плазмы: непосредственно перед приемом первой таблетки и через 0,5, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 ч после начала терапии. Концентрацию му-тантных аллелей EGFR в плазме измеряли с помощью цифровой-капельной ДНК (ddPCR). Копии цоДНК, содержащие EGFR мутации, были обнаружены в стартовой точке у 25 из 30 (83%) участников исследования. Применение таргетного препарата ингибитора EGFR приводило к немедленным колебаниям концентрации циркулирующих фрагментов, причем обнаруженные «паттерны» динамики можно было условно отнести к трем категориям: а) постепенное снижение уровня цоДНК; б) продолжающееся увеличение количества мутант-ных копий EGFR; в) чередующиеся всплески и падения концентрации цоДНК. В качестве единого контрольного пункта для измерения динамики цоДНК была выбрана точка «48 часов» после начала приема препарата. Двенадцать (50%) из 24 информативных пациентов показали снижение содержания цоДНК
за этот период более чем на 25%; у всех этих пациентов рентгенологические исследования подтвердили стабилизацию (SD) или частичный регресс (PR) опухолевого процесса («контроль заболевания») в течение 8-12 следующих недель. У остальных 12 человек уровень EGFR-мутантной цоДНК либо возрос (п=7), либо остался неизменным (п=5). 10 из 12 пациентов с повышенным или стабильным уровнем цоДНК достигли объективного ответа опухоли через 4 нед, но только 5 из них по-прежнему демонстрировали «контроль заболевания» через 8-12 нед (р=0,014 по сравнению с группой со снижением цоДНК). падение количества циркулирующих мутантных копий EGFR также коррелировало с более длительной выживаемостью без прогрессиро-вания (ВБП; 14,7 мес против 8,5 мес, р=0,013). полученные данные свидетельствуют о том, что мониторинг концентрации ДНК с EGFR-мутацией в плазме в течение первых часов терапии ТК1 может использоваться в качестве непосредственного (предиктора) ответа опухоли на лечение.
Ключевые слова: НМРЛ; EGFR; циркулирующая опухолевая ДНК; терапия ТК1; опухолевый ответ
Введение
Периферическая кровь, полученная от онкологического больного, как правило, содержит свободно циркулирующие злокачественные клетки, а также их фрагменты — тканеспеци-фичные белки и нуклеиновые кислоты. Анализ циркулирующей опухолевой ДнК (цоДнК) является чрезвычайно перспективным направлением, поскольку она содержит в точности те же генетические и эпигенетические альтерации, что и «материнская» опухоль. Ключевое ограниче-
ние «жидкостной биопсии» — это малая концентрация опухолевой ДНК в пуле растворенных в плазме разнообразных «нормальных» нуклеиновых кислот. Современные аналитические методы способны преодолеть эти трудности и детектировать даже единичные мутантные молекулы на фоне избытка фрагментов неопухолевого происхождения (Bettegowda и соавт., 2014; Gobbini и соавт., 2020). Энергичные усилия направлены на адаптацию "жидкостной биопсии" для ранней диагностики и мониторинга опухолевых заболеваний (Akhoundova и соавт., 2020; Charo и соавт., 2021). Полагают, что концентрация цоДНК в плазме пропорциональна общей массе опухоли (Abbosh и соавт., 2017; Strijker и соавт., 2020), таким образом, вполне закономерен тот факт, что цоДнК относительно легко обнаруживается у пациентов с распространенным опухолевым заболеванием, а уменьшение опухолевой массы в результате терапевтического воздействия, как правило, приводит к падению уровня цоДнК в периферической крови (Anagnostou и соавт., 2019; Ebert и соавт., 2020).
Уменьшение размера опухоли под действием терапии объясняется несколькими биологическими эффектами. Классическая химиотерапия и таргетные препараты обладают цитостатическим действием, то есть предотвращают пролиферацию неопластических клеток (Serkova и Eckhardt, 2016). Кроме того, данные категории препаратов вызывают регресс опухоли за счет активации запрограммированной клеточной гибели (апоптоза или аутофагии) (Jiang и соавт., 2020). Терапевтический эффект, который часто достигается после нескольких недель или месяцев системной терапии, почти всегда сопровождается снижением концентрации циркулирующих маркеров, будь то опухолеспецифические белки или цоДнК (Reece и соавт., 2019; Fukuhara и соавт., 2020). Что же касается событий, происходящих в неопластических очагах в первые часы после получения противоопухолевого препарата, то они до сих пор остаются практически недоступными для изучения. В этой связи весьма перспективной представляется идея использования преимуществ «жидкостной биопсии» (в частности, анализ концентрации фрагментов ДНК с опухолевой мутацией в плазме), для неинвазивного раннего мониторинга краткосрочных эффектов EGFR-TKI. В качестве модели для такого эксперимента мы выбрали EGFR-зависимый немел-коклеточный рак легкого (НМРЛ).
