CC BY
80
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 >ДК 615.387.014.4.07
ИЗМЕНЕНИЯ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СГУСТКА ПРИ ХРАНЕНИИ ТРОМБОЦИТНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ, ЗАГОТОВЛЕННЫХ РАЗНЫМИ МЕТОДАМИ
Ройтман Е.В.1'2, Колесникова И.М.1, Карпова О.В.\Трахтман П.Е.1, Румянцев С.А.1,2,3,
Андрианова М.Ю.1, Бондар Е.В.1
'ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава России, 117997, Москва; 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, 117997, Москва; 3ФГБОУ ВПО Московский физико-технический институт (государственный университет), 141700, Московская область, Долгопрудный
Резюме. Исследовали гемостатические свойства тромбоцитов на разных сроках хранения тромбоцитных концентратов (ТК) и в зависимости от способа их заготовки. Изучено 26 образцов ТК, заготовленного на 100% плазме (ТК-П), и 24 образца ТК, заготовленного с использованием добавочного раствора в объеме 70% (ТК-ДР). Исследования проводили в день заготовки ТК, через 24 ч, на 3-й и 5-е сутки хранения. При хранении как ТК-П, так и ТК-ДР установлено уменьшение активности реакций тромбо-цитарных гранул и межтромбоцитарного взаимодействия. Активированные тромбоциты утрачивали свое влияние на свойства образующегося в ТК-П сгустка к 3-м суткам хранения. Общее качество сгустка в процессе хранения ТК-П ухудшалось, снижалась его упругость. В ТК-ДР влияние активированных тромбоцитов на свойства сгустка отсутствовало на протяжении всего периода хранения. Со дня заготовки и до 3-х суток в ТК-ДР прослеживалось постепенное ухудшение качества сгустка, снижение его упругих и деформационных свойств. Целесообразно, чтобы срок хранения ТК независимо от способа их заготовки не превышал 5 сут.
Ключевые слова: тромбоцитный концентрат; хранение; сгусток; упругость; тромбоэласто-графия; агрегация тромбоцитов.
CHANGES IN HEMOSTATIC CHARACTERISTICS OF THE CLOT AFTER STORAGE OF PLATELET CONCENTRATES PREPARED BY DIFFERENT METHODS
Roitman E.V.12, Kolesnikova I.M.', Trakhtman P.E.', Rumyantsev S.A.123, Andrianova M.Yu.', BondarE.V.'
'Dmitry Rogachev Federal Research and Clinical Center of Pediatric Hematology, Oncology, and Immunology, Moscow, Russia; 2N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia;3Moscow Physical Technological
Institute, Moscow Region, Dolgoprudnyi, Russia
Summary. The hemostatic characteristics of platelets were tested during various periods of storage of platelet concentrates (PC) prepared by different methods. Twenty-six PC specimens prepared on 100% autologous plasma (PC-P) and 24 specimens prepared with the use of 70% plasma substituting solution (PC-PSS) were studied. The testing was carried out on the day of PC preparation, after 24 h, and on days 3 and 5 of storage. The activity of platelet granule reactions and of interactions between platelets reduced with storage in PC-P and PC-PSS. Activated platelets could no longer modify the characteristics of the clot forming in PC-P by day 3 of storage. The quality of the clot generally deteriorated during storage, its elasticity reducing. In the PC-PSS the activated platelets could not modify the clot throughout the entire period of storage. The quality of the clot in these samples gradually deteriorated from the day of preparation to day 3, its elastic and deformation characteristics reduced. It is advisable that the duration of PC storage be no longer than 5 days, irrespective of the method of their preparation.
Key words: platelet concentrates; storage; clot; elasticity; thromboelastography; platelet aggregation.
Поступающие в организм пациента тромбоциты - это живые клетки. Основная их роль заключается в способности быстро сформировать «пробку», которая закроет место повреждения сосуда. Однако качество тромбоцитарного сгустка не в последнюю очередь зависит от тех изменений, которые происходят с тромбоцитами на разных сроках хранения тромбоцитных концентратов (ТК), а также от различных способов их заготовки.
Для корреспонденции:
Ройтман Евгений Витальевич, доктор биол. наук, профессор, руководитель лаборатории физиологии и патологии гемостаза ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Минздрава России; профессор кафедры онкологии, гематологии и лучевой терапии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Саморы Машела, д. 1. Телефон: +7 (495)287-65-70 доб. 5908. E-mail: roitman@hemostas.ru
Мнения о сохранении гемостатических свойств тромбоцитов значительно различаются. В 1998 г. Т. Яслс1 и соавт. [1] показали, что при хранении способность тромбоцитов инициировать ретракцию сгустка и усиливать его гидродинамическую устойчивость не изменяется, даже несмотря на функциональные нарушения агрегации и агглютинации. К сходным заключениям пришли 8. 8ПсЫ;ег [2] и
Кое1о£Ггеп и соавт. [3]. Однако позднее Я. СИ агата и соавт. [4] отметили ухудшение в процессе хранения гемостатических свойств тромбоцитов, заготовленных аферезным способом, а также указали на предсказуемо меньший гемостатический результат их переливания пациентам с тромбоцитопенией.
В свою очередь процедура заготовки, процес-синга и хранения тромбоцитов сопровождается изменениями их морфологических и функциональных характеристик, что также может приводить к снижению терапевтической эффективности трансфузион-
ной терапии [5, 6]. Одним из способов сохранения количества и функциональной активности тромбоцитов в течение длительных сроков хранения является использование добавочных растворов (ДР) при заготовке ТК [7-9]. Считается, что входящий в состав ДР цитрат натрия должен препятствовать активации тромбоцитов, а магний и калий, снижая связывание резидуального фибриногена с рецепторами GPIIb/IIIa, предотвращают тем самым агрегацию тромбоцитов [10, 11]. Однако детальные исследования, демонстрирующие изменения гемостатических возможностей тромбоцитов и свойств образующегося сгустка, практически не встречаются.
Целью данной работы явилось изучение гемостатических свойств тромбоцитов на разных сроках хранения ТК и в зависимости от способа их заготовки.
Материалы и методы
ТК были получены от здоровых лиц (доноров), прошедших рутинное обследование и выразивших согласие на проведение процедуры автоматического афереза. Заготовка ТК была проведена двумя способами: в 100% донорской плазме и с использованием добавочного раствора SSP+ («MacoPharma», Франция). Аферезные ТК были получены на автоматизированном сепараторе клеток крови Trima Accel («Teramo ВСТ», США), версия 6.0. Установленный объем добавочного раствора SSP+ добавляли сразу по окончании процедуры афереза в расчете на конечную концентрацию тромбоцитов не менее 5-6 • 109 на 40 мл. При этом соотношение донорской плазмы и добавочного раствора SSP+ составляло 1:3 (30% аутологичной плазмы и 70% добавочного раствора SSP+). Объем ТК, заготовленных обоими способами, составлял от 320 до 570 мл, средний объем ТК - 458,46 мл, клеточность -4,8-8,5 • 10", средняя концентрация тромбоцитов -6,85 • 1011. Все заготовленные ТК были лейкоредуцирова-ны с помощью встроенной в расходный материал камеры лейкоредукции LRS с обязательным последующим лабораторным контролем. Все ТК, использованные в исследовании, содержали менее 106 лейкоцитов, и хранились в интегрированных полимерных контейнерах производства компании «Caridian ВСТ» (США) в течение 5 дней со дня заготовки при температуре 20-24°С в термостате при постоянном помешивании.
Изучено 26 образцов ТК, заготовленных асептично на 100% плазме (ТК-П), и 24 образцов ТК, заготовленных с использованием добавочного раствора SSP+ в объеме 70% (ТК-ДР). Исследования проводили в день заготовки ТК, через 24 ч, на 3-й и 5-е сутки хранения.
Перед процедурой кровосдачи доноры подписывали «Согласие субъекта на обработку данных», соответствующее требованиям статьи 9 Федерального закона от 27.07.06 «О персональных данных» № 152-ФЗ, и предоставляющее право на использование данных, а также заполняли «Анкету донора», фиксирующую их согласие на использование крови (плазмы) так, как это необходимо больным людям. Оценку образцов ТК проводили в рамках контроля качества компонентов крови.