Ингибиторы тирозинкиназы EGFR (EGFR-TKI; гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, осимер-тиниб и др.) высокоэффективны при НМРЛ, несущем активирующую мутацию в экзонах 19 или 21 гена EGFR (Sequist и соавт., 2013). Применение EGFR-TKI в этих случаях почти всегда
сопровождается объективным ответом опухоли или стабилизацией заболевания. Существуют примеры немедленного облегчения симптомов в течение первых же часов после введения препарата — так называемый «эффект Лазаря» (Conci и соавт., 2020). Эти факты говорят о практически мгновенном запуске соответствующих сигнальных каскадов и противоопухолевых процессов. Краткосрочные последствия EGFR-TKI на уровне цоДНК до сих пор не анализировались. Задачей данного исследования было изучить, каким образом введение EGFR-TKI влияет на концентрацию цоДнК в плазме в течение первых часов после приема препарата, и имеют ли эти изменения значение при прогнозе долгосрочных эффектов таргетной терапии.
Материалы и методы
В исследование приглашали пациентов с локализованным или метастатическим EGFR-позитивным НМРЛ, проходивших лечение в Санкт-Петербургском городском онкологическом центре в период с августа 2018 г. по март 2020 г., ранее не получавших таргетной терапии. Тестирование мутации EGFR в опухолевой ткани проводилось, как описано Moiseyenko и соавт. (2010). Все пациенты дали информированное согласие на участие в эксперименте. Исследование было одобрено местным этическим комитетом.
Характеристики 30 пациентов, включенных в работу, представлены в табл. 1. От каждого больного получали 10 серийных образцов плазмы: перед приемом первой таблетки («нулевая точка») и через 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 ч после начала терапии (рисунок 1). Кроме того, всем пациентам было предложено сдать кровь на 14-й и 28-й день лечения. EGFR-TKI назначали в обычных суточных дозах (гефитиниб: 250 мг; эрлотиниб: 150 мг; афатиниб: 40 мг; осимертиниб: 80 мг). Оценка раннего ответа проводилась с помощью компьютерной томографии (КТ) на 4-й неделе, а затем в течение 8-12 нед после начала терапии. Объем опухоли рассчитывали с помощью RadiAnt DICOM Viewer V.4.5.9.18463.
Анализ цоДНК. Образцы крови (10 мл) собирали в пробирки cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes (Norgen), и отделяли плазму от остальной части образца с помощью двухэтапного центрифугирования (400 g в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим 14400 g в течение 10 мин при 4 °С). Внеклеточную ^ell-free) ДНК экстрагировали с помощью набора QIAamp Circulating Nucleic Acid kit из 3-5 мл плазмы в соответствии с инструкциями производителя и растворяли в 50 мкл стерильной воды.
Содержание фрагментов ДНК с мутацией EGFR (де-леции 19 экзона или замены L858R) измеряли с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием системы QX100 Bio-Rad. Реакции ddPCR проводили в трех повторах для каждого образца. реакционная смесь включала 2X ddPCR Supermix for Probes (no UTP, Bio-Rad), мутант-специфические олигонуклеотиды и 2-3 мкл матричной ДНК в общем объеме реакции 22-23 мкл. Анализ данных проводился с помощью программного обеспечения QuantaSoft версии 1.7.4 в соответствии с рекомендациями производителя. Все реакции ddPCR, в результате которых было получено 10 или более капель с таргетной молекулой ДНК, считались информативными. Абсолютное количество "мутантных" копий ДНК опухолевого происхождения в 1 мл плазмы (Cmut) рассчитывали по формуле:
Таблица 1. Пациенты с НМРЛ, вызванным мутациями в гене EGFR, включенные в исследование
N %
Пол ж 26 87%
М 4 13%
Средний возраст (тт — тах) 68,4 (52-81)
Мутация EGFR ех^е1 20 67%
L858R 10 33%
Метастазы в легких 16 53%
Метастазы в печени 3 10%
Вовлечение плевры 6 20%
Метастазы в надпочечниках 2 7%
Метастазы в костях 10 33%
Метастазы в лимфоузлах 6 20%
Метастазы в мозг в стартовой точке 7 25%
Среднее число метастатических очагов (тнп-тах) 1,7 (1-4)
ECOG 0 1 3%
1 25 83%
2 2 7%
3 2 7%
4 0 0
Средний суммарный объем поражения (мм3) 60 841 (23 — 490 590)
Средний объем наибольшего поражения (мм3) 54 833 (14 — 490 509)
Лекарственное средство Гефитиниб 20 67%
Эрлотиниб 5 17%
Афатиниб 3 10%
Осимертиниб 2 7%
30 пациентов с НМРЛ
Рис. 1. Схема исследования
Concentration cfDNA^j х V template х V dilution
где: concentration — число «мутантных» капель на 1 мкл ddPCR реакции; V template — объем образца (аликвоты) цоДНК, взятой в ddPCR, мкл; V di|ution — общий объем образца цоДНК, полученной из плазмы, мкл; V p|asma — объем плазмы, из которого получили цоДНК, мл.
Статистическая обработка. Количественные данные были представлены в виде медианных значений/размаха или средних значений с доверительным интервалом ±95% (1.960ax~). Для сравнения медиан использовались непараметрический критерий знаковых рангов Вилкоксона и U-критерий Манна-Уитни. Значение р<0,05 считалось статистически значимым. Все расчеты проводились с использованием программного пакета IBM SPSS v.23.