Для характеристики гемостатических свойств ТК и оценки свойств образующегося сгустка использовали тромбоэластографию (TEG 5000, "Haemoscope", США)
i АДФ
Коллаген 1хЩ Ристомицин
Рис. 1. Динамика агрегационной активности тромбоцитов (в %) в ответ на индукторы на разных сроках хранения тромбоцитно-го концентрата, заготовленного в 100% донорской плазме.
с растворами аденозинтрифосфата (АДФ) в собственной модификации, основанной на методике исследовании ци-тратной плазмы. Материалом исследования служили образцы тромбоконцентратов. Результатом единичного исследования считали различие, выраженное в процентах, между значениями одноименных показателей, полученных при постановке ТЭГ с индуктором и без него.
Исследовали следующие показатели: время R (в мин); время К (в мин); угол (в градусах); максимальную амплитуду МА (в мм); модуль упругости Е (модуль Юнга, характеристика свойства материала сопротивляться растяжению/сжатию при упругой деформации, в дин/см2); модуль сдвига G (характеристика упругих свойств материала, отражающая способность материала сопротивляться изменению формы при сохранении его объема, в мПа).
Степень агрегации тромбоцитов (в %) в ответ на индукторы - АДФ (одноволновая агрегация, концентрация АДФ = 1 • 10~5 моль/л), коллаген (5 мкг/мл) и ристомицин - оценивали с помощью прибора AJ1AT-2 («Биола», Россия).
Дополнительно регистрировали pH и содержание лак-тата (в ммоль/л); количество тромбоцитов (PLT, х 103/мкл); средний объем тромбоцита (MPV, в фл); ширину распределения тромбоцитов по объему (PDW, в фл), отражающую степень анизоцитоза; коэффициент (содержание) крупных (незрелых) тромбоцитов (Large Platelet Ratio, P-LCR, в %), характеризующихся большей активностью.
Статистический анализ выполняли с помощью программного пакета MedCalc 12.5 («MedCalc Software», Бельгия). Значения показателей в группах по дням были рассчитаны в виде медианы и ее доверительного интервала с надежностью 95% (95% ДИ). Различия между значениями показателей в группах оценивали с помощью статистического теста Манна-Уитни. Гипотеза о сдвиге распределения значений показателя в одной группе относительно другой группы принималась при уровне значимости р < 0,05.
%
Рис. 2. Динамика интенсивности (в %) образования сгустка (угол), максимальной амплитуды тромбоэластограммы (МА) и модуля упругости образующегося сгустка (Е) в тромбоцитом концентрате, заготовленном в 100% донорской плазме.
Вклад тромбоцитов, факторов среды и процессов, определявших свойства сгустка на каждом этапе исследования, изучен с помощью множественного регрессионного анализа (метод Backward; переменные входили в уравнение при условии р < 0,05 и исключались при условии р> 0,1).
Результаты и обсуждение
Динамика агрегационной активности тромбоцитов в ответ на различные индукторы представлена на рис. 1. Как видно, интенсивность реакции высвобождения снижалась уже через 24 ч хранения и становилась наименьшей к 5-м суткам. Аналогичная динамика агрегационного ответа тромбоцитов отмечена на фоне других индукторов агрегации. Полученные данные предполагают замедление процессов секреции тромбоцитарных гранул и синтеза тромбоксана А2, ослабление межтромбоцитар-ного взаимодействия и, по-видимому, потребление имевшегося в плазме фактора Виллебранда. Следует подчеркнуть, что выявленная динамика отмечена на фоне активного течения метаболических реакций в тромбоцитах, в частности гликолиза, о чем свидетельствовало интенсивное накопление лактата.
В день заготовки ТК-П активация тромбоцитов под влиянием АДФ проявилась небольшим снижением интенсивности образования сгустка; парадоксальным, на первый взгляд, ускорением этого процесса через 24 ч; в дальнейшие сроки интенсивность образования сгустка постепенно снижалась, возвращаясь к исходным значениям (рис. 2). Общее каче-
ство сгустка и его упругость ухудшались в процессе хранения, демонстрируя при этом все уменьшающуюся зависимость от присутствия активированных тромбоцитов.
Изучение свойств сгустка, образующегося в ТК-П, показало, что в день заготовки интенсивность процесса была обусловлена влиянием среды (рН и содержание лактата), количеством тромбоцитов (PLT), их средним объемом в целом (MPV), содержанием во всем пуле высокоактивных крупных тромбоцитов (P-LCR), а также процессами межтромбоцитарного взаимодействия, связанными с секрецией тромбоцитарных гранул, синтезом тромбоксана А2 и взаимодействием фактора Виллебранда с тромбоцитарным гликопротеином lb (агрегация в ответ на коллаген и ристомицин) (коэффициент детерминации для уравнения регрессии: i?2adj = 0,907; р = 0,07). Значения модуля упругости и модуля сдвига зависели от ширины распределения тромбоцитов по объему (PDF), содержания во всем пуле высокоактивных крупных тромбоцитов (P-LCR) и активности реакции высвобождения (для обоих уравнений регрессиир < 0,01).
Через 24 ч хранения интенсивность процесса образования сгустка в образцах ТК-П также осталась зависимой от рН, MPV и P-LCR. Еще одним фактором, влияющим на упругие и деформационные свойства сгустка, оказалась коллагениндуцирован-ная агрегация, тогда как их зависимость от содержания фактора Виллебранда исчезла, вероятно, вследствие его потребления (коэффициент детерминации для уравнения регрессии: i?2adj = 0,787; р = 0,004). Для упругих и деформационных свойств сгустка в этот период определяющими стали факторы среды и метаболизма (рН и содержание лактата), секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2 под действием индуктора коллагена (для обоих уравнений регрессиир < 0,05).
В более поздние сроки (3-й и 5-е сутки) хранения образцов ТК-П зависимость процесса образования и свойств сгустка от изученных параметров оказалось слабой (р > 0,1). Данное наблюдение предполагает, что в эти сроки тромбоциты не оказывали существенного влияния на свойства образующегося сгустка или, другими словами, их вклад как функционального участника процессов гемостаза становится минимальным. А саму по себе оценку их вклада можно было бы свести к простому факту их наличия, играющего роль в увеличении контактной поверхности для реакций свертывания крови («гемостатик»). Однако последнее утверждение нельзя считать верным, поскольку, попадая в организм, тромбоциты в целом восстанавливают свою агрегационно-адгезионную и функциональную активность. От того, насколько успешно это происходит, зависит как результат переливания ТК, так и потребность в повторных его трансфузиях. Поэтому полученные результаты и выводы подтверждают
%
60 50 40 30 20 10
«г
>*> N
0?7Ъ
|АДФ
г /
Коллаген
"Г
* / САГЬ
£
Ристомицин
Рис. 3. Динамика агрегационной акгивносш тромбоцитов (в %) в ответ на индукторы на разных сроках хранения тромбоцитно-го концентрата, заготовленного с использованием добавочного раствора.
%
20 15 10 5 Н 0
-5 -
-10
"15 ^
А4
о*? \
пЛ
'Ь <о-/
РгС?
Г
£
| Угол | МА |Е
распространенное известное мнение: чем короче срок хранения ТК, тем выше вероятность успеха его трансфузии, т.е. наступления гемостатическо-го эффекта. Здесь же следует вновь согласиться с мнением В.Б. Хватова [12], считающего необходимым регламентировать переливание клеточных компонентов не только по количеству клеток, но и по параметрам их биологической полноценности и функциональной активности.
В ТК-ДР (тромбоцитном концентрате, заготовленном с использованием добавочного раствора, соотношение 30% донорской плазмы и 70% ДР -1:3) также отмечена высокая метаболическая активность клеток. Агрегационная активность тромбоцитов в ответ на индукторы АДФ, коллаген и ристомицин снижалась с увеличением срока хранения (рис. 3).