Результаты
Включенным в исследование пациентам провели КТ-исследование после 4 нед применения ингибиторов тирокиназы (TKI). В 25 случаях задокументирован частичный ответ опухоли (PR), у 3 пациентов достигнута стабилизация опухолевого процесса (SD) и двое прогрессировали (PD) на фоне лечения (табл. 2). 29 пациентов продолжили терапию TKI (28 случаев с «контролем заболевания» (SD+PR) и 1 случай c PD). 25 пациентам повторно было произведено Кт обследование через 8-12 нед после начала лечения; 5 человек выбыли по следующим причинам: 3 пациентов перенесли циторедуктивную операцию, 1 больной отказался от обследования из-за мер предосторожности против COVID-19, и 1 пациент умер на 6-й неделе лечения после внезапного ухудшения состояния.
Все включенные в исследование пациенты были подвергнуты анализу цоДНК в «нулевой точке», перед началом приема препарата. EGFR-мутантная (EGFR+) ДНК была обнаружена в плазме у 25/30 (83%) субъектов (см. табл. 2, рис. 1). «Плазма-негативными» считали те образцы, в которых количество мутантных копий, циркулирующих в 1 мл плазмы, не превышало 5. Как и ожидалось, общий объем опухолевых поражений был явно выше у пациентов с достоверным уровнем EGFR+цоДНК в плазме (здесь и далее — «плазма-позитивных») по сравнению с «плазма-негативными» пациентами, однако эти различия не достигли статистической значимости (29463 мм3 vs. 9963 мм3, p=0,552). Вероятность обнаружения EGFR+цоДНК в «нулевой точке» не коррелировала с возрастом или полом пациента, количеством метастатических зон или типом мутации EGFR (см. табл. 2). Первая Кт-оценка ответа опухоли на 4-й неделе после начала терапии зафиксировала тенденцию к более выраженному уменьшению объема опухоли в группе «плазма-позитивных» пациентов по сравнению с «плазма-негативными» (-61% vs.
-18,5%, р=0,208). Эта тенденция не сохранилась после 8-12 нед лечения (см. табл. 2). Пациенты с изначально детектируемой в плазме мутацией EGFR имели более короткий показатель выживаемости без прогрессии (ВБП), чем «плазма-негативные» больные [11,4 мес га. 21,0 мес, р=0,238].
Ни у одного из 5 пациентов, «плазма-негативных» на старте, циркулирующая мутация так и не появилась на фоне анти-EGFR терапии. Остальные 25 субъектов продемонстрировали разнонаправленные изменения в количестве цоДНК (см. табл. 2, 3, рис. 1). У одного из этих субъектов, пациента #ПрОД, в 1-й день лечения случился перелом бедренной кости на месте метастатического поражения; травма вызвала резкое увеличение концентрации EGFR+ ДНК в плазме; этот пациент был сочтен неинформативным для дальнейшего анализа. В остальных случаях анализ изменений концентраций цоДНК, происходящих в течение первых 48 ч лечения, выявил несколько типов динамических паттернов (см. табл. 2, 3). Некоторые пациенты демонстрировали более или менее плавное снижение содержания цоДНК в течение первых двух дней терапии (#ДаАА, #ЗаНА, #ИгВС). У других (#ОгЛФ, #ЗаНИ) наблюдалась тенденция к постепенному увеличению количества циркулирующих EGFR-мутантных копий. В одном случае был зафиксирован относительно стабильный уровень цоДНК в течение всего периода наблюдения (#РоИВ). У большинства пациентов наблюдались менее последовательные вариации в содержании цоДНК, представленные рядом скачков и падений (#СуГИ, #ВаОГ, #СеЕК, #БеСН и т. д.). очевидно, что не все исследованные нами временные точки в период от 0 до 48 ч являлись одинаково информативным для оценки общего вектора динамики цоДНК. Мы определили, что колебания уровня цоДНК, зафиксированные на 48-м часу от начала терапии, наилучшим образом коррелируют с клинико-патологическими параметрами, в частности с ВБП. разница в 25% между исходным и конечным измерением расценивалась нами как достоверное снижение или увеличение уровня цоДНК.
Двенадцать (50%) из 24 информативных пациентов показали снижение концентрации цоДНК в плазме более чем на 25% (среднее снижение: -85%; диапазон: от -100% до -49%) через 48 ч после начала лечения. У всех этих пациентов документирована стабилизация или регресс заболевания по данным контрольных КТ через 4 и 8-12 нед терапии (см. табл. 2, 3). Примечательно, что у одного из двух пациентов, перенесших операцию в период наблюдения, отмечен полный патологический (положительный) ответ опухоли.
Таблица 2. Клинико-патологические характеристики больных НМРЛ в зависимости от изменения уровня
EGFR+цоДНК на фоне анти-EGFR терапии
«Плазма-позитивные» (в стартовой точке)* «Плазма-негативные» (в стартовой точке)* Группы пациентов с разными паттернами динамики EGFR+цоДНК в плазме
n=25 n=5 P value позитивные vs. негативные «1» (n=12) «t/=» (n=12)** P-value «1» vs. «t/=» «t» (n=7) «=» (n=5)
ctDNA, Cmut *** Base-line: Медиана [min — max] 161 [16 to 4351] 0 [0] - 299 [7 to 2071] 117 [6 to 4093] NS (MannWhitney U test) 114 [27 -4093] 127 [6 -2841]
цоДНК, **** Процент изменения (%) Cmut (0h) to Cmut (48h) Медиана [min — max] -45 [-100 to 254,5] -85 [-100,0 to -48,7] 37 [-21,4 to 276,3] 95 [35,6 -276,3] -11 [-21,4 to 16,7]
Пол
Мужчины 3 (12%) 1 (20%) NS (Fisher exact test) 2 1 NS (Fisher exact test) 1 0
Женщины 22 (88%) 4 (80%) 10 11 6 5
Возраст, лет Медиана [min — max] 70 [52 to 82] 67 [59 to 81] NS (MannWhitney U test) 70 [63 to 79] 69,5 [52 to 82] NS (MannWhitney U test) 70 [52 to 82] 66 [61 -70]
Отдаленные Mts (M)
M1 20 (80%) 4 (75%) NS (Fisher exact test) 11 8 0,312 (Fisher exact test) 4 4
МО 5 (20%) 1 (25%) 1 4 3 1
Число метастатических очагов Медиана [min — max] 2 [0 to 4] 1 [0 to 4] NS (Fisher exact test) 1 [1 to 3] 2 [0 to 4] NS (Fisher exact test) 2 [0 to 4] 2,5 [0 to 3]
EGFR мутация
ex19del 16 (64%) 4 (80%) NS (Fisher exact test) 7 8 NS (Fisher exact test) 5 3
L858R 9 (36%) 1 (20%) 5 4 2 2
EGFR-TKI
Gefitinib 16 (64%) 4 (80%) N (Chi-Square test) 8 7 0,254 (Chi-Square test) 6 1
Erlotinib 4 (16%) 1 (20%) 3 1 0 1
Afatinib 3 (12%) 0 0 3 1 2
Osimertinib 2 (8%) 0 1 1 0 1
Base-line: Суммарный объем опухоли, V (мм3). Медиана [min — max] 29463 [23 to 490590] 9963 [37 to 175455] 0,552 (MannWhitney U test) 34527,5 [23 to 159943] 23575 [37 to 490590] NS (MannWhitney U test) 24360 [166 to 111270] 4875 [37 -490590]
4-я неделя: 1-й RECIST ответ
Всего, n 25 (100%) 5 (100%) 12 (100%) 12 (100%) 7 (100%) 5 (100%)
CR 0 0 0,045 (Fisher exact test) 0 0 NS (Fisher exact test) 0 0
PR 22 (88%) 3 (63%) 11 (92%) 10 (83%) 7 (100%) 3 (60%)
SD 1 (4%) 2 (25%) 1 (8%) 0 0 0
PD 2 (8%) 0 0 2 (17%) 0 2 (40%)
DCR (CR+PR+SD), n (%) 23 (92%) 5 (100%) NS (Fisher exact test) 12 (100%) 10 (83%) NS (Fisher exact test) 7 (100%) 3 (60%)
4-я неделя: Изменения объема опухоли (%) **** Медиана [min — max] -61,1 [-95,0 to 27,3] -18,5 [-97,5 to 0,89] 0,214 (MannWhitney U test) -62,1 [-86,9 to 8,4] -65,7 [-95,0 to -0,02] NS (MannWhitney U test) -61,1 [-95,0 to -43,9] -81,4 [-91,4 to 27,30]
«Плазма-позитивные» (в стартовой точке)* «Плазма-негативные» (в стартовой точке)* Группы пациентов с разными паттернами динамики EGFR+цоДНК в плазме
8-12-я неделя: 2-й RECIST ответ
Не доступны***** 4 1 2 2 0 2
Total, n 21 (100%) 4 (100%) 10 (100%) 10 (100%) 7 (100%) 3 (100%)
CR 0 0 0,173 (Fisher exact test) 0 0 0,017 (Fisher exact test) 0 0
PR 14 (67%) 2 (50%) 8 (80%) 5 (50%) 3 (43%) 2 (67%)
SD 2 (10%) 2 (50%) 2 (20%) 0 0 0
PD 5 (24%) 0 0 5 (50%) 4 (57%) 1 (33%)
DCR (CR+PR+SD), n (%) 16 (76%) 4 (100%) NS (Fisher exact test) 10 (100%) 5 (50%) 0,032 (Fisher exact test) 3 (43%) 2 (67%)
8-12-я неделя: Изменения объема опухоли (%) **** Медиана [min — max] 0,0 [-99,4 to 2661,1] -2,64 [-42,8 to 19,0] NS (MannWhitney U test) 0 [-70,6 to 108,8] -6,7 [-99,4 to 2622,1] NS (MannWhitney U test) 41,0 [-75,4 to 2660,1] -6,7 [-99,4 to 153,2]
Продолжение снижение опухолевого объема (с 4-й по 8-ю неделю EGFR-TKI терапии)
Да 8 (38%) 2 (50%) NS (Fisher exact test) 4 4 Ns (Fisher exact test) 3 1
Нет 13 (62%) 2 (50%) 6 6 4 2
ВБП, мес, [95% CI] Kaplan-Meier method 11,37 [11,2411,70] 21,03 [na] 0,238 (Breslow test) 14,7 [10,3315,81] 8,5 [6,278,07] 0,013 (Breslow test) 9,2 [5,5712,87] 6,1 [4,078,19]
Прогрессия
Да 18 (72%) 2 (40%) 0,300 (Fisher exact test) 8 (67%) 9 (75%) Ns (Fisher exact test) 6 (86%) 3 (60%)
Нет 7 (28%) 3 (60%) 4 (33%) 3 (25%) 1 (14%) 2 (40%)
Примечание. NS — недостоверные различия (P value >>0,05); ВБП — время без прогрессирования; RECIST: CR — полный ответ, PR — частичный ответ SD — стабилизация, PD — прогрессирование, DCR — «контроль заболевания», disease control rate (CR+PR+SD).