Другими словами, в ТК-ДР наблюдалось последовательное уменьшение активности реакций тромбоцитарных гранул и межтромбоцитарного взаимодействия. В целом же, начиная со дня заготовки и до 3-х суток, в ТК-ДР отмечены депрессия процесса образования и ухудшение качества самого сгустка, его упругих и деформационных свойств (рис. 4).
Следует отметить, что в первые 3 сут активация тромбоцитов не повлияла ни на образование, ни на качество собственно сгустка. Начиная с 3-х суток и в более поздние сроки интенсивность образования сгустка, напротив, в присутствии активированных тромбоцитов нарастала. При этом вклад процессов тромбоцитарной агрегации и межклеточного взаимодействия в целом на формирование сгустка становился более явным.
Рис. 4. Динамика интенсивности (в %) образования сгустка (угол), максимальной амплитуды тромбоэластограммы (МА) и модуля упругости образующегося сгустка (Е) в тромбоцитном концентрате, заготовленном с использованием добавочного раствора.
Тем не менее регрессионный анализ не подтвердил существенного вклада в общее качество сгустка ни процессов активации тромбоцитов в присутствии АДФ или ристомицина, ни собственно тромбоцитарных характеристик, ни параметров окружающей среды. Некоторое усиление зависимости отмечено при введении в уравнения регрессии показателей угол, МА, в и Е величин коллагениндуцированной агрегации тромбоцитов. Однако статистически значимого результата этот подход не продемонстрировал (для всех уравненийр > 0,1).
Таким образом, можно утверждать, что процедуры афереза и последующего ресуспендирования тромбоцитов в растворе 88Р+ в целом сопровождались выраженной депрессией агрегационно-адгези-онной и функциональной активности тромбоцитов. Несмотря на это, уже в момент заготовки ТК-ДР закладывались такие свойства, как интенсивность сгусткообразования, общее качество сгустка, его упругость и деформируемость. Последующие изменения параметров сгустка также не были связаны напрямую с агрегационной и адгезионной активностью тромбоцитов, а зависели от иных факторов. Можно предположить, что к последним относятся реакции коагуляционного гемостаза, которые в данной работе не исследовали.
Если это окажется так, то гемостатический эффект переливания ТК, заготовленного с использованием добавочного раствора 88Р+, также будет
связан с тем, насколько успешно произойдет восстановление агрегационно-адгезионной и в целом функциональной активности тромбоцитов после их попадания в организм реципиента. Но при этом гемостатическая функция в значительно меньшей степени будет зависеть как от срока хранения, так и от различных процессов, происходящих при хранении ТК-ДР.
Заключение
Полученные данные в целом подтверждают мнение С.В. Варламовой и др. [13] о хорошем качестве лечебных доз тромбоцитов, заготовленных методами афереза с последующим ресуспендиро-ванием в ДР.
Нежелательно, чтобы срок хранения тК независимо от способа их заготовки превышал 5 сут, что вполне согласуется с мнением N. Tynngard и соавт. [14], также отметивших стабильность числа тромбоцитов, уменьшение спонтанной активации и сохранившуюся способность тромбоцитов образовывать эластичные тромбы после 5 дней хранения в среде с 30% плазмы и 70% добавочного раствора SSP+.
Можно утверждать, что в ТК-П активированные тромбоциты утрачивают свое влияние на свойства образующегося сгустка на 3-и сутки, а в ТК-ДР это влияние отсутствует на протяжении всего периода хранения. Поэтому для ТК, заготовленного на 100% донорской плазме, особенно актуально утверждение о том, что чем короче срок хранения ТК, тем выше вероятность успеха его трансфузии, т.е. наступления гемостатического эффекта.
Однако для успеха переливания обоих типов ТК важно, насколько тромбоциты, попав в организм реципиента, смогут восстановить свою агрегацион-но-адгезионную и в целом функциональную активность. От этого же фактора (восстановления) может, в частности, зависеть и потребность в повторных трансфузиях ТК. Данная работа напоминает о том, что поступающие в организм пациента тромбоциты - это живые клетки, основная роль которых заключается в способности быстро сформировать «пробку», закрывающую место повреждения сосуда. В свою очередь качество сгустка не в последнюю очередь будет зависеть от тех изменений, которые происходят в ТК на разных сроках хранения, и от различных способов его заготовки.
Благодарность
Авторы благодарят А.В. Дубанова - кандидата биол. наук, доцента «кафедры информатики и управления 9» «Теоретическая информатика и компьютерные технологии» ФГБОУ ВПО МГТУ им. Н.Э. Баумана за дружескую помощь и бесценные консультации в подготовке и обработке данных, а также С.А. Плясунову — кандидата мед. наук, заведующую клинической
диагностической лабораторией ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Минздрава России.
Отдельную благодарность авторы выражают ООО «Медицинская Компания» (Россия), оказавшей поддержку при разработке методики модифицированной тромбоэластографии и ее дальнейшей постановки.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]
1. Reid T. J., Snider R., Hartman K., Greilich P.E., Carr M.E., Alv-ing B.M. A method for the quantitative assessment of platelet-induced clot retraction and clot strength in fresh and stored platelets. Vox Sang. 1998; 75(4): 270-7.
2. Slichter S.J. Evidence-based platelet transfusion guidelines. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2007: 172-8.
3. Roeloffzen W.W., Kluin-Nelemans H.C., Mulder A.B., de Wolf J.T. Thrombocytopenia affects plasmatic coagulation as measured by thromboelastography. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2010; 21(5): 389-97.
4. Charania R., Smith J., Vesely S.K., Dale G.L., Holter J. Quantita-tion of coated platelet potential during collection, storage, and transfusion of apheresis platelets. Transfusion. 2011; 51(12): 2690-4.
5. Seghatchian J. Platelet storage lesion: an update on the impact of various leukoreduction processes on the biological response modifiers. Transfus. Apher. Sci. 2006; 34(1): 125-30.
6. Holme S. Storage and quality assessment of platelets. Vox Sang. 1998; 74(2): 207-16.
7. Gulliksson H., Sallander S., Pedajas I., Christenson M., Wiechel B. Storage of platelets in additive solutions: a new method for storage using sodium chloride solution. Transfusion. 1992; 32(5): 435-40.
8. Sandgren P., Mayaudon V., Payrat J.M., Sjodin A., Gulliksson H. Storage of buffy-coat-derived platelets in additive solutions: in vitro effects on platelets stored in reformulated PAS supplied by a 20% plasma carry-over. Vox Sang. 2010; 98(3, Pt 2): 415-22.
9. Seghatchian J., Krailadsiri P. Platelet storage lesion and apopto-sis: are they related? Transfus. Apher. Sci. 2001; 24(1): 103-5.
10. Gulliksson H., Larsson S., Kumlien G., Shanwell A. Storage of platelets in additive solutions: effects of phosphate. Vox Sang. 2000; 78(3): 176-84.
11. De Wildt-Eggen J., Nauta S., Schrijver J.G., van Marwijk Kooy M., Bins M., van Prooijen Н.С. Storage of platelets in additive solutions: effects of magnesium and/or potassium Transfusion. 2002; 42(2): 76-80.
12. Хватов В.Б. К оценке биологической полноценности и функциональной активности клеточных компонентов крови, используемых в клинической практике. Эфферентная и физико-химическая медицина. 2011; 3: 21-5.
[Khvatov V.B. To evaluation of biological usefulness and functional activity of blood cellular components used in clinical practice. Efferentnaya i fiziko-khimicheskaya meditsina. 2011; 3: 21-5]. in Russian
13. Варламова С.В., Петров М.М., Балакина Т.А., Калинин H.H. Морфофункциональная оценка тромбоцитов, полученных на сепараторах клеток крови. Гематология и трансфузиология. 2006; 6: 24-30.
[Varlamova S.V., Petrov M.M., Balakina T.A., Kalinin N.N. Mor-phofunctional assessment of platelets obtained by blood cell separators. Gematologiya i transfuziologiya. 2006; 6: 24-30]. (in Russian)
14. Tynngard N., Trinks M., Berlin G. In vitro properties of platelets stored in three different additive solutions. Transfusion. 2012; 52(5): 1003-9.
Поступила 17.04.14 Received 17.04.14