* «Плазма-позитивными» считали пациентов, у которых количество мутантных копий, циркулирующих в 1 мл плазмы, было более 5; ** пациент #PrOD исключен из анализа динамики цоДНК из-за травмы (см. текст); *** Cmut — число мутантных копий EGFR на 1 мл плазмы; **** процент изменения (Percentage change)=(New Value — Initial Value)/(Initial Value) x 100%; ***** 5 пациентов не прошли второго КТ-исследования на 8-12-й неделе терапии (см. текст); ****** статус на 20 июля, 2020.
Кривые Каплана-Майера
Пациенты со снижением уровня EGFR+ цоДНК (43 ч us. base-line)
Пациенты со стабильным или возросшим уровнем EGFR+ цоДНК (4S ч vs. base-line}
"уровень цоДНК снизился" censofed "уровень цоДНК стзбипен/во^рос" censofed
Пациенты со снижением уровня цоДНК: PFS = 14.7 мое |95%С!: 10.33 - 15.81). N - 12
Пациенты со стабильным/возросшим уровнем цоДНК : PFS = 8.5 м« [95% Cl: 6.27 - 3.07]. N - 12
Р = Q.013 (В reslow (generalized Wilcoxon) tes!)
Рис. 2. Анализ параметра ВБП в группах пациентов с разной динамикой EGFR+цоДHК в первые часы анти-EGFR терапии
Таблица 3. Серийные измерения концентрации EGFR+цоДНК в плазме крови больных НМРЛ на фоне первых
часов анти-EGFR терапии
Код EGFR Концентрация EGFR+цоДНК (Cmut*) Изменения в цоДНК (48ч vs. base-line** Ответ опухоли (4 нед) Ответ опухоли (8-12 нед) ВБП, мес
0 30' 1 h 2 h 3 h 6 h 12 h 24 h 36h 48 h 2 wks 4 wks RECIST RECIST
BaAG ex19del 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 nd nd 0 PR PR 8,47
BaAU ex19del 328 456 267 257 388 326 587 715 659 153 0 0 PR PR 11,47
BeSN L858R 127 142 142 209 167 713 1273 636 360 129 8 nd = PD na 2,30
VaOG L858R 29 50 72 38 30 39 56 90 35 84 40 67 î PR PD 2,67
GeRD ex19del 114 67 52 80 53 65 0 193 100 157 0 0 î PR PD 3,23
GuLB ex19del 13 6 4 3 0 3 6 0 13 0 0 0 PR PR 21,80
DaAA L858R 48 58 24 44 32 45 48 30 22 0 nd nd PR PR 13,77
ZaNA ex19del 270 159 112 55 159 159 96 33 32 5 nd nd PR PR 11,37
ZaIV L858R 14 0 0 0 0 0 11 11 0 11 nd nd = PD PD 7,00
Igvs ex19del 1180 929 677 736 880 982 445 309 167 291 0 0 PR PR 13,07
IlGM ex19del 479 392 305 785 437 395 498 266 435 199 0 0 PR na (pCR, MPR 4)*** 13,37
KoVA ex19del 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 SD SD 3,23
LeLM L858R 42 61 135 81 46 66 0 0 53 82 3 0 î PR PD 11,43
LeNN ex19del 1278 1340 593 2222 3168 2042 728 6798 400 1004 nd nd = PR PR 7,17
LyLK L858R 7 0 4 0 8 0 0 0 0 0 0 nd PR SD 8,77
MiAI ex19del 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 PR na 21,03
MiND ex19del 49 23 51 10 0 15 31 28 29 0 nd nd PR na (pPR, MPR 2)*** 11,53
MuNP ex19del 6 19 26 18 9 23 3 21 2 7 0 0 = PR na 3,70
NiGA L858R 1584 1619 1100 924 1734 2033 1698 1910 859 730 nd nd PR PR 13,30
NoIE L858R 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 nd nd 0 PR PR 15,77
OgLF ex19del 4093 4093 6367 8318 5751 6352 15404 13408 29340 15404 nd nd î PR PR 9,97
PrOD ex19del 4351 6077 5023 5559 9949 18883 12576 11099 12115 18403 nd nd Исключен**** PR PR 13,97
RoIV ex19del 2841 2891 2828 2766 1340 2451 4035 3872 1545 2523 nd nd = PR PR 6,97
SaNI ex19del 119 90 94 96 153 105 171 261 347 232 21 21 î PR PR 13,90
SeEK ex19del 27 24 26 13 19 23 15 67 21 78 0 0 î PR PD 6,53
SmEI ex19del 161 65 80 132 138 129 96 104 9 60 nd nd SD SD 3,9
TiNY L858R 845 787 48 32 15 239 394 150 46 47 nd nd PR PR 16,76
FiZE ex19del 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 nd nd 0 SD SD 9,40
CeIH ex19del 3623 4819 4715 4094 4612 4129 4025 4911 4727 4911 3105 nd î PR PR 16,77
SuGI L858R 2071 2074 3168 3014 3212 1141 3590 1672 781 1063 nd nd 1 PR PR 5,97
Примечание. nd — нет данных; na — пациент не прошел КТ-обследование: BeSN — умер на 6-й неделе, IlGM, MiAI, MiND — перенесли циторедуктивную операцию в период между 4-й и 8-12-й неделями терапии, MuNP — не прошел КТ-обследование из-за эпидемиологической обстановки. * Cmut — число мутантных копий EGFR на 1 мл плазмы (по данным ddPCR); ** изменения в концентрации EGFR+цоДНК в точке «48 часов» по сравнению с «нулевой точкой» (base-line): — Cmut % change <-25%; «î» — Cmut % change >25%; «=» — Cmut % change ~ 0±25%; «0» — изначально «плазма-негативные» случаи; *** циторедуктивная операция / MPR — Major Pathological Response; **** пациент #PrOD исключен из анализа динамики цоДНК из-за травмы (см. текст).
У остальных 12 человек к окончанию вторых суток применения EGFR-TKI содержание EGFR+цоДНК либо осталось неизменным (n=5), либо увеличилось (n=7) (см. табл. 2, 3). Среднее увеличение уровня цоДНК в последней группе составило 95% (диапазон: от 36% до 276%). 10 из 12 пациентов с повышенным или стабильным уровнем цоДнК достигли объективного ответа через 4 нед, но только 5 из 10 прошедших КТ-контроль пациентов по-прежнему демонстрировали «контроль заболевания» через 8-12 нед лечения (p=0,014 по сравнению с группой с уменьшением цоДНК); у остальных больных к этому времени уже началось прогрессирование заболевание (PD); еще один пациент умер до момента второго обследования (см. табл. 2, 3).
Снижение концентрации мутантных фрагментов в плазме к 48 часу приема EGFR-ТКИ было ассоциировано со значительно более длительным ВБП (14,7 мес в группе со снижением цоДНК vs. 8,5 мес в группе без снижения цоДНК, p=0,013; см. табл. 2; рис. 2).
Обсуждение
EGFR-ТКИ характеризуются относительно быстрой абсорбцией, при этом пиковые концентрации в плазме достигаются в течение нескольких часов после приема таблетки (Nakamura и соавт., 2010). По данным экспериментов in vitro и in vivo, минимальные концентрации препарата, которые обладают достоверным противоопухолевым эффектом, значительно ниже, чем стандартные терапевтические дозы EGFR-TKI (Cayssials и соавт., 2020). Следовательно, объяснимо, что некоторые пациенты испытывают явное облегчение симптомов в течение первых часов после начала лечения (Langer и соавт., 2009; Conci и соавт., 2020). Действительно, исследования ингибирования EGFR в клеточных линиях показали, что введение EGFR-TKI приводит к немедленным биологическим последствиям. Воздействие TKI вызывает снижение аутофосфорилирования рецептора EGFR с последующим подавлением ERK, AKT, STAT3 и других сигнальных белков; все эти события наблюдаются в течение 10-30 мин после добавления TKI в среду для культивирования клеток (Ono и соавт., 2004; Wu и соавт., 2013). Уменьшение массы опухоли после терапии EGFR-TKI, вероятно, связана как с прекращением пролиферации клеток, так и с индукцией апоптоза (Fung и соавт., 2012; Zhao и соавт., 2016). Некоторые данные показывают, что иммунные механизмы также могут способствовать уменьшению размеров опухоли (Ayeni и соавт., 2019). Использование магнитно-резо-
нансной томографии (МРТ) в экспериментах на животных выявило доказательства регрессии опухоли уже в течение 1-7 дней после введения TKI (Venugopalan и соавт., 2016; Jia и соавт., 2019). Следовательно, сам факт отмеченного нами немедленного изменения уровня EGFR-мутированной цоДНК в плазме в ответ на поступление в опухоль препарата, согласуется с доклиническими наблюдениями.
Нам удалось обнаружить мутации EGFR в плазме у 25/30 (83%) пациентов в «нулевой» точке, что весьма близко к опубликованным данным (Normanno и соавт., 2017; Kim и соавт., 2020). Наши наблюдения также подтверждают выводы о том, что изначальное отсутствие EGFR-мутантных копий в плазме коррелирует с улучшением показателей безрецидивной выживаемости (Fukuhara и соавт., 2020; Molina-Vila и соавт., 2020). Так же как и другие исследователи (Riediger и соавт., 2016; Phallen и соавт.
2019), мы зафиксировали временное повышение уровня цоДНК в течение первых часов лечения в некоторых, но не во всех случаях. Остается неизвестным, связаны ли эти изменения с массовым выделением опухолевых клеток в ответ на лекарство или другими причинами.
Настоящее исследование демонстрирует, что клинический ответ на TKI можно с определенной долей уверенности предсказать с помощью анализа немедленных изменений концентрации мутантной цоДНК в плазме. Неясно, должны ли неблагоприятные результаты этого плазменного теста побудить клинициста к коррекции терапевтической схемы? В дальнейшем предстоит разобраться, какие именно дополнительные опции могут быть предложены пациентам с потенциально плохим ответом по данным «жидкостной биопсии». В этой связи представляют интерес исследования, подтверждающие перспективность комбинированного применения ингибиторов EGFR-TKI и антиангиогенных или цитотоксических препаратов (Yu и соавт.,
2020).
Финансирование
работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 18-75-10070
ЛИТЕРАТУРА
1. Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA. et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution // Nature. 2017;545(7655):446-451.
2. Akhoundova D, Mosquera Martinez J, Musmann LE et al. The Role of the Liquid Biopsy in Decision-Making for Patients with Non-Small Cell Lung Cancer // Journal of clinical medicine. 2020;9(11):3674.
3. Anagnostou V, Forde PM, White JR et al. Dynamics of tumor and immune responses during immune checkpoint
blockade in non-small cell lung cancer // Cancer research. 2019;79(6):1214-1225.
4. Ayeni D, Miller B, Kuhlmann A et al. Tumor regression mediated by oncogene withdrawal or erlotinib stimulates infiltration of inflammatory immune cells in EGFR mutant lung tumors // Journal for immunotherapy of cancer. 2019;7(1):1-15.
5. Bettegowda C, Sausen M, Leary R et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies // science translational medicine. 2014;6(224):224ra24-224ra24.
6. Cayssials E, Torregrosa-Diaz J, Gallego-Hernanz P et al. Low-dose tyrosine kinase inhibitors before treatment discontinuation do not impair treatment-free remission in chronic myeloid leukemia patients: Results of a retrospective study // Cancer. 2020;126(15):3438-3447.
7. Charo LM, Eskander RN, Okamura R et al. Clinical implications of plasma circulating tumor DNA in gynecologic cancer patients // Molecular oncology. 2021;15(1):67-79.
8. Conci N, Dall'Olio FG, Comellini V et al. «Lazarus effect» in patient affected by lung adenocarcinoma carrying EGFR, CTNNB1, MET exon 11 and PIK3CA mutations treated with gefitinib // Precision Cancer Medicine. 2020;3(23):1-5.
9. Ebert EBF, McCulloch T, Hansen KH et al. Clearing of circulating tumour DNA predicts clinical response to first line tyrosine kinase inhibitors in advanced epidermal growth factor receptor mutated non-small cell lung cancer // Lung Cancer. 2020;141:37-43.
10. Fukuhara T, Saito H, Furuya N et al. Evaluation of plasma EGFR mutation as an early predictor of response of erlotinib plus bevacizumab treatment in the NEJ026 study // EBioMedicine. 2020;57:102861.
11. Fung C, Chen X, Grandis JR, Duvvuri U. EGFR tyrosine kinase inhibition induces autophagy in cancer cells // Cancer biology & therapy. 2012;13(14):1417-1424.
12. Gobbini E, Swalduz A, Levra MG et al. Implementing ctDNA Analysis in the Clinic: Challenges and Opportunities in Non-Small Cell Lung Cancer // Cancers. 2020;12(11):3112.
13. Yu HA, Schoenfeld AJ, Makhnin A et al. Effect of osimertinib and bevacizumab on progression-free survival for patients with metastatic EGFR-mutant lung cancers: a phase 1/2 single-group open-label trial // JAMA oncology. 2020;6(7):1048-1054.
14. Jia Y Li X, Jiang T et al. EGFR-targeted therapy alters the tumor microenvironment in EGFR-driven lung tumors: Implications for combination therapies // International journal of cancer. 2019;145(5):1432-1444.
15. Jiang M, Gu DN, Dai JJ et al. Dark side of cytotoxic therapy: Chemoradiation-induced cell death and tumor repopulation // Trends in cancer. 2020;6(5):419-431.
16. Kim JO, Shin JY Kim SR et al. Evaluation of Two EGFR Mutation Tests on Tumor and Plasma from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer // Cancers. 2020;12(4):785.
17. Langer CJ. The «lazarus response» in treatment-naive, poor performance status patients with non-small-cell lung
cancer and epidermal growth factor receptor mutation // J Clin Oncol. 2009;27(9):1350-1354.
18. Moiseyenko VM, Procenko SA, Levchenko EV et al. High efficacy of first-line gefitinib in non-Asian patients with EGFR-mutated lung adenocarcinoma // Oncology Research and Treatment. 2010;33(5):231-238.
19. Molina-Vila MA, Stahel RA, Dafni U et al. Evolution and clinical impact of EGFR mutations in circulating free DNA in the BELIEF trial // Journal of Thoracic Oncology. 2020;15(3):416-425.
20. Nakamura Y Sano K, Soda H et al. Pharmacokinetics of gefitinib predicts antitumor activity for advanced non-small cell lung cancer // Journal of Thoracic Oncology. 2010;5(9):1404-1409.
21. Normanno N, Denis MG, Thress KS et al. Guide to detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in ctDNA of patients with advanced non-small-cell lung cancer // Oncotarget. 2017;8(7):12501.
22. Ono M, Hirata A, Kometani T et al. Sensitivity to gefitinib (Iressa, ZD1839) in non-small cell lung cancer cell lines correlates with dependence on the epidermal growth factor (EGF) receptor/extracellular signalregulated kinase 1/2 and EGF receptor/Akt pathway for proliferation // Molecular cancer therapeutics. 2004;3(4):465-472.
23. Phallen J, Leal A, Woodward BD et al. Early noninvasive detection of response to targeted therapy in non-small cell lung cancer // Cancer research. 2019;79(6):1204-1213.
24. Reece M, Saluja H, Hollington P et al. The use of circulating tumor DNA to monitor and predict response to treatment in colorectal cancer // Frontiers in genetics. 2019;10:1118.
25. Riediger AL, Dietz S, Schirmer U et al. Mutation analysis of circulating plasma DNA to determine response to EGFR tyrosine kinase inhibitor therapy of lung adenocarcinoma patients // Scientific reports. 2016;6(1):1-8.
26. Sequist LV, Yang JC, Yamamoto N et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations // Journal of clinical oncology. 2013;31(27):3327-3334.
27. Serkova NJ, Eckhardt SG. Metabolic imaging to assess treatment response to cytotoxic and cytostatic agents // Frontiers in oncology. 2016;6:152.
28. Strijker M, Soer EC, de Pastena M et al. Circulating tumor DNA quantity is related to tumor volume and both predict survival in metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma // International journal of cancer. 2020;146(5):1445-1456.
29. Venugopalan A, Lee M, Niu G et al. EGFR-targeted therapy results in dramatic early lung tumor regression accompanied by imaging response and immune infiltration in EGFR mutant transgenic mouse models // Oncotarget. 2016;7(34):54137.
30. Wu K, Chang Q, Lu Y et al. Gefitinib resistance resulted from STAT3-mediated Akt activation in lung cancer cells // Oncotarget. 2013;4(12):2430.
Поступила в редакцию 26.04.2021 г.
A.S. Martianov12, F.V. Moiseenko3, A.S. Zhabina3, T.N. Sokolova1, S.A. Belukhin3, T.A. Laidus1,2, MM. Kholmatov12, V.I. Turin12, N.M. Volkov3, E.S. Kuligina1,2, G.A. Yanus1,2
Changes in the concentration of EGFR-mutated plasma DNA in the first hours of anti-EGFR therapy allow the prediction of tumor response in patients with EGFR-driven lung cancer
1 N.N. Petrov National Medical Research Centre of Oncology, St Petersburg 2 Saint-Petersburg State Pediatric Medical University, St Petersburg
3 Saint-Petersburg clinical scientific and practical center for specialised types of medical care (oncological), St Petersburg
This study aimed to analyze changes in the plasma concentration of EGFR-mutated DNA occurring immediately after the start of therapy with EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs). The study included 30 patients with EGFR mutation-driven non-small cell lung cancer (NSCLC). Serial plasma samples were collected before intake of the first tablet and
at 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 hours after the start of the therapy. EGFR-mutated plasma DNA (EGFR+ ctDNA) was detectable at diagnosis in 25 out of 30 study participants. There were different patterns of changes of the amount of circulating tumor DNA, i.e., the consistent decline of ctDNA content, or continuing increase of the number of circulating EGFR mutant copies, or alternating spikes and drops in the ctDNA concentration. Correlation with the disease outcome was observed only for the measurement performed at 48 hours. Twelve (50%) out of 24 informative patients showed >25% reduction of the ctDNA content at 48 h time point; all these patients demonstrated disease control after 4 and 8-12 weeks of therapy. The remaining 12 individuals showed either stable content of circulating EGFR+ DNA (n=5) or the elevation of ctDNA concentration (n=7). 10 of 12 patients with elevated or stable ctDNA level achieved an objective response at 4 weeks, but only 5 of 10 evaluable patients still demonstrated disease control at 8-12 weeks (p=0.014, when compared to the group with ctDNA decrease). The decline of the amount of circulating EGFR mutant copies also correlated with longer progressionfree survival (PFS; 14.7 months vs. 8.5 months, p=0.013). Conclusion: Monitoring of plasma EGFR-M+ concentration within the first hours of the TKI therapy may be used as an immediate predictor of tumor response to the treatment.
Key words: NSCLC; EGFR; circulating tumor DNA; TKI therapy; tumor response
